趙金波，譚 磊，潘洪彬，黃 暢，劉 永，王光正，豆騰飛，王 坤，李子健，葛長榮

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，齊齊哈爾 161005)

中國地方畜禽品種資源豐富，畜禽遺傳多樣性的可持續(xù)利用是打好種業(yè)翻身仗，解決產(chǎn)業(yè)“卡脖子”核心技術(shù)的最主要育種素材，也是保障食物充足供應(yīng)的先決條件。《全國畜禽遺傳改良計(jì)劃(2021—2035年)》遠(yuǎn)景規(guī)劃著重指出“力爭(zhēng)用10～15年的時(shí)間，建成比較完善的商業(yè)化育種體系，顯著提升畜禽生產(chǎn)水平和品質(zhì)水平，自主培育一批具有國際競(jìng)爭(zhēng)力的突破性品種，確保國內(nèi)畜禽品種核心種源自主可控”[1]，特別是在蛋雞遺傳改良計(jì)劃中重點(diǎn)提出了基因組選擇進(jìn)入實(shí)質(zhì)的應(yīng)用階段[2]。中國自2004年完成第一個(gè)紅原雞全基因組測(cè)序之后[3]，相繼完成了牛[4]、山羊[5]、豬[6]、草魚[7]、綿羊[8]等家養(yǎng)動(dòng)物的參考基因組測(cè)序工作，在此基礎(chǔ)上通過高通量測(cè)序技術(shù)的不斷優(yōu)化提升，一系列與生產(chǎn)密切相關(guān)的畜禽基因組變異被充分挖掘出來，進(jìn)而在DNA分子水平上通過分子生物學(xué)手段進(jìn)行分子標(biāo)記，為加速現(xiàn)有畜禽品種改良和早期選種提供了強(qiáng)大的技術(shù)支撐。理想的基因組變異檢測(cè)技術(shù)是在全基因組測(cè)序基礎(chǔ)上進(jìn)行的，基于高通量測(cè)序技術(shù)充分挖掘分子遺傳標(biāo)記，能夠高效、精準(zhǔn)的捕獲生物體大量遺傳變異，挖掘基因資源，促進(jìn)物種的基礎(chǔ)研究及其上下游產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。將測(cè)序技術(shù)與常規(guī)育種方法相結(jié)合，能夠挖掘大量可利用遺傳變異，提高育種的遺傳進(jìn)展，從而為畜禽種業(yè)創(chuàng)新發(fā)展提供良好平臺(tái)。

1 測(cè)序技術(shù)的發(fā)展歷程及應(yīng)用領(lǐng)域

1.1 測(cè)序技術(shù)的發(fā)展歷程及應(yīng)用平臺(tái)比較分析

自2003年完成人類基因組計(jì)劃后，基因組測(cè)序技術(shù)取得了長足的進(jìn)步，這也使測(cè)序的成本大幅度下降[9]。在第一代Sanger測(cè)序技術(shù)的基礎(chǔ)上，相繼又發(fā)展起來了二代和三代測(cè)序，因二代測(cè)序技術(shù)具有通量高、成本低、讀長短等特點(diǎn)[10]，又被稱為高通量測(cè)序技術(shù)或下一代測(cè)序技術(shù)。測(cè)序技術(shù)經(jīng)歷3個(gè)階段的發(fā)展過程：第一階段以1977年Sanger和Walter Gilbert發(fā)明傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)為開端[11]，第一臺(tái)測(cè)序儀誕生標(biāo)志著大規(guī)模的基因序列測(cè)定成為了可能，首個(gè)人類基因圖譜的繪制就是以改進(jìn)的Sanger測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)產(chǎn)生的，至今，Sanger技術(shù)仍然被廣泛應(yīng)用，但一次測(cè)序只能完成700～1 000 bp，無法滿足現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)對(duì)挖掘生物基因序列的迫切需求，因此高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生；第二階段即第二代測(cè)序技術(shù)在第一代測(cè)序技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了革新性改造，一次運(yùn)行測(cè)序就能完成幾十萬條至幾百萬條的核酸分子序列，其讀長短、準(zhǔn)確性低的缺點(diǎn)帶來測(cè)序深度不深和拼接技術(shù)的準(zhǔn)確性不夠等問題；第三階段針對(duì)第二代測(cè)序技術(shù)存在的上述問題，開發(fā)了第三代測(cè)序技術(shù)，又稱為單分子實(shí)時(shí)DNA測(cè)序技術(shù)，該技術(shù)在保證通量的基礎(chǔ)上，從單條長度從頭測(cè)序，能夠直接得到數(shù)百萬個(gè)核酸的序列信息。從應(yīng)用平臺(tái)的比較分析來看，三代基因測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用平臺(tái)在不斷地提升測(cè)序能力，目前就市場(chǎng)形勢(shì)來看，高通量測(cè)序技術(shù)仍在市場(chǎng)中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。第三代測(cè)序技術(shù)也在近幾年的科學(xué)研究中快速發(fā)展。二代測(cè)序技術(shù)以羅氏454測(cè)序儀(Roche GS FLX Sequencer)、Illumina公司的Solexa基因組分析儀和ABI的SOLiD測(cè)序儀為主要的測(cè)序平臺(tái)。三代測(cè)序技術(shù)以Pacific Bioscience的SMRT技術(shù)、The Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔單分子測(cè)序技術(shù)為主要測(cè)序平臺(tái)，解決了二代測(cè)序讀長短、準(zhǔn)確性低的問題。測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用平臺(tái)的優(yōu)劣勢(shì)、測(cè)序原理以及應(yīng)用領(lǐng)域總結(jié)如表1。

1.2 測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域

在高通量測(cè)序技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過對(duì)物種的個(gè)體或群體進(jìn)行基因組測(cè)序或差異分析，從而獲得大量的與生物表型密切相關(guān)的遺傳變異，如單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)[27]、小片段的插入和缺失(Indel)、結(jié)構(gòu)變異(SV)、拷貝數(shù)變異(CNV)[28]以及轉(zhuǎn)座子變異等，用于開發(fā)分子遺傳標(biāo)記，建立遺傳多樣性數(shù)據(jù)庫，為物種的進(jìn)化關(guān)系、挖掘功能基因、高效精準(zhǔn)的早期選擇以及輔助分子育種提供重要的數(shù)據(jù)支撐。以中心法則為核心的高通量測(cè)序技術(shù)也演變出很多分支測(cè)序技術(shù)，如不需要任何參考序列就能對(duì)某一物種進(jìn)行基因組測(cè)序的Denovo技術(shù)，也稱為從頭測(cè)序[29]；對(duì)已知基因組序列的物種進(jìn)行不同個(gè)體的基因組測(cè)序的全基因組重測(cè)序技術(shù)(WGS)[30]；在生物體整個(gè)基因組捕獲轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白修飾DNA靶點(diǎn)的全基因組甲基化測(cè)序技術(shù)(WGBS)等[31]。由于連鎖不平衡的作用，利用全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)分析的目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)的序列區(qū)域具有較大的寬度，不能精準(zhǔn)地逐漸聚焦而定位到目標(biāo)性狀的核心區(qū)域。研究表明，GWAS發(fā)現(xiàn)的SNP會(huì)影響到附近區(qū)域基因的表達(dá)量，最終造成鎖定的目標(biāo)區(qū)域不是與生物表型性狀高度相關(guān)的區(qū)域[32]，因此，聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)，從復(fù)雜的區(qū)域逐步鎖定控制表型性狀的關(guān)鍵基因，GWAS和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析可以實(shí)現(xiàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的相互驗(yàn)證。一直以來，研究認(rèn)為轉(zhuǎn)錄調(diào)控受RNA的直接影響，但隨著雞、鴨全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)的公布，發(fā)現(xiàn)參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的編碼蛋白約占全部序列的2%，其余98%是受非編碼蛋白R(shí)NA調(diào)控[33]。因此，高通量測(cè)序技術(shù)也產(chǎn)生了轉(zhuǎn)錄組、全轉(zhuǎn)錄組、空間轉(zhuǎn)錄組以及單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組等新技術(shù)。隨著轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的不斷優(yōu)化提升，原本被認(rèn)為是“轉(zhuǎn)錄噪音”的非編碼序列越來越多被發(fā)現(xiàn)，以小RNA(microRNA)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)、環(huán)狀RNA(circRNA)以及與PiWi蛋白互作的RNA(piRNA)為代表的非編碼RNA在細(xì)胞分化、增殖、生長、凋亡等重要的生理過程中發(fā)揮著重要作用[34-36]。單一的組學(xué)技術(shù)在解釋復(fù)雜性狀的生物學(xué)現(xiàn)象方面往往缺乏系統(tǒng)性，對(duì)畜禽生長發(fā)育機(jī)理、重要經(jīng)濟(jì)性狀功能基因的挖掘都不深入，多組學(xué)聯(lián)合分析可分別從基因、mRNA、轉(zhuǎn)錄因子、調(diào)控因子、蛋白、代謝路徑等不同層次上進(jìn)行信息的整合，構(gòu)建基因互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，解析復(fù)雜性狀形成的分子機(jī)理和遺傳基礎(chǔ)[37]。高通量測(cè)序技術(shù)在基因組、轉(zhuǎn)錄組以及多組學(xué)聯(lián)合分析方面的應(yīng)用領(lǐng)域如圖1所示。

圖1 高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域Fig.1 Application fields of high-throughput sequencing technology

高通量測(cè)序技術(shù)是以中心法則為核心建立起來的技術(shù)體系，在中心法則中，DNA水平的基因組學(xué)處于最上游，決定了基因的基本屬性，RNA水平的轉(zhuǎn)錄組學(xué)處于中央樞紐地位，但基因不能最終決定生物表型，它還受到表觀遺傳修飾、轉(zhuǎn)錄、翻譯、轉(zhuǎn)錄后加工以及環(huán)境等因素的影響，并且這些影響和改變最終都體現(xiàn)在代謝物的差異上，代謝組學(xué)常被稱作是基因組學(xué)和表型之間聯(lián)系的紐帶，也是能夠用生物標(biāo)記物解釋復(fù)雜生物性狀最直接的體現(xiàn)[38]。因此，多組學(xué)聯(lián)合分析也是高通量測(cè)序技術(shù)的升級(jí)版，產(chǎn)生了“基因組+轉(zhuǎn)錄組”、“轉(zhuǎn)錄組+代謝組”、“轉(zhuǎn)錄組+表觀組”以及“轉(zhuǎn)錄組+代謝組+蛋白質(zhì)組”，這些組學(xué)之間既各自獨(dú)立又相互關(guān)聯(lián)，從不同的角度解析了生物性狀形成的分子機(jī)理和遺傳基礎(chǔ)。

2 分子遺傳標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)在現(xiàn)代蛋雞種業(yè)創(chuàng)新中的應(yīng)用

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷更迭，海量的分子標(biāo)記被挖掘，分子遺傳標(biāo)記挖掘的準(zhǔn)確性取決于測(cè)序深度和組裝拼接的準(zhǔn)確性。通過高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行基因挖掘、定位、候選基因的篩選，并對(duì)候選目標(biāo)基因區(qū)域SNP、Indel、CNV和SV等基因組變異進(jìn)行結(jié)構(gòu)注釋和功能注釋，同時(shí)，將分子遺傳標(biāo)記與常規(guī)育種手段結(jié)合，這樣才能更好地為現(xiàn)代蛋雞種業(yè)創(chuàng)新服務(wù)。目前，按照遺傳標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的先后順序，常見的分子遺傳標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)主要?jiǎng)澐譃?個(gè)階段，以下針對(duì)分子遺傳標(biāo)記的3個(gè)階段進(jìn)行闡述。

2.1 第一代分子遺傳標(biāo)記

第一代分子遺傳標(biāo)記主要包括限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)和擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)。RFLP是最早應(yīng)用于群體遺傳多樣性分析的分子遺傳標(biāo)記[39]，利用限制性內(nèi)切酶酶切DNA分子后形成特定大小的DNA片段，因其具有共顯性的特點(diǎn)，可以通過電泳條帶直接分析基因型，適合構(gòu)建遺傳圖譜，同時(shí)其具有不受性別、年齡和生長階段限制的優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用于群體多樣性分析、功能基因數(shù)量性狀基因座(QTL)多態(tài)位點(diǎn)挖掘、傳染性疾病診斷等領(lǐng)域。曹頂國等[40]利用RFLP-PCR技術(shù)檢測(cè)汶上蘆花雞、濟(jì)寧百日雞和萊蕪黑雞極低密度脂蛋白受體(VLDLR)基因的SNP,分析發(fā)現(xiàn)VLDLR基因的V8467和V13876的SNP可以作為蛋雞蛋黃性狀的分子標(biāo)記；邵勇剛等[41]利用RFLP-PCR技術(shù)檢測(cè)拜城油雞公雞的脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白(A-FABP)基因多態(tài)性與生產(chǎn)性能相關(guān)性的研究發(fā)現(xiàn)，在拜城油雞公雞中共檢測(cè)到3個(gè)A-FABP基因型，分別為AA、AB、BB型，其中BB型為優(yōu)勢(shì)基因型，BB型個(gè)體與脂肪性狀相關(guān)的生產(chǎn)性能高于AA型個(gè)體，且不同年齡不同基因型之間存在差異，這也就進(jìn)一步解釋了A-FABP基因可以作為拜城油雞公雞的分子遺傳標(biāo)記用于育種；Parviz等[42]利用RFLP-PCR技術(shù)對(duì)影響蛋殼質(zhì)量的蛋殼基質(zhì)蛋白卵黃蛋白原-32(OCX-32)基因進(jìn)行基因分型，SNP (c.193A>C)是一種錯(cuò)義突變(天冬酰胺取代組氨酸)，同時(shí)也解析了OCX-32基因能夠中止鈣化，與鈣結(jié)合蛋白D28K作用相反，影響蛋殼中鈣的沉積量，從而調(diào)控蛋殼顏色和蛋殼質(zhì)量。為了克服RFLP技術(shù)上存在的多態(tài)位點(diǎn)低、技術(shù)復(fù)雜、成本高等缺點(diǎn)，RAPD在RFLP技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化提升,滲透于基因研究的各個(gè)領(lǐng)域，主要原理是隨機(jī)設(shè)計(jì)引物(8～10 bp)，通過PCR反應(yīng)非定點(diǎn)擴(kuò)增DNA片段，經(jīng)過凝膠電泳、溴化乙錠染色，結(jié)果顯示出擴(kuò)增片段DNA多態(tài)性，該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單，設(shè)計(jì)的隨機(jī)引物可以用于不同基因組分析，用1對(duì)引物就可以擴(kuò)增出很多片段，具有不需要同位素、安全性好等優(yōu)點(diǎn)，但也存在準(zhǔn)確性和重復(fù)性差的缺點(diǎn)。AFLP是在RFLP和RAPD檢測(cè)技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，具有RFLP高重復(fù)性和RAPD技術(shù)操作簡(jiǎn)單等雙重優(yōu)點(diǎn)，它將基因組DNA成對(duì)的經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生的片段用接頭(與酶切位點(diǎn)互補(bǔ))連接起來，并通過5′-端與接頭互補(bǔ)的半特異性引物擴(kuò)增得到大量DNA片段，從而形成指紋圖譜的分子標(biāo)記技術(shù)。目前，AFLP技術(shù)已經(jīng)在畜禽遺傳育種中發(fā)揮了它的優(yōu)勢(shì)。

2.2 第二代分子遺傳標(biāo)記

第二代分子遺傳標(biāo)記主要包括簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)和簡(jiǎn)單重復(fù)序列間區(qū)(ISSR)。在真核生物基因組中普遍存在許多非編碼的重復(fù)序列，其大小只有1～6 bp，串聯(lián)成簇的長度為50～100 bp，稱為短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)，又稱為簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)[43]，因其具有多態(tài)性(PIC)高、數(shù)量多且廣泛分布在基因組中的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用在個(gè)體及親緣關(guān)系鑒定、構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、雜交優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)、群體遺傳距離分析以及功能基因定位及QTL定位[44]。每個(gè)微衛(wèi)星兩側(cè)一般都是相對(duì)保守的單拷貝序列，據(jù)此可以涉及專一性引物，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增微衛(wèi)星片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離后，不同個(gè)體間因核心序列的重復(fù)次數(shù)不同而產(chǎn)生DNA多態(tài)性。研究表明，隨著SSR堿基的增加，條帶會(huì)逐漸減少，多態(tài)性的區(qū)域就會(huì)變得更加明顯，基因分型就越準(zhǔn)確[45]。曲魯江等[46]利用28對(duì)個(gè)微衛(wèi)星檢測(cè)中國地方品種大骨雞和北京油雞2個(gè)保種場(chǎng)保種效果比較分析，發(fā)現(xiàn)各個(gè)群體間均有較高的多態(tài)性，雜合度為0.55，各位點(diǎn)等位基因數(shù)目為2～22個(gè)，除LEI10194和MCW0032外，其余26個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)都處于基因平衡狀態(tài)。伍革民等[47]利用7個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)貴州省的4個(gè)烏骨雞群體進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳距離的分析發(fā)現(xiàn)，4個(gè)烏骨雞群體多態(tài)信息含量在0.6431～0.6913，雜合度在0.7069～0.7385，當(dāng)PIC>0.5時(shí)，表現(xiàn)為高度多態(tài)，4個(gè)烏骨雞群體平均雜合度越大，表明群體的遺傳變異程度越高，群體遺傳多樣性越豐富。Hillel等[48]充分利用SSR技術(shù)對(duì)來自多個(gè)國家的52種雞群的群體內(nèi)和群體間遺傳多樣性進(jìn)行了評(píng)估，發(fā)現(xiàn)商業(yè)品系的各個(gè)位點(diǎn)平均雜合度為0.29，平均群體內(nèi)雜合度為0.47，而地方品種平均雜合度為0.50，說明在雞群進(jìn)化過程中地方品種內(nèi)部由于遺傳漂變等因素的影響，導(dǎo)致了群體遺傳多樣性要比商業(yè)品系高，為利用好地方品種遺傳資源提供了新的路徑和新的見解。ISSR技術(shù)是在SSR技術(shù)基礎(chǔ)上建立起來的加錨核苷酸技術(shù)，ISSR技術(shù)應(yīng)用于群體遺傳多樣性研究、親屬關(guān)系以及系統(tǒng)發(fā)育方面的研究。武玉珍等[49]利用ISSR技術(shù)對(duì)褐馬雞兩大種群各35只雞進(jìn)行親緣關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，個(gè)體遺傳相似性的平均值為0.5061和0.7591，遺傳距離平均為0.4939和0.2409,表明在相同生態(tài)地理?xiàng)l件下種群的親緣關(guān)系較近。ISSR解決了SSR技術(shù)在物種間引物設(shè)計(jì)費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)，無需預(yù)先克隆和測(cè)序，節(jié)約減少了試驗(yàn)前期的準(zhǔn)備工作的強(qiáng)度[50]。

2.3 第三代分子遺傳標(biāo)記

第三代分子遺傳標(biāo)記主要包括SNP和表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)。SNP是DNA上單個(gè)核苷酸變異導(dǎo)致DNA序列多態(tài)性，大約1 000 bp存在1個(gè)SNP，SNP檢測(cè)技術(shù)是第三代遺傳分子標(biāo)記中最具應(yīng)用價(jià)值的分子標(biāo)記技術(shù)[51]，常見的有堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、缺失或替換導(dǎo)致的DNA序列多態(tài)性[27]。SNP分子標(biāo)記因其密度高、遍布基因組、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用[52]，但僅因1個(gè)位點(diǎn)的SNP變異很難影響到基因的表達(dá)和編碼蛋白序列，進(jìn)而影響到表型的差異。2014年Carneiro等[53]在研究家兔馴化遺傳機(jī)制方面發(fā)現(xiàn)，通過全基因組測(cè)序技術(shù)共發(fā)現(xiàn)5 000萬個(gè)SNPs，但真正能影響到氨基酸編碼的錯(cuò)義突變只有7萬個(gè)SNPs，在馴化過程中保留下來的錯(cuò)義突變只有14個(gè)SNPs，說明SNP分子標(biāo)記技術(shù)也有其局限性。對(duì)于挖掘SNP主要取決于采用的SNP研究策略，目前主要采用低通量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR和高通量測(cè)序技術(shù)制備SNP芯片來挖掘SNP。針對(duì)SNP具有數(shù)量大且只有一小部分屬于關(guān)鍵功能變異的特點(diǎn)，SNP的研究和應(yīng)用進(jìn)入了瓶頸階段，目前，CNV成為了繼SNP之后的關(guān)注熱點(diǎn)，主要是因?yàn)镃NV屬于大片段結(jié)構(gòu)變異，覆蓋較大區(qū)域的基因組序列，甚至能夠影響基因序列的表達(dá)[54]，一些重要的CNV已經(jīng)在人[55]、牛[56]、羊[57]、豬[58]、雞[59]等上被挖掘，并表現(xiàn)出與一些數(shù)量性狀和質(zhì)量性狀形成的遺傳機(jī)制高度相關(guān)，可以作為一種繼SNP分子標(biāo)記之后的另一個(gè)理想的分子遺傳標(biāo)記，用于畜禽育種。EST是指來源不同的組織的cDNA文庫，隨機(jī)挑選克隆、測(cè)序得到的cDNA序列，EST可以代表生物體某種組織某一時(shí)間的1個(gè)表達(dá)基因，目前來看，EST標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物基因組研究，關(guān)于應(yīng)用EST標(biāo)記技術(shù)在動(dòng)物基因組研究中鮮見報(bào)道。

3 高通量測(cè)序技術(shù)在蛋雞生產(chǎn)中的精準(zhǔn)應(yīng)用

3.1 群體遺傳多樣性及進(jìn)化分類

利用分子遺傳標(biāo)記在評(píng)價(jià)群體遺傳多樣性方面，很多研究都集中在運(yùn)用雜合度(He)、純合度(Ho)、有效等位基因數(shù)(Ne)以及PIC等指標(biāo)來評(píng)價(jià)。在評(píng)價(jià)群體進(jìn)化方面，尤桂爽等[60]利用簡(jiǎn)化基因組GBS測(cè)序方法對(duì)四川盆地6個(gè)雞群遺傳關(guān)系進(jìn)行了研究，利用He、PIC以及核酸多態(tài)性(Pi)等指標(biāo)評(píng)價(jià)了6個(gè)雞群的遺傳多樣性，巖水雞黑羽群體的遺傳多樣性較低(He=0.154，PIC=0.125)，大寧河雞遺傳多樣性最為豐富(He=0.197,PIC=0.162)為低多態(tài)性，雜合度和多態(tài)信息含量是衡量群體標(biāo)記多態(tài)性的重要指標(biāo)[61]，四川盆地的6個(gè)地方雞的He范圍在0.154～0.197,這也和Cendron等[62]研究意大利6種地方雞的研究結(jié)果一致。韓威等[63]利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)(RAD-Seq)對(duì)19個(gè)地方雞種進(jìn)行基因組SNP標(biāo)記，在19個(gè)雞種中共鑒定出400 562個(gè)SNPs，進(jìn)一步證實(shí)了中國地方品種遺傳多樣性豐富，利用He、Pi、近交系數(shù)(Fis)、遺傳分化系數(shù)(Fst)基因流(Nm)評(píng)價(jià)了19種地方雞的遺傳多樣性和遺傳分化情況，瓢雞和文昌雞的遺傳多樣性最為豐富,Ho分別為0.2468、0.2430,Pi分別為0.2781、0.2655;河南斗雞的遺傳多樣性相對(duì)匱乏,Ho為0.1560,Pi為0.1752;東鄉(xiāng)綠殼蛋雞和邊雞的近交系數(shù)最高(Fis>0.1600)。瓢雞與文昌雞、惠陽胡須雞、藏雞、大圍山微型雞,惠陽胡須雞與文昌雞,藏雞與茶花雞間的遺傳分化最低(Fst<0.1000),對(duì)應(yīng)的基因流最高(Nm>0.2400)，為中國地方雞品種資源保護(hù)、開發(fā)及利用提供了技術(shù)支撐。

3.2 群體遺傳圖譜的構(gòu)建和功能基因定位

利用高通量測(cè)序技術(shù)挖掘分子標(biāo)記，很難定位到目標(biāo)性狀的候選區(qū)域，因此對(duì)分子遺傳標(biāo)記的選擇顯得十分重要。遺傳圖譜能夠縮小分子標(biāo)記的數(shù)量，可以根據(jù)專一分子標(biāo)記或基因在染色體上的相對(duì)位置排列而成，遺傳圖譜是全基因組關(guān)聯(lián)分析成功的一個(gè)重要的前提。在雞的NCBI SNP數(shù)據(jù)庫中有超過900萬個(gè)SNPs標(biāo)記[64]，雞的遺傳圖譜的相對(duì)長度為3 800 cM,在雞的基因組中由10億個(gè)堿基組成[3]，大約200 bp存在1個(gè)SNP突變位點(diǎn)[65]。吳丹等[66]對(duì)北京油雞的生長性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，利用雞的60K SNP芯片對(duì)其28、56、80和100日齡的體重進(jìn)行GWAS，發(fā)現(xiàn)影響北京油雞體質(zhì)量性狀的全基因組關(guān)聯(lián)位點(diǎn)為9個(gè)，潛在關(guān)聯(lián)位點(diǎn)為96個(gè)，找到了LIM結(jié)構(gòu)域結(jié)合基因(LDB2)、LYR基序含子基因(LYRM1)、配體依賴性核受體輔阻遏物樣基因(LCORL)等候選基因，這些候選基因和分子標(biāo)記為北京油雞種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)、利用及保護(hù)提供了育種素材。孫艷發(fā)等[67]利用60K SNP芯片對(duì)雞的體重、脛長和脛圍進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，達(dá)到5%顯著性全基因組關(guān)聯(lián)位點(diǎn)分別有1和4個(gè)，潛在關(guān)聯(lián)位點(diǎn)分別為4和25個(gè)，分布在4號(hào)染色體14.93 Mb區(qū)域的SNP位點(diǎn)與脛長和脛圍有著顯著或潛在的聯(lián)系，這個(gè)區(qū)域內(nèi)含有LIM結(jié)構(gòu)域結(jié)合因子2(LDB2)、細(xì)胞分裂染色體雙軸取向1-樣1(BOD1L1)以及醌式二氫蝶啶還原酶(QDPR)等候選基因，8號(hào)染色體上有1個(gè)SNP位點(diǎn)位于ELA樣蛋白4(ELAVL4)基因下游的52 248 bp處，13號(hào)染色體上有1個(gè)SNP位點(diǎn)位于同源異型盒蛋白Nkx-2.5(NKX2.5)基因下游的138 834 bp處，這些候選位點(diǎn)都為解析脛長和脛圍的遺傳機(jī)制提供了新思路。Julien等[68]利用全基因組測(cè)序技術(shù)解析了日本鵪鶉的社會(huì)行為、侵略性等指標(biāo)，利用2 145個(gè)分子標(biāo)記構(gòu)建了其遺傳圖譜，其中1 479個(gè)標(biāo)記可定位在不同的28個(gè)連鎖群上，平均遺傳連鎖圖譜長度為3 057 cM，平均標(biāo)記距離為2.1 cM，在QTL定位結(jié)果中發(fā)現(xiàn)45個(gè)QTLs，其中22個(gè)與行為有關(guān)，23個(gè)生產(chǎn)性能相關(guān)，這些QTL定位區(qū)域的發(fā)現(xiàn)也為優(yōu)化動(dòng)物福利模式提供了遺傳機(jī)制上的新見解。因此在蛋雞生產(chǎn)中應(yīng)用分子標(biāo)記進(jìn)行分子育種、構(gòu)建遺傳圖譜、定位功能基因，有助于加快新品種育成速度和解決蛋雞產(chǎn)業(yè)“卡脖子”關(guān)鍵技術(shù)。

3.3 數(shù)量性狀形成的遺傳機(jī)制解析

吳常信等[69]在基于國外育種公司提出的“100周產(chǎn)500枚蛋”計(jì)劃是否能實(shí)現(xiàn)，進(jìn)行了可行性的分析，雖然這種設(shè)想在2020年實(shí)現(xiàn)“100～500”計(jì)劃是不可能的，但也對(duì)中國蛋雞產(chǎn)業(yè)具有很強(qiáng)的借鑒意義，確定了“提高80～100周齡的產(chǎn)蛋率”和“增強(qiáng)產(chǎn)蛋后期蛋品質(zhì)選擇”是中國蛋雞育種的目標(biāo)。在這2個(gè)育種目標(biāo)的指引下，很多研究人員都進(jìn)行了有益的探索。在增強(qiáng)蛋品質(zhì)方面，現(xiàn)在大多采用全基因組關(guān)聯(lián)性分析和分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)進(jìn)行了大量的研究，對(duì)雞的初生重以及48和60周齡的產(chǎn)蛋量和蛋黃顏色，使用全基因組關(guān)聯(lián)性分析，獲得了26個(gè)與蛋品質(zhì)顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)[70]；用高密度陣列的全基因組關(guān)聯(lián)研究對(duì)東鄉(xiāng)藍(lán)殼雞與白來航雞雜交產(chǎn)生的F2代資源群中獲得的禽蛋，通過雙性狀動(dòng)物模型和基因注釋獲得了蛋殼的候選基因，分別是調(diào)節(jié)突觸膜胞吐2(RIMS2)、溶質(zhì)載體家族(SLC25A32)、液泡分選蛋白13B(VPS13B)和G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)器3(RGS3)[71]；結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，為同時(shí)表現(xiàn)藍(lán)蛋殼和矮化性狀的純種雞提供了一種快速育種方法[72]。目前在蛋品質(zhì)研究中所產(chǎn)生的候選基因、大量的QTL和致病基因，但由于分子標(biāo)記的遺傳效應(yīng)過小，所能解釋表型差異的生物學(xué)現(xiàn)象有限，分子輔助標(biāo)記選擇至今沒有一個(gè)完整的、成功的育種方案，導(dǎo)致這些成果在商業(yè)品系中并不能得以應(yīng)用[73]。因此，在后續(xù)的研究中著重于對(duì)候選基因重要功能SNP位點(diǎn)的挖掘，以及調(diào)控這些功能基因的上下游信號(hào)通路的生物學(xué)機(jī)制的研究應(yīng)用到蛋雞品系培育中，更好地為家禽的早期選育以及重要經(jīng)濟(jì)性狀應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。在提高產(chǎn)蛋率方面，家禽產(chǎn)蛋受環(huán)境、內(nèi)分泌、遺傳因素的共同調(diào)節(jié)。隨著分子遺傳學(xué)技術(shù)和DNA分子標(biāo)記的出現(xiàn)，家禽產(chǎn)蛋性能相關(guān)性狀的QTL用于分子標(biāo)記輔助選擇的研究迅速發(fā)展[74]，現(xiàn)多使用高通量測(cè)序，利用分子育種策略，可以使家禽養(yǎng)殖行業(yè)最大限度地降低生產(chǎn)成本。采用RNA-Seq測(cè)序技術(shù)，對(duì)蘆花雞下丘腦、垂體和卵巢組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，從15個(gè)文庫中產(chǎn)生了76.09 Gb的RNA-Seq序列，每個(gè)文庫的平均大小為5.07 Gb[75]；Liu等[76]使用線性混合模型對(duì)1 078只洛島紅雞進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)研究篩選出大量的候選基因，但并沒有發(fā)現(xiàn)任何影響總蛋數(shù)的候選基因。Wu等[77]對(duì)抗繆勒管激素(AMH)外顯子設(shè)計(jì)引物并擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)京海黃雞AMH基因第二外顯子的多態(tài)性及其與繁殖性狀之間的關(guān)系，并檢測(cè)出4個(gè)SNP位點(diǎn)為家禽育種提供了分子標(biāo)記區(qū)段；Wolc等[78]通過使用品系特異性50K Affymetrix Axiom SNP芯片進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)了參與卵母細(xì)胞成熟的Wiskott-Aldrich綜合征蛋白和富含脯氨酸同源物(WASH1)、調(diào)節(jié)卵泡刺激素分泌的神經(jīng)肽VF前體(NPVF)及參與卵泡的卵母細(xì)胞成熟和排卵的叉形頭轉(zhuǎn)錄因子3(FOXO3)；Rowland等[79]使用SNP芯片進(jìn)行GWAS關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)候選基因膜泡蛋白分揀36(VPS36)、雄激素受體(AR)和無翅型小鼠乳房腫瘤病毒整合位點(diǎn)家族(WNT11B)在卵泡發(fā)育、性腺生長和真皮發(fā)育方面起重要作用；Azmal等[80]發(fā)現(xiàn)，京紅雞3號(hào)和13號(hào)染色體上的12個(gè)SNPs與產(chǎn)蛋后期受精率顯著相關(guān)。因此，利用高通量測(cè)序技術(shù)挖掘與產(chǎn)蛋性狀相關(guān)基因的SNP變異位點(diǎn)，并對(duì)其進(jìn)行分子標(biāo)記，能夠在蛋雞生產(chǎn)中進(jìn)行高效選種，提高選種強(qiáng)度，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)較快的遺傳進(jìn)展。

3.4 質(zhì)量性狀形成的遺傳機(jī)制解析

針對(duì)冠型、羽色、蛋殼顏色、矮腳等具有代表性的性狀，運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)解析蛋雞的質(zhì)量性狀形成的遺傳機(jī)制，能夠在蛋雞早期根據(jù)羽速或羽毛特征來鑒別雌雄、進(jìn)行高效選種，減少飼養(yǎng)成本給育種帶來的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)?？刂瀑|(zhì)量性狀的等位基因有不完全顯性和完全顯性的現(xiàn)象，對(duì)于不完全顯性的性狀，能從表型中直接分辨基因型，根據(jù)表型選擇也就是基因型選擇從而達(dá)到高效選種的目的。有研究利用全基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)東鄉(xiāng)雞、盧氏蛋雞和綠殼蛋雞Araucana進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)家族成員(SLCO1B3)基因上游啟動(dòng)子區(qū)域中部分內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒(EAV-HP)的插入導(dǎo)致雞綠殼蛋的形成有關(guān)，是由于逆轉(zhuǎn)錄病毒片段會(huì)導(dǎo)致相鄰基因的異位表達(dá)或異常表達(dá)，從而影響SLCO1B3基因的表達(dá)[81-83]。Feng等[84]利用全基因組測(cè)序技術(shù)揭示了雞絲羽性狀是由癸二烯二磷酸酶亞基2(PDSS2)順式作用調(diào)控引起，并對(duì)根據(jù)該位點(diǎn)建立了絲羽性狀的分子標(biāo)記用于指導(dǎo)生產(chǎn)。Wright等[85]利用高通量測(cè)序技術(shù)揭開了雞豆冠形成是由于SRY轉(zhuǎn)錄因子5(SOX5)基因的一段非編碼序列拷貝數(shù)增加而引起，雞冠性狀對(duì)于高效選種也十分重要。Cui等[72]利用分子輔助標(biāo)記選擇策略，對(duì)綠殼蛋和矮腳2個(gè)性狀進(jìn)行選擇，培育出綠蛋殼矮腳性狀的純種雞品系，就是應(yīng)用SLCO1B3和生長激素受體(GHR)基因的分子標(biāo)記技術(shù)培育而來。Luo等[86]利用組織切片、全基因組關(guān)聯(lián)研究和RNA-Seq技術(shù)，進(jìn)一步研究了羌源麻雞紅/白耳垂形成的組織學(xué)和分子遺傳學(xué)機(jī)制，這些利用質(zhì)量性狀快速培育雞的新品系的新方法和新視野，為利用蛋雞基因組高效選種進(jìn)入實(shí)質(zhì)階段提供了技術(shù)支撐。

4 小 結(jié)

隨著測(cè)序技術(shù)的不斷更新?lián)Q代，以新一代測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的高通量測(cè)序技術(shù)和單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)都為挖掘基因變異做出了重要貢獻(xiàn)。其中，高通量測(cè)序技術(shù)是現(xiàn)如今研究物種遺傳變異形成機(jī)制的應(yīng)用最為廣泛的測(cè)序技術(shù)，高通量測(cè)序技術(shù)及分子遺傳標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)在蛋雞生產(chǎn)中的精準(zhǔn)應(yīng)用主要有4個(gè)方面：①利用高通量測(cè)序技術(shù)能夠挖掘與蛋雞產(chǎn)蛋性能表型性狀高度相關(guān)的基因組變異，并對(duì)這些變異進(jìn)行檢測(cè)，精準(zhǔn)定位與產(chǎn)蛋性狀相關(guān)的候選區(qū)域，形成分子遺傳標(biāo)記，利用基因組選擇的遺傳變異信息對(duì)蛋雞群體或個(gè)體的遺傳基礎(chǔ)進(jìn)行評(píng)定，從而達(dá)到縮短世代間隔，提高選種的準(zhǔn)確性，實(shí)現(xiàn)較大的遺傳進(jìn)展；②在進(jìn)行分子遺傳標(biāo)記篩選和功能驗(yàn)證過程中，利用多組學(xué)技術(shù)縮小定位產(chǎn)蛋性狀候選性狀區(qū)域范圍，更加精準(zhǔn)的挖掘產(chǎn)蛋性狀的功能基因；③利用多種技術(shù)反復(fù)驗(yàn)證目標(biāo)性狀的候選基因，從而多維度的解析生物性狀形成的機(jī)制，為蛋雞基因組選擇進(jìn)入實(shí)質(zhì)階段提供技術(shù)參考具有重要指導(dǎo)意義；④利用分子遺傳標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行基因分型，選取樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，而后分析各個(gè)基因型對(duì)產(chǎn)蛋性狀的遺傳效應(yīng)，本質(zhì)上分子遺傳標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)是高通量測(cè)序技術(shù)的補(bǔ)充。目前應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)和分子遺傳標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)成功將控制綠殼性狀的SLCO1B3基因應(yīng)用于綠殼蛋雞的品種培育上，將矮小基因應(yīng)用于節(jié)糧型蛋雞的培育上，因此，該技術(shù)助推了蛋雞產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展。高通量測(cè)序挖掘分子遺傳標(biāo)記及其在蛋雞生產(chǎn)中精準(zhǔn)應(yīng)用如圖2所示。

雖然新一代測(cè)序技術(shù)在挖掘蛋雞基因組變異上有諸多優(yōu)勢(shì)，但也存在著定位功能主效基因不準(zhǔn)確、實(shí)際應(yīng)用存在著諸多問題，因此，未來測(cè)序技術(shù)在蛋雞生產(chǎn)中的精準(zhǔn)應(yīng)用，一方面要圍繞開發(fā)中等密度SNP芯片用于分析雞的重要經(jīng)濟(jì)性狀和利用地方雞資源培育新的蛋雞新品系，解決中國蛋雞品種“卡脖子”關(guān)鍵問題，另一方面用圍繞運(yùn)用多種新興技術(shù)諸如染色質(zhì)可及性分析(ATAC)、高通量染色體構(gòu)象捕獲技術(shù)(Hi-C)、單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)等，更深層次解釋表型差異的生物學(xué)現(xiàn)象，為解析蛋雞重要經(jīng)濟(jì)性狀形成機(jī)理提供技術(shù)支撐。