薛曉巖，張振興，曾 毅，季 佳，代紅煬，李素華，宋建領(lǐng)

(1.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650224；2.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南省熱帶亞熱帶動物病毒病 重點實驗室，昆明 650224；3.水富市兩碗鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村和集體經(jīng)濟(jì)發(fā)展中心，水富 657803；4.會澤黑頸鶴國家級自然保護(hù)區(qū)管護(hù)局，曲靖 654200)

禽腺病毒4型(Fowl adenovirus-4,FAdV-4)是近年來中國雞群暴發(fā)的病毒性傳染病心包積液-肝炎綜合征的主要病原，也是致病性最強的禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)[1]，給中國養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。FAdV-4不僅感染肉雞、蛋雞、鴨和鵝，而且在野鳥上也有分離到FAdV-4的報道[2-4]。1987年，在巴基斯坦安卡拉地區(qū)的一個肉雞場首次暴發(fā)FAdV-4感染，所以也稱為安卡拉病，1989年后該病在世界范圍內(nèi)流行，2013年在中國散在發(fā)生[5]，2015年在中國大面積暴發(fā)[6-8]，2016年在云南省石林縣肉雞群中分離到云南省首個FAdV-4毒株[9]。按照群特異性抗原不同，F(xiàn)AdV分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ群，其中Ⅰ群FAdV又分5個亞群(FAdV-A～FAdV-E)和12個血清型(FAdV1～FAdV8a，F(xiàn)AdV8b～FAdV11)[10]，F(xiàn)AdV-4屬于FAdV-C亞群。Hexon蛋白是FAdV病毒顆粒表面最大的衣殼蛋白，含有病毒刺激宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要抗原決定簇[11]，由2個保守的基底區(qū)(P1、P2)和4個高變環(huán)(L1～L4)組成，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[12]。由于不同血清型FAdVHexon基因高變區(qū)序列的差異較大，因此Hexon蛋白也常用于血清型分類[13-14]。2020—2021年，本研究從云南省發(fā)病家禽肝臟組織及野鳥糞便樣品中分離出FAdV-4，并對分離株的致病性和Hexon基因序列進(jìn)行了研究分析，以期探討云南FAdV-4分離株的毒力特性，為FAdV-4的分子流行病學(xué)研究和防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2020年1月—2021年6月在云南省昆明市、曲靖市、楚雄州、大理州、紅河州、玉溪市等家禽養(yǎng)殖密集區(qū)采集到疑似感染FAdV-4的家禽肝臟組織樣品158份和候鳥遷徙地野鳥新鮮糞便樣品310份，將肝臟組織樣品剪碎，按1∶10比例加入滅菌生理鹽水研磨；糞便樣品按1∶5比例加入滅菌生理鹽水充分混勻，研磨的混合物和糞便混合液反復(fù)凍融3次，8 000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，收集濾液―20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

SPF雞胚購自北京媯川亞申養(yǎng)殖中心；未經(jīng)FAdV-4免疫的健康白羽肉雞購自云南云嶺廣大峪口禽業(yè)有限公司。

MiniBEST Viral RNA/DNA提取試劑盒、TaqDNA聚合酶和DL2000 DNA Marker等均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank中FAdV-4基因序列(登錄號：GU188428.1)，參考文獻(xiàn)[6,15]設(shè)計FAdV-4檢測引物FAdV-4F/R(表1)，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小為564 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

利用MiniBEST Viral RNA/DNA提取試劑盒分別提取樣品濾液中的病毒DNA，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系20 μL：TaqDNA聚合酶10 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，100 V電泳30 min，拍照保存。

1.3 病毒分離鑒定

參考蘭虹等[16]方法，樣品濾液通過卵黃囊接種7日齡SPF雞胚，每枚雞胚0.2 mL，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育，每12 h觀察一次雞胚，棄去24 h內(nèi)非特異性死亡雞胚，無菌收集24～96 h死亡雞胚尿囊液及胚體。對收集的尿囊液分別提取核酸，采用PCR檢測FAdV-4。

1.4 血凝試驗

取96孔V型微量板，將微量板橫向放置，每行為同種動物1%紅細(xì)胞懸液，每列為不同檢測樣品，進(jìn)行血凝試驗，觀察紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。紅細(xì)胞凝集滴度的判定以反應(yīng)板傾斜45°，沉于管底的紅細(xì)胞沿著傾斜面向下呈線狀流動，表明紅細(xì)胞未被病毒凝集；若孔底的紅細(xì)胞平鋪，凝成均勻薄層，傾斜45°后紅細(xì)胞不流動，表明紅細(xì)胞被病毒凝集。

1.5 雞胚半數(shù)致死量測定

取FAdV-4陽性樣品濾液，經(jīng)無菌PBS梯度稀釋，配制成10-3至10-10病毒液，卵黃囊接種于7日齡SPF雞胚，每個滴度接種5枚。棄去24 h內(nèi)死亡雞胚，記錄每天死胚數(shù)量，連續(xù)觀察至96 h，按Reed-Muench法計算雞胚半數(shù)致死量(ELD50)。

1.6 致病性試驗

將30只4周齡未經(jīng)免疫的健康白羽肉雞平均分成3組，每組10只，分別為分離毒株YN1905組(試驗1組)、分離毒株YN1802組(試驗2組)及對照組。試驗組分別用106ELD50/mL的病毒液肌內(nèi)注射1 mL，對照組肌內(nèi)注射1 mL無菌PBS。每天觀察雛雞臨床癥狀，記錄死亡數(shù)，連續(xù)觀察14 d，剖檢發(fā)病死亡個體，觀察大體病變，并采集肝臟組織，制備石蠟組織切片，經(jīng)HE染色，顯微鏡下觀察病理變化。

1.7 Hexon基因PCR擴(kuò)增和測序

根據(jù)GenBank中FAdV-4基因序列(登錄號：GU188428.1)，參考文獻(xiàn)[6,15]，設(shè)計用于分段擴(kuò)增FAdV-4Hexon全基因的3對引物Hexon-1F/R、Hexon-2F/R和Hexon-3F/R(表1)，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。利用MiniBEST Viral RNA/DNA提取試劑盒提取FAdV-4陽性雞胚尿囊液病毒DNA，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系20 μL：TaqDNA 聚合酶10 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.8 Hexon序列生物信息學(xué)分析

使用SeqMan軟件對測序結(jié)果進(jìn)行拼接、處理和編輯，經(jīng)BLAST進(jìn)行序列相似性比對，在NCBI中下載相似毒株序列及已發(fā)表的FAdV代表毒株序列作為參考序列，參考毒株信息見表2。采用BioEdit進(jìn)行氨基酸位點變異分析，采用ClustW進(jìn)行多序列比對，并應(yīng)用Neighbor-Joining法通過Mega 10.0軟件構(gòu)建Hexon分子系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表2 FAdV參考毒株信息Table 2 Reference strain information of FAdV

2 結(jié) 果

2.1 病原核酸檢測

在采集的158份家禽肝臟組織樣品中，F(xiàn)AdV-4核酸陽性19份，陽性率為12.03%；在候鳥遷徙地采集的310份野鳥新鮮糞便樣品中，F(xiàn)AdV-4核酸陽性1份(黑頸鶴糞便)，陽性率為0.3%；20份陽性樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在564 bp處均檢測到預(yù)期目的條帶(圖1)。

M，DL2000 DNA Marker；1，陽性對照；2，陰性對照；3～21，家禽肝臟組織樣品；22，野鳥糞便樣品 M，DL2000 DNA Marker;1，Positive control；2，Negative control；3-21，Liver tissue samples from domestic poultry；22，F(xiàn)aecal samples from wild bird圖1 樣品FAdV-4的PCR檢測結(jié)果Fig.1 PCR detection results of FAdV-4 in samples

2.2 病毒分離及鑒定

對20份FAdV-4核酸檢測陽性對應(yīng)樣品的上清液分別接種SPF雞胚，盲傳3代，其中7份樣品的上清液(均來自于發(fā)病家禽的肝臟組織樣)對3代雞胚均可致死。與無菌PBS接種的對照組胚體相比，接種樣品致死的胚體發(fā)育不良、組織器官明顯萎縮，胚胎呈現(xiàn)頭尾明顯卷曲狀，且表面覆蓋疏松血性滲出物。對雞胚尿囊液用引物FAdV-4F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，7份可致死雞胚的樣品擴(kuò)增產(chǎn)物大小約564 bp(圖2)，與預(yù)期目的條帶長度相符。說明從7份樣品中分離到FAdV-4，分別命名為：YN1605、YN2004、YN1802、YN1904、YN2109、YN1905和YN2108。

M，DL2000 DNA Marker；1，陽性對照；2，陰性對照；3～9，YN1605、YN2004、YN1802、YN1904、YN2109、YN1905和YN2108分離毒株雞胚尿囊液 M，DL2000 DNA Marker；1，Positive control,2，Negative control,3-9，YN1605,YN2004,YN1802,YN1904,YN2109,YN1905 and YN2108 for chicken embryo allantoic fluid，respectively圖2 分離毒株雞胚尿囊液FAdV-4的PCR檢測結(jié)果Fig.2 PCR detection results of FAdV-4 of chicken embryo allantoic fluid

2.3 血凝試驗

7份FAdV-4樣品接種雞胚的尿囊液對雞、鴨、兔紅細(xì)胞均無血凝能力(圖3)。

A，雞紅細(xì)胞懸液；B，鴨紅細(xì)胞懸液；C，兔紅細(xì)胞懸液；1～7，YN1605、YN2004、YN1802、YN1904、YN2109、YN1905和YN2108分離毒株雞胚尿囊液 A,Chicken erythrocyte suspension;B,Duck erythrocyte suspension;C,Rabbit erythrocyte suspension;1-7,YN1605,YN2004,YN1802,YN1904,YN2109,YN1905 and YN2108 for chicken embryo allantoic fluid，respectively圖3 分離毒株血凝抑制檢測Fig.3 The blood coagulation inhibition test of the isolated strains

2.4 雞胚半數(shù)致死量測定

由表3可知，Reed-Muench法得到7個分離毒株的ELD50在10-6.17～10-4.32/mL之間。

表3 7個分離毒株的ELD50測定結(jié)果Table 3 ELD50 determination results of 7 isolated strains

2.5 病毒致病性試驗

用YN1905和YN1802分離毒株感染試驗1、2組雛雞，在感染第1～2天未見明顯異常癥狀；感染第3天2個試驗組雛雞開始出現(xiàn)精神萎靡、嗜睡、羽毛蓬亂、食欲減退等癥狀；感染第4～6天內(nèi)可見臨床癥狀加重，表現(xiàn)為頭首啄地、綠便腹瀉、流涎等，并出現(xiàn)個體死亡；感染第14天2個試驗組死亡率高達(dá)80%；對照組雞未出現(xiàn)異常臨床表現(xiàn)，無死亡個體。對感染第5天死亡的雛雞進(jìn)行剖檢可見心包呈水囊狀，明顯淡黃色澄清的心包積液；肝臟腫大，質(zhì)脆易碎，顏色蒼白，肝葉上分布有出血點或出血斑，伴有壞死灶。肝臟病理組織切片顯示，肝血竇淤血，肝細(xì)胞變性壞死，炎性細(xì)胞顯著浸潤(圖4)。

A，對照組；B，試驗1組；C，試驗2組 A，Control group;B,Group 1;C,Group 2圖4 FAdV-4感染雞肝臟組織學(xué)特征(40×)Fig.4 Histological characteristics of chicken liver with FAdV-4 infection (40×)

2.6 Hexon全基因PCR擴(kuò)增和測序

分別對7份FAdV-4陽性樣本的雞胚尿囊液提取核酸，對Hexon全基因分3段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，7份樣本均在1 110、915和816 bp處出現(xiàn)特異性目的條帶，與預(yù)期大小相符，部分毒株Hexon基因擴(kuò)增結(jié)果見圖5。PCR產(chǎn)物純化后送測序，所獲序列經(jīng)SeqMan拼接分別獲得6株2 814 bp和1株2 811 bp全長Hexon基因序列。

2.7 遺傳進(jìn)化分析

對7株FAdV-4Hexon全基因序列進(jìn)行核苷酸序列相似性分析，結(jié)果顯示，7株FAdV-4云南分離株Hexon基因相似性為99.5%～100%；與近幾年國內(nèi)分離的高致病性毒株(SD1511、AH712、HLJFAd15、HB1510等)[12]核苷酸序列相似性在99.7%～100%；與印度分離株(PK-01、PJ-06、B1-7等)核苷酸序列相似性在96.9%以上(圖6)。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，7株云南分離株處于FAdV-C亞群分支，與Ⅰ群的A、B、D和E各亞群FAdV毒株之間親緣性較低，聚類在不同分支；與國內(nèi)流行的高致病性株處于同一小分支上，此分支還包括印度株，加拿大株(ON1)、澳大利亞株(KR5)和墨西哥(MX-SHP95)聚類在另一小分支(圖7)。

2.8 分離毒株Hexon氨基酸序列相似性及位點分析

7株FAdV-4分離毒株Hexon氨基酸序列間的相似性為99.5%～100%，與參考株氨基酸序列相似性在96.9%～100%，其中與國內(nèi)高致病性毒株和印度株氨基酸序列相似性較高，分別為99.7%～100%和96.9%～99.7%，與MX-SHP95、ON1和KR5的相似性較低，為98.3%～99.0%(圖8)。Hexon氨基酸位點變異主要集中于第160～410位，與ON1、KR5、PJ-06等低致病性毒株相比，變異位點包括T164S、I188R、Q193R、E195Q、N238D、A240T、E243N、M263I、T410A等；與HB1510、HLJFAd15、SD1511等國內(nèi)高致病性毒株相比具有相同位點，包括164S、188R、193R、195Q、238D、240T、243N、263I等；部分毒株存在S362P、G369A、N663K、G675R等位點變異(表4)。

表4 FAdV-4 Hexon氨基酸序列變異位點Table 4 Variation sites of Hexon amino acid sequences of FAdV-4

3 討 論

FAdV是家禽和野禽常見的傳染病病原，自2015年以來中國暴發(fā)了以FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11為主的包涵體肝炎疫情，發(fā)病雞數(shù)量逐年增加且致病性增強，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[16]。目前對FAdV不同血清型之間的鑒定和區(qū)分常依賴于PCR法，該方法中如何選擇特定靶基因來設(shè)計引物是關(guān)鍵。由于FAdV對宿主選擇不具有特異性，若選擇FAdV全基因組中高度保守基因，則只能鑒定；若選擇12個血清型中各獨立保守基因，則只能分型。為達(dá)到同時進(jìn)行鑒定和分型的目的，靶基因應(yīng)具有保守區(qū)域和可變區(qū)域，且保守區(qū)域應(yīng)圍繞可變區(qū)域，在保守區(qū)域擴(kuò)增用于FAdV鑒定的同時可變區(qū)域用于分型[17]。Hexon蛋白是FAdV病毒粒子的主要結(jié)構(gòu)蛋白，蛋白編碼Hexon基因具有保守部區(qū)(基座、P1和P2)和可變結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)域(Loop 1―Loop 4)，保守區(qū)域位于病毒體內(nèi)部，可變環(huán)從表面伸出，且可變環(huán)含有亞型特異性中和表位。研究表明，來自不同宿主、不同血清型的FAdV可變環(huán)區(qū)的序列相似性極低，通過對Loop 1區(qū)遺傳進(jìn)化分析可確定FAdV的血清型[17-19]，因此對FAdV的鑒定和分型通常以Hexon為靶基因。馮敬敬等[12]、蘭虹等[16]、趙玉杰等[20]均以Hexon為靶基因成功鑒定并確定不同血清型的FAdV。本研究以Hexon為靶基因，從云南省不同養(yǎng)殖場疑似FAdV感染的家禽肝臟組織樣品和候鳥新鮮糞便中鑒定到20份FAdV-4陽性樣品，也是首次在云南越冬的黑頸鶴糞便中檢測到FAdV-4核酸，本研究分離獲得的7株FAdV-4毒株均來自于發(fā)病家禽的肝臟組織樣品，黑頸鶴糞便樣品中沒有分離到FAdV-4毒株，可能與糞便樣品中FAdV-4病毒含量太低有關(guān)。遺傳進(jìn)化分析顯示，7株分離株與C亞群的FAdV-4型分離株親緣關(guān)系較近，與當(dāng)前FAdV-4國內(nèi)高致病性流行株及印度株的相似性較高。

Hexon蛋白也是FAdV的主要免疫保護(hù)性蛋白，含有特異性抗原決定簇，決定著FAdV-4的致病性[21-24]。研究人員將Hexon特定氨基酸位點特征(如：164S、188R、193Q、195Q、238D、240T、243N、263I、410A等)及病毒具有明確的致病性作為高致病性毒株的的判定標(biāo)準(zhǔn)，且出現(xiàn)任意一項即可判定為高致病毒株[24-25]。FAdV-4 Hexon蛋白氨基酸位點分析顯示，云南省分離毒株均具有188R、195Q、238D、240T等的高致病性毒株特征[24-25]。本研究用YN1905和YN1802株感染4周齡白羽肉雞，可以引起明顯的FAdV-4感染導(dǎo)致的臨床癥狀，出現(xiàn)淡黃色澄清的心包積液、肝臟腫大、肝血竇淤血、肝細(xì)胞變性壞死和炎性細(xì)胞顯著浸潤等病理變化，死亡率最高達(dá)到80%，致病性試驗結(jié)果驗證了分離毒株為高致病性毒株，與國內(nèi)FAdV-4流行株對雛雞具有一致的致死性，導(dǎo)致相似的臨床癥狀及病理變化[14]。同時云南部分分離毒株存在362、369、663、675位氨基酸變異，這些位點突變在病毒復(fù)制能力、宿主選擇等方面的影響仍需要進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

本試驗掌握了云南FAdV-4流行情況，首次在云南越冬的黑頸鶴糞便中檢測FAdV-4病原核酸陽性。從發(fā)病家禽的肝臟組織樣中共分離獲得7株FAdV-4毒株，具有高致病性特征，屬于FAdV-C亞群，與國內(nèi)流行株和印度株Hexon基因序列相似性極高，親緣關(guān)系較近。分離毒株Hexon蛋白188、193和195位氨基酸處具有與國內(nèi)高致病性毒株相同特征，部分毒株362、369、663和675位氨基酸處發(fā)生突變。