曾敏 楊晉青 俞曉琴 陳慧*

（1.浙江五芳齋實業(yè)股份有限公司； 2.上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院）

0 引言

紅棗作為一種具有中國特色的水果,有著很好的營養(yǎng)與藥用價值,一直被開發(fā)和研究。隨著近年來紅棗栽培面積的擴大，其生長過程中病蟲害的發(fā)生率也不斷增加，而且由于其果皮質(zhì)地脆嫩，采收后需經(jīng)貯藏、干燥、晾曬、加工等干制過程，極易感染細菌而引起腐爛變質(zhì)。為了保證紅棗產(chǎn)量，棗農(nóng)會適時噴灑農(nóng)藥。

多菌靈為一類廣譜劑農(nóng)藥，對人、畜均低毒。對許多作物的病害都有一定防治效果,可進行葉面噴灑、播種與土壤處理等,因此也常作為防治紅棗病害的農(nóng)藥。GB 2763—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定：多菌靈在棗(鮮)中的最高殘留限量為0.5 mg/kg、檢測方法標(biāo)準(zhǔn)為GB/T 20769—2008《水果和蔬菜中450種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》和NY/T 1453—2007《蔬菜及水果中多菌靈等16種農(nóng)藥殘留測定 液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》。但是對于干制紅棗卻缺乏具體的質(zhì)量限量規(guī)定和具體的測定辦法,僅認(rèn)為干制水果可以依據(jù)GB/T 20769和NY/T 1453所規(guī)定的辦法檢測。隨著干制紅棗在紅棗產(chǎn)業(yè)中的比重越來越大，農(nóng)藥殘留問題也應(yīng)該引起重視。為了保障紅棗質(zhì)量，最大限度地減少農(nóng)藥殘留對人類生活的影響，亟需開發(fā)高效、準(zhǔn)確的檢測方法。

目前的檢驗技術(shù)手段有氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）、氣相色譜法（GC）、液相色譜法（HPLC）、液質(zhì)聯(lián)用法（HPLC-MS）和紅外光譜法等，前處理技術(shù)大多采用固相萃取技術(shù),但前期處理費時而且操作較復(fù)雜、所產(chǎn)生主要問題重現(xiàn)性差和回收率較低。此外，由于干制紅棗中糖分含量較高，有機溶劑的提取效率和準(zhǔn)確度均較低?！癚uEChERS”算法由于具備快捷、簡便、經(jīng)濟、有效、平穩(wěn)、安全可靠等優(yōu)勢，越來越多地運用于農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留檢測。為有效監(jiān)測干制紅棗中多菌靈的存在狀況,本方法利用了“QuEChERS”的前處理工藝,并結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的監(jiān)測手段,通過比較不同“QuEChERS”凈化包的凈化效率，建立了干制紅棗中多菌靈的殘留檢測方法，為多菌靈在干制紅棗上的殘留檢測提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯化鈉（分析純）；超純水；乙腈（色譜純）；QuEChERS萃取鹽包（含無水硫酸鎂6 g 和乙酸鈉1.5 g）；QuEChERS專用凈化管A（15 mL離心管中裝MgSO1200 mg、乙二胺-N-丙基硅烷400 mg）、QuEChERS專用凈化管B（15 mL離心管中裝MgSO1200 mg、PSA 400 mg、十八烷基鍵合相硅膠 400 mg）、QuEChERS專用凈化管C（15 mL離心管中裝MgSO1200 mg、PSA 400 mg、C18 400 mg，石墨化碳黑45 mg）；Carbon/NH專用固相萃取柱（500 mg，6 mL）。標(biāo)準(zhǔn)品：多菌靈（純度不低于98.0%，100 μg/mL）。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜儀；串聯(lián)質(zhì)譜儀；其他設(shè)備包括渦旋多空共混器；超聲清洗儀；氮吹濃縮儀；離心機；0.22μm有機相濾膜。

1.3 實驗方法

色譜柱：3 μm，2.1 mm×100 mm，柱溫為：35 ℃；建議進樣量：2 μL；流動相：乙腈和0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫的條件見表1。

表1 梯度洗脫表

表2 多菌靈的質(zhì)譜分析參數(shù)

準(zhǔn)確稱取共計約5 g粉碎、混勻的干制紅棗樣品，精確至0.01 g，將其置于塑料離心管（50 mL）中，先加入超純水約10 mL，渦旋混勻，靜置10 min，再準(zhǔn)確量取加入乙腈 20 mL，馬上渦旋、振蕩混勻，超聲處理15 min，在其中加入無水硫酸鎂6 g和 乙酸鈉1.5 g，立即渦旋、振蕩混勻，9 000 r/min離心1 min。準(zhǔn)確移取10 mL上層乙腈相于裝有1200 mg硫酸鎂、400 mg PSA、400 mg C18粉末的離心管中，立即渦旋振蕩2 min，再置于9000 r/min離心1 min后靜置，取上層清液用0.22 μm濾膜過濾于進樣瓶中，上機測定。

多菌靈標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制方法為:量取適量濃度為100 μg/mL多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品，使用乙腈配制1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

多菌靈標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液的配制方法為：精確移取適量的多菌靈標(biāo)準(zhǔn)工作使用液，用乙腈稀釋后成標(biāo)準(zhǔn)濃度為2.5 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、50.0 ng/mL、100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液。

紅棗基質(zhì)工作曲線溶液的配制方法：將空白試樣按樣品處理方式進行處理，以獲得工作凈化液。精確量取適量的多菌靈標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用該工作凈化液稀釋成濃度為2.5 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、50.0 ng/mL、100 ng/mL的紅棗基質(zhì)工作曲線溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器采集條件的確定

本實驗通過ESI源以及MRM模式對多菌靈進行研究。將1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液以流動注入的形式注入離子源，然后采用ESI正離子或負離子的模式開展全掃描，掃描后得知多菌靈在ESI正離子模式下響應(yīng)值更高，于是選擇采用正離子數(shù)字化掃描，以確認(rèn)母離子質(zhì)荷比為 192。同時，通過優(yōu)化檢測條件（如噴霧電壓、霧化壓力、干燥氣壓）及去簇電壓，確保母離子的豐度和穩(wěn)定性最優(yōu)化，獲得最優(yōu)的去簇電壓；在Product模式下，選擇對母離子響應(yīng)最高的子離子2 個分別為定量子離子和定性子離子。接著在MRM采集模式下，分別對子離子的相互碰撞能量加以優(yōu)化，得到各自最優(yōu)的碰撞能量，建立MRM采集方法。圖1為多菌靈MRM定量離子色譜圖。

圖1 多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM定量離子色譜圖

采用2.1 mm×100 mm, 3 μm色譜柱，分別對比了水和乙腈，含甲酸水溶液（0.1%）/乙腈和含甲酸水溶液（0.1%）+5 mmol/L乙酸銨溶液/乙腈為流動相時的色譜的分離情況特點。含甲酸（0.1%）的流動相離子化分離時效果好，且靈敏度較高。在流動相中添加入乙酸銨溶液則可以優(yōu)化色譜峰形，但靈敏度也會下降；另外，因為進樣體積比較小，在流動相中如不加入乙酸銨溶液，多菌靈的色譜峰形和保留時間都較為理想。因此，選取了乙腈和含甲酸水溶液（0.1%）的流動相，在1.3.1色譜條件下，進行了梯度洗脫實驗。在柱溫（35 ℃）和流速（0.3 mL/min）條件下，進樣量為2 μL時，可獲得干制紅棗樣品基質(zhì)中多菌靈檢測結(jié)果的穩(wěn)定和優(yōu)異的分離效果。

2.2 樣品前處理條件的確定

本實驗比較了干制紅棗加水浸潤與否對提取效率的影響。稱取樣品后，根據(jù)樣品自身含水量的多少，在加入提取溶劑之前首先加入10 mL純水以充分浸潤樣品。浸潤10 min，渦旋1 min后，再加入提取溶劑進行提取實驗，結(jié)果見圖2。實驗結(jié)果表明，充分浸潤樣品后，目標(biāo)物的提取效率明顯增加。由于樣品含糖量較高，若不經(jīng)過加水充分浸潤，直接加入提取溶劑容易造成樣品結(jié)團，導(dǎo)致目標(biāo)物難以被充分提取出來，導(dǎo)致提取效率很低。

圖2 加水浸潤樣品對提取效率的影響

本實驗以乙腈和1%乙酸乙腈溶液作為萃取試劑后開展對比試驗，對待測樣品中多菌靈的加標(biāo)萃取效果，結(jié)果見圖3。圖3表明，乙腈和乙酸乙腈（1%）溶液作為萃取試劑后的平均回收率分別為95.1%、74.4%，因此，乙腈的萃取效率相對較好。因多菌靈其本身為一種兩性物質(zhì)，其水解度受pH值波動的影響很大。在酸性環(huán)境下，多菌靈易溶于水，多菌靈在中性和偏堿性水溶液中其水溶性變化較小，多菌靈更容易被化學(xué)有機溶劑萃取。故確定乙腈作為萃取試劑。

圖3 不同萃取試劑的回收率

本實驗比較了超聲輔助提取時間對多菌靈回收率的影響。選擇的基質(zhì)為干制紅棗等空白樣品，多菌靈的加標(biāo)濃度為10 μg/kg。考察在5 min、10 min、15 min、20 min等各種超聲的時間下，多菌靈的回收率，結(jié)果見圖4。圖4表明，超聲提取10 min時多菌靈回收率達最高，隨著超聲持續(xù)時間的繼續(xù)增加，多菌靈回收率呈現(xiàn)明顯下降趨勢，究其原因可能由于雜質(zhì)成分被萃取出來使得多菌靈核心目標(biāo)物的離子化效率減低，導(dǎo)致總回收率有所降低?；谝陨锨闆r，本試驗采用超聲輔助處理10 min。

圖4 不同超聲提取時間的回收率

本實驗對比了QuEChERS不同類型的凈化包對多菌靈回收率的效果。取含有濃度為10 ng/mL多菌靈的干制紅棗工作曲線溶液，對含有不同類型凈化劑的3個QuEChERS凈化包和1個固相萃取柱（具體成分見1.1）進行處理效果凈化比較，處理后的平均回收率結(jié)果見表3。實驗結(jié)果顯示，在各種凈化方式中，多菌靈的回收率分別為88.6%、96.7%、67.3%和62.4%。凈化包B的最終回收率最高；但凈化包A、凈化包C和萃取柱D的最終回收率相對較低。主要是因為凈化包A中不含有C18吸附劑，因此去雜效果并不理想，對基質(zhì)干擾過多而產(chǎn)生的回收率也較低；而凈化包C中含有石墨化炭黑，因此可以對具有平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥產(chǎn)生很大的吸收效果，在去除雜質(zhì)的同時對多菌靈也產(chǎn)生了不同程度的吸附，使得回收率較低；而萃取柱D的操作則較為繁瑣，去除紅棗中所含的極性有機酸、大量糖類等元素的作用并不明顯，同時也會受洗脫次數(shù)的影響使得回收率也較低；最后，通過移取10 mL提取液到含有1200 mg MgSO、400 mg PSA、400 mg C18粉末的凈化包B來凈化并除去提取液中的雜質(zhì)組分，進而達到了對干棗樣品的凈化除雜并降低基質(zhì)干擾的效果。

表3 經(jīng)不同種類凈化方式處理后的回收率

2.3 線性范圍和基質(zhì)效應(yīng)

本實驗采用標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在1.3規(guī)定的試驗條件下開展測定，以多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制多菌靈的工作標(biāo)準(zhǔn)曲線，按公式 （1） 計算基質(zhì)效應(yīng)（ME），多菌靈溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液和紅棗基質(zhì)工作曲線溶液（1.3.4）的線性方程見表4。在2.5 ng/mL～100 ng/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.995。同時具有良好的基質(zhì)抑制效應(yīng)。

表4 多菌靈的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限及定量限

式中，和分別表示基質(zhì)工作曲線溶液和標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液的斜率。當(dāng)ME＞0時，說明為基質(zhì)增強效應(yīng)；ME＜0，說明為基質(zhì)抑制效應(yīng)。

2.4 方法的檢出限和定量限

在空白樣品基質(zhì)內(nèi)添加相應(yīng)含量的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在2.3的試驗條件下進行測試，按信噪比等于3計算該方法檢出限，按信噪比等于10計算該方法定量限，結(jié)果見表4。多菌靈在干制紅棗基質(zhì)中的檢出限為5.0 μg/kg，定量限為10.0 μg/kg。

2.5 方法的回收率和精密度

在不含多菌靈的陰性干制紅棗樣本中添加3個標(biāo)準(zhǔn)水平（10.0 μg/kg、20.0 μg/kg 和 100 μg/kg）的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，靜置30 min，按以上樣品處理方式進行檢測，每個加入水平重復(fù)測定6 次，計算多菌靈標(biāo)準(zhǔn)工作溶液加入后其回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）（=6），測定結(jié)果見表5。表5表明，多菌靈在干制紅棗中平均回收率為86.9%～109.1%，RSD為3.01%～7.27%，以上說明該檢測技術(shù)的回收率良好、重復(fù)性較好。

表5 多菌靈在3個添加水平下的平均回收率及其RSD值（n=6）

2.6 實際樣品檢測結(jié)果

采用本試驗所建立的方法對10批次干制紅棗樣品進行多菌靈的檢測，其中有2個樣品檢出多菌靈殘留，含量分別為 28.4 μg/kg 和 41.1 μg/kg。

3 結(jié)語

本研究利用QuEChERS-LC-MS/MS檢測技術(shù)，在優(yōu)化樣品前處理和儀器采集條件的基礎(chǔ)上，建立了一種高效準(zhǔn)確、靈敏度高和重現(xiàn)性好的測定干制紅棗中多菌靈殘留量的檢測方法。用乙腈超聲輔助提取干棗樣本中的多菌靈，經(jīng)QuEChERS包凈化，凈化液采用0.22 μm濾膜過濾，使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC-MS/MS）檢測。選用Waters Atlantis T3 C18(3 μm，2.1 mm×100 mm) 色譜柱進行分離處理，電噴霧離子化、正離子掃描及動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式檢驗，最終通過基質(zhì)工作曲線外標(biāo)法進行定量。多菌靈在2.5 ng/mL～100 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.9965。3個多菌靈添加水平的平均回收率為86.9%～109.1%，RSD為3.01%～7.27%，定量限為10.0 μg/kg。該方法能夠很好解決實際干制紅棗產(chǎn)品對多菌靈殘留量的檢測需求。