潛霞飛

（杭州市第一人民醫(yī)院城北院區(qū)，杭州 310000）

隨著新穎光子技術(shù)（包括吸收、散射、熒光和拉曼光譜，漫射光、光層析、熒光和光聲成像，以及各種顯微鏡等）的蓬勃發(fā)展，光學(xué)在生命科學(xué)中的應(yīng)用開始進(jìn)入一個(gè)嶄新的時(shí)代。由于其對(duì)組織光學(xué)參數(shù)的檢測(cè)成像在臨床發(fā)現(xiàn)病變組織、定位病灶區(qū)域、形成疾病診斷、跟蹤疾病進(jìn)程和評(píng)估治療效果等都具有重要價(jià)值，正獲得生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中日益廣泛的應(yīng)用[1-2]。生物組織可看成是一種光學(xué)渾濁介質(zhì)，生物體的許多生理特性變化如血糖、血氧和肌氧含量等或動(dòng)脈硬化、癌變等組織特性的變化都會(huì)導(dǎo)致生物組織的光學(xué)特性參數(shù)的改變。因此，如何準(zhǔn)確探測(cè)組織光學(xué)特性參數(shù)是醫(yī)學(xué)光子學(xué)應(yīng)用于臨床診斷與治療的重要前提，也是精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展趨勢(shì)之一。

漫射光成像技術(shù)利用光散射獲取組織的結(jié)構(gòu)信息，目前其中最具潛力的是空間頻域成像（Spatial Freq uency Domain Imaging，SFDI）。SFDI 是一種全新的無損、非接觸、大視場(chǎng)定量成像技術(shù)，具有通過空間調(diào)制頻率控制探測(cè)深度及同時(shí)解析出渾濁介質(zhì)（如生物組織）的光學(xué)散射與吸收特性的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[3-6]。通過測(cè)量不同空間頻率的調(diào)制入射光在樣品表面的反射，獲得樣品的調(diào)制傳遞函數(shù)，并反演得到其空間分辨的包括吸收系數(shù)（μa）和約化散射系數(shù)（μs′）的光學(xué)特性。從多波長(zhǎng)SFDI 測(cè)得的吸收系數(shù)進(jìn)而可得到血氧含量及飽和度等信息。反映組織結(jié)構(gòu)變化的約化散射系數(shù)（μs）′的量化是SFDI 區(qū)別于其他光學(xué)成像法如超光譜技術(shù)的一個(gè)亮點(diǎn)[7-8]。SFDI 在物理上消除了不同對(duì)比機(jī)制引起的反射率變化中的串?dāng)_，通過分離和量化多光譜吸收和散射性質(zhì)，推導(dǎo)生理相關(guān)參數(shù)以評(píng)估組織狀態(tài)。具體而言，SFDI 可以在空間上解析局部組織水平的氧飽和度（StO2），血容量（THb）和水分（H2O）等發(fā)色團(tuán)的含量。由于組織特定的光學(xué)特性，反射后的空間調(diào)制圖案發(fā)生衰減。這些空間調(diào)制圖案被解調(diào)并計(jì)算組織調(diào)制傳遞函數(shù)（Modulation Transfer Function，MTF），并用擴(kuò)散光模型分析MTF 以確定漫反射率R 和相應(yīng)的組織光學(xué)性質(zhì)（吸收系數(shù)和散射系數(shù)）?；赟FDI 提出的單次多頻快照解調(diào)法（Single Snapshot Multiple-frequency，SSMD）,更好地解決傳統(tǒng)三相移處理SFDI 的局限。

1 空間頻域成像的系統(tǒng)構(gòu)成

基于空間頻域成像技術(shù)的原理搭建空間頻域成像系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)裝置如圖1、圖2 所示，該系統(tǒng)裝置共3 個(gè)部分，分別是成像光源（Digital Micromirror Device，DMD）、成像光路和圖像采集器（Charge-coupled Device，CCD）。其中圖1 為空間頻域成像系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖、圖2 為空間頻域成像實(shí)物圖。采集過程：DMD 發(fā)出的結(jié)構(gòu)光經(jīng)過透鏡后變成平行光，入射到分光鏡后，部分光源反射到樣品上，經(jīng)過樣品的吸收和散射后，反射光經(jīng)過透鏡聚焦后，由CCD 接收。

圖1 空間頻域成像系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖

圖2 空間頻域成像系統(tǒng)結(jié)構(gòu)實(shí)物圖

平臺(tái)選用TI 公司生產(chǎn)的高性能數(shù)字微鏡DLP LightCrafter 4500 作為投影光源；FLIR Grasshopper3系列的GS3-U3-51S5C 產(chǎn)品作為圖像采集器。為了獲取穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，關(guān)閉了CCD 所有的自動(dòng)調(diào)節(jié)功能，如：自動(dòng)白平衡、自動(dòng)曝光等設(shè)置，手動(dòng)設(shè)置并鎖定參數(shù)。通過數(shù)據(jù)接口與DMD 連接以實(shí)現(xiàn)同步，并控制探測(cè)器采集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 SFDI 光學(xué)系統(tǒng)校正

由于數(shù)字微鏡DMD 投影的混合光的空間調(diào)制圖案存在如下問題：①光強(qiáng)空間分布不均勻；②光強(qiáng)的強(qiáng)度響應(yīng)非線性；③CCD 探測(cè)器采集漫反射光圖像存在通道污染。以上問題，始終影響正常的MTF 數(shù)值的獲得，對(duì)于光學(xué)參數(shù)和生理參數(shù)的獲取帶來了困難，因此我們分別對(duì)SFDI 光路系統(tǒng)的光強(qiáng)空間分布強(qiáng)度曲線和通道污染進(jìn)行校正。

2.1 光強(qiáng)空間分布和光強(qiáng)強(qiáng)度曲線校正

將SFDI 光路系統(tǒng)認(rèn)為一個(gè)黑箱系統(tǒng)，DMD 投影的圖案為輸入信號(hào)，CCD 采集的圖案為輸出信號(hào)，通過DMD 投影不同的圖案，便可以建立DMD 投影的圖案與CCD 采集圖案的空間關(guān)系和光強(qiáng)關(guān)系。

首先，DMD 投影點(diǎn)陣圖（每格點(diǎn)間隔5 個(gè)像素，每格點(diǎn)由9 個(gè)像素組成）于朗博體，CCD 采集點(diǎn)陣圖，這樣便可以建立DMD 圖像像素坐標(biāo)與CCD 圖像像素坐標(biāo)之間的關(guān)系。

其次，DMD 投影光強(qiáng)強(qiáng)度分別為1～256（分別單獨(dú)投影紅、綠、藍(lán)3 個(gè)光源）的平面圖于朗博體上，CCD 采集不同光強(qiáng)強(qiáng)度的圖像，便可建立DMD 光強(qiáng)與CCD光強(qiáng)之間的關(guān)系。

最后，結(jié)合以上2 點(diǎn)便可以得到DMD 與CCD 各點(diǎn)的光強(qiáng)空間分布和各點(diǎn)光強(qiáng)曲線關(guān)系。

為使CCD 采集到的圖像空間分布均勻，光強(qiáng)變化線性，可以通過上面建立的2 個(gè)關(guān)系（圖3），通過MATLAB 中的interpl2 函數(shù)可以快速地反演出DMD需要投影的圖像。

圖3 光強(qiáng)空間分布和光強(qiáng)強(qiáng)度校正邏輯關(guān)系圖

基于以上想法，對(duì)SFDI 進(jìn)光強(qiáng)空間分布和光強(qiáng)強(qiáng)度校正。光強(qiáng)強(qiáng)度校正的效果如圖4 所示，系統(tǒng)校正之前DMD 與CCD 之前光強(qiáng)響應(yīng)曲線呈現(xiàn)非線性，經(jīng)過在一小塊區(qū)域內(nèi)（15×15 像素大小）進(jìn)行線性平均，使其能夠呈現(xiàn)出線性響應(yīng)。

圖4 校正前后DMD 光強(qiáng)響應(yīng)曲線對(duì)比

光強(qiáng)空間校正的結(jié)果如圖5 所示，圖5（a），圖5（b）為未校正的DMD 投影平面光圖像和CCD 采集到的圖像（為了便于對(duì)比校正效果，CCD 采集的圖像都減去整體平均），經(jīng)過以上校正方法校正后，DMD 投影圖5（c），CCD 采集得到圖5（d）的結(jié)果。顯然，校正后的圖像，不僅整體光強(qiáng)幅度變化變小，整體也變得更加平均。

圖5 光強(qiáng)空間校正圖

為了驗(yàn)證校正的效果，分別查看了校正前后由CCD 拍出的圖像，在x 和y 2 個(gè)方向上分別有哪些變化。由圖6 和圖7 可以明顯地看出，在校正前，圖像呈現(xiàn)出在x 方向上中間亮、兩頭暗，y 方向上亮度逐漸減小的效果；而經(jīng)過校正以后，圖像則呈現(xiàn)出在x 及y方向上都比較均勻的效果并且拉高了整體光強(qiáng)，無論是平面光還是條紋圖。經(jīng)計(jì)算，其誤差（有效區(qū)域內(nèi)的光強(qiáng)分布）在2%～4%左右，可見校正有效。

圖6 校正前后CCD 采集到的平面光在x 和y2 個(gè)方向上的對(duì)比

圖7 校正前后CCD 采集到的條紋光在x 和y2 個(gè)方向上的對(duì)比

2.2 CCD 通道污染校正

CCD 通道污染問題產(chǎn)生的原因：CCD 在響應(yīng)特定波段的光強(qiáng)時(shí)，同時(shí)還響應(yīng)了其他波段的光強(qiáng)。比如CCD紅通道對(duì)625 nm 附近波段較為敏感，而對(duì)其他波段也有響應(yīng)，因此，DMD 投影混色光時(shí)，紅通道不僅得到了623 nm 波段的信息，還受到其他波段的污染，因此在使用混合光（多波段）作為光源時(shí)必須考慮通道污染問題。

首先，我們建立在單色光源下，CCD 采集到3 個(gè)單色光下的光強(qiáng)信息：紅色單色光（r1，g1，b1），綠色單色光（r2，g2，b2）和藍(lán)色單色光（r3，g3，b3），因此，CCD 的相機(jī)響應(yīng)矩陣可以寫為

當(dāng)投影混合光時(shí)，CCD 采集混合光強(qiáng)（Rmix，Gmix，Bmix），顯示此混合光強(qiáng)的Rmix，Gmix，Bmix并不是純凈的，其每個(gè)獨(dú)立的光強(qiáng)都是受到其他波段的污染，與真實(shí)漫反射光強(qiáng)（Rraw，Graw，Braw）之間的關(guān)系為

因此，通過式（2）可以得到真實(shí)反射光強(qiáng)

此校正對(duì)獲取調(diào)制傳遞函數(shù)的準(zhǔn)確度量至關(guān)重要，我們使用此法以標(biāo)準(zhǔn)生物組織樣本為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行驗(yàn)證得到表1 數(shù)據(jù)。

表1 混合光校正后與單色光對(duì)比結(jié)果

可以看出，經(jīng)過CCD 通道污染校正后，混合光與單色光的MTF 值已經(jīng)非常接近，可以說明，此校正很成功。

3 結(jié)束語(yǔ)

光子方法對(duì)生物組織的檢測(cè)診斷依賴于對(duì)包括微觀結(jié)構(gòu)、物理性質(zhì)和局部微循環(huán)等的定量成像。利用光與介質(zhì)的相互作用全面解析組織性狀是其發(fā)現(xiàn)病變組織、準(zhǔn)確疾病診斷、客觀跟蹤疾病進(jìn)程和評(píng)估治療效果等的基礎(chǔ)?；诳臻g頻域成像技術(shù)提取光學(xué)、生理參數(shù)具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。其光學(xué)系統(tǒng)是否能夠有效工作是基礎(chǔ)也是關(guān)鍵，從校正結(jié)果來看，SFDI 系統(tǒng)經(jīng)過校正后，其線性度、均勻度都得到了很大改善。通過非侵入式檢測(cè)組織的光學(xué)參數(shù)分布圖像，發(fā)展一種可降低病患痛苦、提高檢測(cè)效率和準(zhǔn)確率、節(jié)約各項(xiàng)成本的疾病檢測(cè)方法，具有重大的科學(xué)和社會(huì)意義。