馮 勉，尚明玉，畢亞珍，胡文萍，張 莉

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

烏珠穆沁羊和湖羊是中國(guó)重要的地方綿羊品種，其中烏珠穆沁羊具有產(chǎn)肉性能好、生長(zhǎng)速度快、耐粗飼和抗病力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在中國(guó)內(nèi)蒙古地區(qū)被大量飼養(yǎng)[1-2]。湖羊具有性成熟早、繁殖力高、發(fā)育速度快和適應(yīng)力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)逐漸被全國(guó)很多地方引入[3-5]。分子標(biāo)記技術(shù)因具有更豐富的信息量、更高的準(zhǔn)確性已經(jīng)在畜禽種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、候選功能基因定位、疾病診斷與治療和分子輔助育種等方面被廣泛應(yīng)用[6-8]。

巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶8(fucosyltransferase 8，F(xiàn)UT8)基因是巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶家族成員之一，位于綿羊7號(hào)常染色體上，在哺乳動(dòng)物組織中普遍存在，并對(duì)正常的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的作用[9-11]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UT8是唯一能夠負(fù)責(zé)產(chǎn)生核心聚焦結(jié)構(gòu)的酶，在核心巖藻糖基化過(guò)程中，僅FUT8能夠催化N-聚糖完成糖基化[12]。Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，敲除FUT8基因會(huì)影響小鼠的正常生長(zhǎng)，導(dǎo)致小鼠發(fā)育遲緩甚至死亡，其致病機(jī)理與TGF-β信號(hào)通路密切相關(guān)。李明等[13]研究證實(shí)，敲除FUT8基因不僅影響小鼠的正常發(fā)育，而且影響小鼠腸道微生物的組成。Seth等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚(yú)FUT8基因敲低模型中，F(xiàn)UT8基因表達(dá)量降低會(huì)導(dǎo)致斑馬魚(yú)輕度獨(dú)眼、小前腦和U形體節(jié)缺陷。Yoshida等[15]對(duì)1 309條尼羅羅非魚(yú)8個(gè)表型性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，F(xiàn)UT8基因的1個(gè)突變位點(diǎn)與總增重及日增重均具有顯著相關(guān)性。在人的肝癌研究中，降低FUT8基因的表達(dá)可以降低肝癌細(xì)胞的活性并減弱細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力[16]。目前，F(xiàn)UT8基因在畜禽研究中報(bào)道較少，僅在俾路支羊中發(fā)現(xiàn)FUT8基因的1個(gè)SNP與日增重顯著相關(guān)[17]。因此，開(kāi)展綿羊FUT8基因多態(tài)性與生長(zhǎng)發(fā)育表型相關(guān)性的研究具有重要的意義。

本研究以烏珠穆沁羊和湖羊?yàn)檠芯繉?duì)象，通過(guò)檢索數(shù)據(jù)庫(kù)和查閱文獻(xiàn)[18]，選擇與體重、體尺性狀相關(guān)聯(lián)的FUT8基因g.74522417 C>T位點(diǎn)，采用飛行時(shí)間質(zhì)譜及基因芯片2種方法對(duì)FUT8基因g.74522417 C>T位點(diǎn)進(jìn)行基因型檢測(cè)，并將基因型與2個(gè)品種綿羊生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以期為豐富綿羊分子標(biāo)記資源、改良綿羊生長(zhǎng)發(fā)育性狀提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)群體和表型數(shù)據(jù)

307只烏珠穆沁羊來(lái)自?xún)?nèi)蒙古東烏珠穆沁旗原種羊場(chǎng)和正藍(lán)旗羊場(chǎng)，993只湖羊來(lái)自甘肅中盛華美羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司。試驗(yàn)羊健康水平良好且體況相近，采用統(tǒng)一的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)、營(yíng)養(yǎng)水平和管理規(guī)范。頸靜脈采集血樣并裝于含有抗凝劑的離心管中，―20 ℃保存?zhèn)溆?。使用血液基因組DNA提取試劑盒(Omega公司)提取綿羊血液基因組DNA，―80 ℃保存?zhèn)溆谩ＩL(zhǎng)性狀測(cè)定指標(biāo)包括：烏珠穆沁羊4月齡體重和體尺(體高、體長(zhǎng)、胸圍、管?chē)?，6月齡體重和體尺(體高、體長(zhǎng)、胸圍、管?chē)⑿貙?、胸?；湖羊初生重、斷奶重、2月齡重，3、4月齡的體重和體尺(體高、體長(zhǎng)、胸圍、管?chē)?、胸寬、胸深、腰角寬、十字部?，5、6月齡的體重和體尺(體高、體長(zhǎng)、胸圍、管?chē)⑿貙?、胸深、腰角寬、十字部?以及背膘厚度、眼肌面積。所有性狀指標(biāo)均按照《肉羊生產(chǎn)性能測(cè)定技術(shù)規(guī)范》(T/CAAA080—2022)的規(guī)定執(zhí)行，并對(duì)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行校正，校正后均呈正態(tài)分布。

1.2 位點(diǎn)信息及引物合成

通過(guò)查詢(xún)數(shù)據(jù)庫(kù)確定FUT8基因存在于綿羊的7號(hào)染色體，g.74522417 C>T位點(diǎn)所在位置為FUT8基因的內(nèi)含子區(qū)域。根據(jù)突變位點(diǎn)的物理位置信息，采用Assay Design 3.1軟件設(shè)計(jì)合適的引物，其中上游引物：5′-ACGTTGGATGCATGT-AGCTCAGAAACACAG-3′；下游引物：5′-ACGT-TGGATGTTGGTCTAGGAAAGAAAAG-3′。引物由SEQUENOM公司合成。

1.3 基因分型

采用Illumina OvineSNP 600K BeadChip及Illumina OvineSNP 50K BeadChip芯片分別對(duì)烏珠穆沁羊和湖羊2個(gè)群體FUT8基因g.74522417 C>T突變位點(diǎn)進(jìn)行基因型檢測(cè)，利用Plink 1.90對(duì)2個(gè)品種綿羊芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制。采用Sequenom MassARRAY?SNP技術(shù)對(duì)烏珠穆沁羊FUT8基因g.74522417 C>T突變位點(diǎn)進(jìn)行基因型檢測(cè)，分型所用的DNA樣本均經(jīng)檢測(cè)合格之后方可使用。具體步驟包括：利用設(shè)計(jì)合成的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物磷酸化處理；單堿基延伸；延伸產(chǎn)物純化；純化產(chǎn)物點(diǎn)樣至芯片上；飛行時(shí)間質(zhì)譜；提取原始數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用Excle 2016計(jì)算FUT8基因g.74522417 C>T位點(diǎn)的基因頻率、基因型頻率、純合度(homozygosity,Ho)、雜合度(heterozygosity,He)和有效等位基因數(shù)(effectively allele number,Ne)。通過(guò)χ2檢驗(yàn)檢測(cè)突變位點(diǎn)在群體中的哈代-溫伯格平衡狀態(tài)，其中P>0.05表示該位點(diǎn)處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)。通過(guò)多態(tài)信息含量(polymorphic information content,PIC)檢測(cè)基因變異程度，其中PIC<0.25表示低度多態(tài)；0.250.50表示高度多態(tài)，基因多態(tài)性越高變異程度越大[19]。利用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件中的單因素方差分析對(duì)基因型和表型性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，利用鄧肯氏法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著[20-21]。

2 結(jié) 果

2.1 FUT8基因g.74522417 C>T位點(diǎn)分型及多態(tài)性

在烏珠穆沁羊群體中，F(xiàn)UT8基因g.74522417 C>T位點(diǎn)通過(guò)綿羊600K芯片和飛行時(shí)間質(zhì)譜分型的結(jié)果相同，均檢測(cè)到3種基因型：CC、TC和TT，其中TC型為優(yōu)勢(shì)基因型；多態(tài)信息含量為0.37，屬于中度多態(tài)；純合度、雜合度及有效等位基因數(shù)分別為0.50、0.50和2.00(表1)。χ2檢驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)UT8基因g.74522417 C>T位點(diǎn)在烏珠穆沁羊群體中處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)(P>0.05)。

在湖羊群體中，F(xiàn)UT8基因g.74522417 C>T位點(diǎn)通過(guò)綿羊50K芯片也檢測(cè)到3種基因型：CC、TC和TT，其中TC為優(yōu)勢(shì)基因型；多態(tài)信息含量為0.37，屬于中度多態(tài)；純合度、雜合度及有效等位基因數(shù)分別為0.50、0.50和1.98(表1)。χ2檢驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)UT8基因g.74522417 C>T位點(diǎn)在湖羊群體中處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)(P>0.05)。

2.2 FUT8基因g.74522417 C>T位點(diǎn)與烏珠穆沁羊不同發(fā)育時(shí)期生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

由表2可知，4月齡烏珠穆沁羊FUT8基因g.74522417 C>T位點(diǎn)TC基因型個(gè)體體長(zhǎng)顯著大于CC基因型(P<0.05)，6月齡TC基因型個(gè)體體高顯著大于TT基因型(P<0.05)，其他生長(zhǎng)性狀在不同基因型個(gè)體之間均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.3 FUT8基因g.74522417 C>T位點(diǎn)與湖羊不同發(fā)育時(shí)期生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

由表3、4可知，各時(shí)間點(diǎn)湖羊FUT8基因g.74522417 C>T位點(diǎn)不同基因型個(gè)體間體重差異均不顯著(P>0.05)；3月齡湖羊TC和CC基因型個(gè)體管?chē)@著大于TT基因型(P<0.05)；5月齡湖羊CC基因型個(gè)體管?chē)脱菍捑@著大于TT基因型(P<0.05)；6月齡湖羊CC基因型個(gè)體的管?chē)鷺O顯著大于TT基因型(P<0.01)，其他體尺性狀不同基因型個(gè)體之間差異均不顯著(P>0.05)。由表5可知，6月齡湖羊FUT8基因g.74522417 C>T位點(diǎn)CC基因型個(gè)體眼肌面積顯著大于TT基因型(P<0.05)，5、6月齡背膘厚度和5月齡眼肌面積不同基因型個(gè)體之間差異均不顯著(P>0.05)。

表5 FUT8基因g.74522417 C>T位點(diǎn)與5、6月齡湖羊眼肌面積和背膘厚的關(guān)聯(lián)分析Table 5 The association analysis of FUT8 gene g.74522417 C>T with eye muscle area and backfat thickness in Hu sheep at 5 and 6 months of age

3 討 論

近年來(lái)，隨著人民生活水平的不斷提高，羊肉需求量也日益增加。中國(guó)雖是養(yǎng)羊和羊肉消費(fèi)大國(guó)，存欄量、出欄量和羊肉產(chǎn)量均居世界第一位，但單產(chǎn)水平較低，自給能力不足，綿羊胴體重與畜牧業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家相比仍然存在較大差距[22-24]。隨著生物信息學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，畜禽動(dòng)物遺傳育種技術(shù)也取得了相當(dāng)?shù)倪M(jìn)步，利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)來(lái)優(yōu)化經(jīng)濟(jì)性狀指標(biāo)和培育高產(chǎn)優(yōu)良品種已逐漸成為重要的育種手段。因此，挖掘和篩選綿羊生長(zhǎng)性狀的關(guān)鍵候選基因和標(biāo)記位點(diǎn)有助于加快其分子選育進(jìn)程，加速優(yōu)質(zhì)種羊培育，提高養(yǎng)殖者的經(jīng)濟(jì)效益。

FUT8基因在哺乳動(dòng)物組織中廣泛表達(dá)，是翻譯后N-糖基化修飾過(guò)程中的關(guān)鍵酶，這種翻譯后修飾可快速改變蛋白質(zhì)的生物學(xué)性質(zhì)。FUT8能夠與多種蛋白質(zhì)及受體相互作用，廣泛參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的多種代謝及信息傳遞途徑，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化具有顯著影響[25]。目前，F(xiàn)UT8基因的研究主要集中在小鼠和人上，與機(jī)體正常器官和骨骼肌發(fā)育密切相關(guān)[13-14]。為了深入探索FUT8基因與綿羊生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性，本研究通過(guò)基因分型檢測(cè)了FUT8基因g.74634571 C>T位點(diǎn)在湖羊和烏珠穆沁羊2個(gè)群體中的多態(tài)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UT8基因g.74522417 C>T位點(diǎn)在2個(gè)綿羊群體中均處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)，說(shuō)明FUT8基因g.74522417 C>T位點(diǎn)在長(zhǎng)期的選擇和進(jìn)化過(guò)程中具有較強(qiáng)的遺傳穩(wěn)定性，受到較少的人工選擇，未發(fā)生遺傳漂變。FUT8基因g.74522417 C>T位點(diǎn)在湖羊和烏珠穆沁羊中的有效等位基因數(shù)約為2，說(shuō)明該位點(diǎn)在湖羊和烏珠穆沁羊群體中均勻分布。純合度和雜合度均為0.50，表明在這2個(gè)綿羊群體中遺傳豐富度較高。FUT8基因g.74522417 C>T位點(diǎn)在烏珠穆沁羊和湖羊群體中均處于中度多態(tài)，說(shuō)明該位點(diǎn)在這2個(gè)綿羊群體中的變異可能性較大，作為選擇位點(diǎn)的潛力較大。

研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UT8基因與雞體內(nèi)脂肪沉積顯著相關(guān)[25]；FUT8基因g.74634571位點(diǎn)與0～6月齡俾路支羊日增重顯著關(guān)聯(lián)[17]。本研究結(jié)果表明，在烏珠穆沁羊群體中，F(xiàn)UT8基因g.74522417 C>T位點(diǎn)TC基因型個(gè)體4月齡體長(zhǎng)顯著大于CC基因型，6月齡個(gè)體體高顯著大于TT基因型；在湖羊群體中，F(xiàn)UT8基因g.74522417 C>T位點(diǎn)TC和CC基因型個(gè)體3月齡管?chē)@著大于TT基因型個(gè)體，CC基因型個(gè)體5月齡管?chē)⒀菍捈?月齡管?chē)?、眼肌面積均顯著或極顯著大于TT基因型。盡管FUT8基因g.74522417 C>T位點(diǎn)與湖羊和烏珠穆沁羊體重的相關(guān)性并不顯著，但本研究發(fā)現(xiàn)，TC基因型烏珠穆沁羊個(gè)體體尺更具優(yōu)勢(shì)，TC和CC基因型湖羊個(gè)體體尺更具優(yōu)勢(shì)，F(xiàn)UT8基因g.74522417 C>T位點(diǎn)在不同程度上與烏珠穆沁羊和湖羊的生長(zhǎng)發(fā)育性狀顯著關(guān)聯(lián)。因此，F(xiàn)UT8基因g.74522417 C>T位點(diǎn)可作為影響烏珠穆沁羊、湖羊生長(zhǎng)發(fā)育性狀的候選分子標(biāo)記。

4 結(jié) 論

FUT8基因g.74522417 C>T位點(diǎn)與烏珠穆沁羊4月齡體長(zhǎng)、6月齡體高均呈顯著關(guān)聯(lián)，與湖羊3月齡胸圍、5月齡管?chē)脱菍挕?月齡管?chē)脱奂∶娣e均呈顯著或極顯著關(guān)聯(lián)。該位點(diǎn)可能是影響綿羊生長(zhǎng)性狀的潛在分子標(biāo)記，在綿羊分子選育中具有一定的指導(dǎo)意義。