譚 斌，王 超，王 巖，張淑琴

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130122；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，哈爾濱 150086)

肉食獸細小病毒可感染貓科、犬科、浣熊科和鼬科等多種動物，導(dǎo)致患病動物出現(xiàn)以劇烈腹瀉和出血性腸炎為主要特征的疾病，死亡率達80%。肉食獸細小病毒病已成為對世界犬貓等寵物、經(jīng)濟動物、野生動物及實驗動物等危害最為嚴(yán)重的傳染病之一[1-3]。肉食獸細小病毒依據(jù)感染宿主不同，主要包括貓泛白細胞減少癥病毒(Feline panleukopenia virus,FPV)、水貂腸炎病毒(Mink enteritis virus,MEV)、犬細小病毒(Canine parvovirus,CPV)等,他們同歸屬于細小病毒科(Parvoviridae)細小病毒亞科(Parvovirinae)的自主復(fù)制病毒。細小病毒為單股負鏈無囊膜的DNA病毒，其利用宿主細胞中的聚合酶在細胞核中復(fù)制[4-5]。自然變異株或在細胞上傳代的高代次病毒基因序列變異率和一些RNA病毒的變異率相當(dāng)。自1978年CPV-2被鑒定后不久就發(fā)生抗原變異，2個新型抗原突變體出現(xiàn)CPV-2a和CPV-2b型，隨后，CPV-2a和CPV-2bVP2基因發(fā)生297位(S→A)的突變，產(chǎn)生了New CPV-2a和 New CPV-2b變異株；2000年，以426位(D→E)突變?yōu)樘卣鞯牧硪环N新的抗原突變體CPV-2c被報道[6-8]。相對于最初的CPV-2，抗原突變體對犬的致病性更高，且病毒的宿主范圍不斷擴大[9-10]。

果子貍學(xué)名花面貍，屬于食肉目、靈貓科，是一種珍貴的經(jīng)濟動物[11]。腹瀉是對果子貍養(yǎng)殖危害最為嚴(yán)重的疾病之一，群體發(fā)病多由細小病毒引起，給果子貍養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。本研究從患腸炎果子貍病料中分離到1株細小病毒，并比較了與其他肉食獸細小病毒流行株的VP2基因的遺傳變異情況，以期為細小病毒流行及抗原變異情況及防治提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及處理

果子貍腸道組織樣品采集自山西省某果子貍養(yǎng)殖場?；疾游锉憩F(xiàn)為拒食、脫水、腹瀉、血便等臨床癥狀。將病死動物的腸道組織用無血清 DMEM培養(yǎng)液(加入青霉素、鏈霉素濃度各為1 000 U/mL)制成 20%(V/V)懸液,凍融1次,以 5 000 r/min 離心10 min,吸取上清,用0.22 μm濾膜除菌,-80 ℃ 保存用于病毒分離。

1.2 主要試劑

貓腎細胞(CRFK細胞)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所保存；FITC標(biāo)記抗CPV熒光抗體購自VMRD公司；新生牛血清購自天津灝洋生物材料有限公司；細胞培養(yǎng)基MEM和胰酶均購自HyClone公司；DNA 提取試劑盒、Pfu聚合酶均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA Marker和pMD18-T載體均購自TaRaKa公司。

1.3 病毒分離

CRFK細胞長滿單層后，用胰酶消化成單個細胞，以40%的細胞密度鋪入6孔細胞培養(yǎng)板，將制備的病毒樣品采用同步接毒方法接種于上述CRFK細胞，同時設(shè)正常細胞對照,然后放入37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),每天觀察細胞狀態(tài)和病變情況，當(dāng)細胞病變效應(yīng)(CPE)達到80%時，反復(fù)凍融3次后收獲病毒于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 血凝試驗

參照《中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(2001)》[12]進行微量血凝試驗，分別用1%豬、雞、綿羊和人“O”型血紅細胞懸液測定第3代細胞培養(yǎng)物的血凝性，以50%以上紅細胞出現(xiàn)凝集判定為陽性。

1.5 免疫熒光試驗鑒定分離病毒

將收集的第3代病毒液同步接種于96 孔板內(nèi)生長狀態(tài)良好的CRFK細胞，同時以不接毒的正常細胞作為陰性對照，37 ℃恒溫培養(yǎng) 60 h；棄去 96 孔板中的上清液，PBS 溫和洗滌 3 次，加入預(yù)冷的固定液(甲醇∶丙酮=1∶3)，4 ℃固定 30 min。棄去固定液，每孔加入 100 μL PBS 洗滌，洗滌 3次后，加入 FITC標(biāo)記的抗CPV熒光抗體，每孔50 μL，37 ℃孵育 40 min，PBS 洗滌3次后，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.6 病毒形態(tài)觀察

將收集到的第3代病毒液反復(fù)凍融3次后，以4 ℃、5 000 r/min離心10 min，取上清液進行磷鎢酸負染，電鏡觀察。

1.7 病毒DNA提取與VP2基因克隆

按照病毒DNA快速提取試劑盒說明書提取病毒DNA，擴增VP2 基因。參照NCBI數(shù)據(jù)庫肉食獸細小病毒VP2 基因保守區(qū)設(shè)計擴增引物，引物序列為：VP2F：5′-CATGAGTGATGGAGCAGTTC-3′；VP2R：5′-CTATGTTAATATAATTTTCT-3′。引物由上海英駿生物有限公司合成。PCR反應(yīng)體系50 μL:2×TransStart FastPfuFly PCR SuperMix 25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL,模板2.0 μL，ddH2O補至50 μL。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體中，克隆產(chǎn)物送上海英濰捷基生物工程有限公司進行測序。

1.8 VP2基因遺傳進化分析

使用DNAStar軟件對分離毒株VP2基因序列與GenBank中檢索的不同基因型細小病毒VP2基因進行序列比對分析，并根據(jù)VP2基因中關(guān)鍵氨基酸位點對分離毒株進行基因型鑒定,應(yīng)用Mega 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié) 果

2.1 病毒分離培養(yǎng)

病料樣品接種于生長狀態(tài)良好的CRFK細胞后，第4天出現(xiàn)CPE,呈現(xiàn)單個細胞圓縮、脫落，拉網(wǎng)等病變，而對照細胞生長狀態(tài)良好，未出現(xiàn)CPE(圖1)。隨著傳代次數(shù)的增加,CRFK細胞的病變更為明顯。

A，正常CRFK細胞;B，接毒后CRFK細胞。下同 A，Normal CRFK cells;B，Infected CRFK cells. The same as below圖1 分離株接種CRFK細胞后的CPE(100×)Fig.1 CPE of the isolated strain infected CRFK cells (100×)

2.2 血凝試驗

分別用豬、雞、綿羊、和人“O”型紅細胞測定分離毒株的第3代細胞培養(yǎng)物的血凝特性，結(jié)果顯示，該分離毒株僅對豬紅細胞發(fā)生凝集作用，其余紅細胞均不發(fā)生凝集，對豬紅細胞血凝效價為1∶512。

2.3 免疫熒光試驗鑒定病毒

將第3代病毒感染CRFK細胞60 h后，以FITC標(biāo)記的抗CPV熒光抗體進行免疫熒光試驗,在倒置熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示,分離病毒感染的CRFK細胞內(nèi)有特異性亮綠色熒光,對照CRFK細胞無熒光(圖2)。

圖2 免疫熒光試驗鑒定分離病毒(100×)Fig.2 Identification of the isolated strain by direct immunofluorescence assay (100×)

2.4 病毒形態(tài)電鏡觀察

在電鏡下觀察到無囊膜球形病毒粒子，大小約20 nm(圖3),與細小病毒粒子形態(tài)一致。

圖3 分離毒株電鏡形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果(40 000×)Fig.3 Electron microscopic observation of the isolated strain (40 000×)

2.5 VP2基因克隆

應(yīng)用VP2基因引物對第3代病毒的DNA進行擴增，得到大小約為1 750 bp的目的片段(圖4)，與預(yù)期片段大小相符，經(jīng)過克隆后測序，確定為細小病毒基因序列，將此分離毒株命名為MPCPV-SX。

M，DL2000 DNA Marker;1,分離毒株VP2 基因擴增產(chǎn)物;2,陰性對照 M，DL2000 DNA Marker;1,VP2 gene of the isolated strain;2,Negative control圖4 分離毒株 VP2 基因PCR擴增電泳圖Fig.4 PCR amplification result of VP2 gene of the isolated strain

2.6 遺傳進化分析

將MPCPV-SX的VP2 基因序列上傳 GenBank，獲得的登錄號為KC262178。將VP2基因與數(shù)據(jù)庫中的20個不同基因型的細小病毒的VP2基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)該果子貍來源的細小病毒MPCPV-SX的VP2基因與犬細小病毒處于同一分支，但進化樹位于CPV-2和CPV-2a型之間(圖5)。

圖5 VP2基因系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of VP2 gene

對VP2氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，該分離毒株VP2氨基酸序列的87位氨基酸為亮氨酸(L)、101位氨基酸為蘇氨酸(T)、300位氨基酸為丙氨酸(A)，305位氨基酸為天冬氨酸(D),其余細小病毒VP2蛋白常見的氨基酸突變位點與CPV-2型毒株一致(表1)。

表1 MPCPV-SX株與不同肉食獸細小病毒VP2蛋白氨基酸序列變異位點比對Table 1 Comparison of amino acid sequence variation sites of VP2 protein between MPCPV-SX strain and different Carnivorous parvoviruses

3 討 論

犬細小病毒發(fā)現(xiàn)于1978年，被認為是貓細小病毒的變異株，是由貓細小病毒樣病毒通過適應(yīng)野生肉食動物進化而來[13-14]。CPV-2自出現(xiàn)以來進化迅速，一些新的抗原和基因變異體出現(xiàn)并在全球范圍內(nèi)傳播[15-18]。出現(xiàn)了CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c等新型毒株。CPV除能感染犬外，還能感染狐貍、狼等犬科動物，而CPV-2a和CPV-2b還能感染貓、虎、熊、果子貍等動物。而出現(xiàn)這種感染宿主范圍變化的原因與新毒株VP2衣殼蛋白氨基酸變化密切相關(guān)。與CPV-2型毒株相比，所有犬源的CPV-2a 型分離毒株的VP2衣殼蛋白都具有4個獨特的氨基酸突變點，分別為87、101、300和305位氨基酸。這些變異體使新毒株不僅能感染犬科動物，且恢復(fù)了感染貓的能力(CPV-2中失去的特性)[19]。

本研究應(yīng)用CRFK細胞從患有腸炎的果子貍腸道組織樣品中分離到1株病毒，通過血凝試驗、免疫熒光試驗確定分離毒株為細小病毒。果子貍在分類學(xué)上屬于靈貓科，基因進化分析其感染的病毒屬于犬細小病毒，與貓細小病毒和水貂細小病毒等距離較遠，因此在應(yīng)用疫苗免疫時可考慮采用犬細小病毒預(yù)防。進一步分析其VP2基因的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，MPCPV-SX在87和101位氨基酸上與CPV-2a 相同，但在300和305位氨基酸上與CPV-2相同。VP2基因序列的系統(tǒng)進化樹分析也顯示了本次分離的毒株處在 CPV-2和 CPV-2a 序列之間的中間位置。

野生動物一直被認為是病毒的混合器，很多野生動物都是多種病原體攜帶者、中間宿主或是傳染源。果子貍就是其中之一，果子貍攜帶多種體內(nèi)寄生蟲包括旋毛蟲、斯氏貍殖吸蟲等，其還是嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)的中間宿主及狂犬病病毒的攜帶者。病毒在果子貍體內(nèi)與宿主相互作用可能對于病毒遺傳演化發(fā)揮重要作用[11,20]。細小病毒是果子貍常感染的病毒，研究報道表明果子貍可感染貓細小病毒和犬細小病毒[21]，而國內(nèi)學(xué)者在果子貍中分離到細小病毒均屬于犬細小病毒，2003年趙忠鵬等[22]報道分離到果子貍細小病毒毒株P(guān)V/GZL/HN/1/02與Chen等[23]2011年所分離的果子貍細小病毒毒株MCPV(GQ502462)均屬于CPV-2a，這2株病毒VP2蛋白關(guān)鍵位點除了在300位氨基酸處有1個突變(從 Gly到Ser)外，其余均與CPV-2a型一致。而柴秀麗等[24]2008年報道從河南某地送檢的果子貍糞便中分離的2株果子貍源細小病毒PV/PL/HeN02/08(EU441279)和PV/PL/HeN03/08(EU441280)，鑒定認為屬于CPV-2a突變株，其中PV/PL/HeN02/08(EU441279)毒株與本研究所分離的毒株MPCPV-SX在這4個位置關(guān)鍵氨基酸(87、101、300和305)的突變完全一致。而另一毒株P(guān)V/PL/HeN03/08(EU441280)的4個關(guān)鍵氨基酸位點與CPV-2a 完全相同，除了在297位有一個Ser到Ala的突變。出現(xiàn)以上結(jié)果可能是由于不同基因型細小病毒感染果子貍后，在其體內(nèi)發(fā)生基因重組引起，也有可能類似于犬細小病毒變異于貓細小病毒一樣，是CPV-2適應(yīng)果子貍進化而來。果子貍源細小病毒的基因序列也可能代表了一種介于 CPV-2和 CPV-2a 之間進化中間狀態(tài)的病毒,進一步的結(jié)論還需要對不同地區(qū)來源的更多毒株的長時間監(jiān)測。

4 結(jié) 論

本研究應(yīng)用CRFK細胞成功從果子貍腸道組織樣品中分離到1株細小病毒，并命名為MPCPV-SX。經(jīng)VP2基因和關(guān)鍵位點氨基酸序列分析表明其是介于CPV-2和CPV-2a 之間進化中間狀態(tài)的病毒。