徐民生，柯海意，楊冬霞，施科達(dá)，孫澤儀，牛佳偉，常 鑫，翟少倫，臧瑩安，李春玲

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，廣州 510305；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所，廣東省畜禽疫病 防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，廣州 510640)

胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)是一種引起豬傳染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumia，PCP)的革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌，其定植于豬上呼吸道且具有高度傳染性，可感染各年齡段豬并引發(fā)急性或慢性纖維出血性壞死性肺炎癥狀，嚴(yán)重情況下會(huì)導(dǎo)致死亡[1]。根據(jù)對煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)的生長依賴性可將APP分為生物Ⅰ型和生物Ⅱ型[2]。Apx毒素在APP致病過程中起著重要作用，其中ApxⅣ在所有血清型的APP中均可分泌產(chǎn)生，可用于鑒別APP[3]。目前，基于衣殼多糖(CPS)的組成有19個(gè)公認(rèn)的血清型，各血清型流行率具有一定的地理差異，治療和防控此病仍依賴于抗生素和疫苗[4]。APP引起的急性或慢性病癥導(dǎo)致較高的死亡率或治療費(fèi)用，給全球養(yǎng)殖業(yè)造成了重大損失[5]。

自1995年第一個(gè)完整的細(xì)菌基因組序列公布以來，全基因組測序技術(shù)(whole genome sequencing,WGS)得到了蓬勃發(fā)展[6]。從傳統(tǒng)的Sanger測序到基于Illumina平臺(tái)的第二代測序和PacBio平臺(tái)的第三代測序，不僅提高了完整基因組的組裝速度和質(zhì)量，所需的時(shí)間和費(fèi)用也逐步縮短和降低。全基因組測序技術(shù)作為一種有力測序工具在病原體的表征和流行病學(xué)調(diào)查中的運(yùn)用也越來越多[7]。Li等[8]研究表明，全基因組測序技術(shù)可用來預(yù)測抗生素的耐藥性，識(shí)別新的血清型以便用于研究藥物和疫苗的作用靶點(diǎn)。全基因組序列正迅速成為預(yù)測APP生物信息的有利工具，尤其是對于了解相關(guān)菌株基因特征和進(jìn)化關(guān)系具有重要意義[9]。

本研究以先前從廣東省某發(fā)病豬場分離到的1株胸膜肺炎放線桿菌GD2107株為研究對象，藥敏結(jié)果顯示其具有多重耐藥性。為進(jìn)一步探索其致病和耐藥機(jī)理，使用Illumina NovaSeq和PacBio SequeI測序平臺(tái)進(jìn)行全基因組測序和組裝，通過生物信息學(xué)分析軟件進(jìn)行基因功能注釋，了解其攜帶的耐藥基因、毒力基因情況，分析菌株間親緣關(guān)系，揭示菌株耐藥與進(jìn)化關(guān)系的相關(guān)性，以期為豬傳染性胸膜肺炎的基礎(chǔ)研究提供一個(gè)新的視角與借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 APP GD2107于2021年7月分離自廣東省某規(guī)?；l(fā)病豬場感染傳染性胸膜肺炎病死豬的肺部，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所豬病研究室分離、鑒定和保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB培養(yǎng)基)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)均購自北京索萊寶科技有限公司；小牛血清購自廣州蕊特生物科技有限公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、2×FastTaqPremix酶、DL2000 DNA Marker均購自TaKaRa公司。電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PCR儀購自杭州晶格科學(xué)儀器有限公司；電泳儀購自北京市六一儀器廠；顯微鏡購自O(shè)lympus公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)及ApxⅣ基因擴(kuò)增 將菌株GD2107凍存液以1∶100的比例加入含0.1% NAD和5%牛血清的TSB培養(yǎng)液中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 h。使用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取基因組DNA。參考Zhang等[10]合成ApxⅣ基因特異性引物，引物序列為：F：5′-TTATCCGAA-CTTTGGTTTAGCC-3′；R：5′-CATATTTGATA-AAACCATCCGTC-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段長度為418 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以提取的基因組DNA為模板對菌株進(jìn)行鑒定，PCR反應(yīng)體系25 μL：2×rTaqMix 酶12.5 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各0.5 μL，DNA 模板1.0 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，將ApxⅣ基因陽性PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，菌株GD2107基因組DNA送至上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行全基因組測序。

1.2.2 藥敏試驗(yàn) 采用K-B藥敏紙片法對分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。將分離菌株接種至含有5%牛血清及0.1% NAD的TSB培養(yǎng)基中，制成含菌量約為0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?，吸?00 μL并用無菌棉簽均勻涂布于TSA平板(含0.1% NAD和5%牛血清)表面，待液體吸干后用無菌鑷子夾取抗生素藥敏紙片貼在平板表面，置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)30 min，后倒置培養(yǎng)12～18 h，記錄抑菌圈直徑并參照杭州微生物試劑有限公司提供的判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定。

1.2.3 全基因組測序 采用全基因組鳥槍法(whole genome shotgun，WGS)策略構(gòu)建PE和S10K2個(gè)不同片段的文庫，分別利用Illumina NovaSeq和PacBio SequeI測序平臺(tái)對GD2107株進(jìn)行全基因組測序。采用FastQc(v 0.11.7)[11]軟件和AdapterRemoval(v 2.1.7)[12]和SOAPec(v 2.0)軟件[13]對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制和過濾。使用HGAP(v 4.0)[14]和CANU(v 1.7.1)[15]軟件進(jìn)行拼裝，得到contig序列后用pilon(v 1.22)[16]軟件對結(jié)果進(jìn)行校正，最終拼接得到完整序列。

1.2.4 基因組圈圖繪制 首先將基因組序列、基因組預(yù)測及非編碼RNA的預(yù)測信息整合成標(biāo)準(zhǔn)的GBK(GenBank)格式文件；然后采用cgview[17](http:∥stothard.afns.ualberta.ca/cgview_server)繪制該基因組的圈圖；最后采用Photoshop CS對該圖進(jìn)行編輯。

1.2.5 功能元件分析 采用不同生物信息學(xué)分析軟件對組裝后的基因組、非編碼RNA(ncRNA，主要類型包括sRNA、rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA及miRNA等)、CRISPRs功能元件、原噬菌體(prophage)、基因島(genomics islands，GIs)進(jìn)行預(yù)測。用GeneMarkS(v 4.32)[18]軟件預(yù)測GD2107全基因組基因序列；用tRNAscan-SE(v 1.3.1)[19]預(yù)測全基因組中的tRNA基因；用Barrnap(v 0.9)預(yù)測rRNA基因，其余ncRNA主要通過與Rfam(v 14.1)[20]數(shù)據(jù)庫比對進(jìn)行預(yù)測；用CRISPR finder(v 20170509)[21]預(yù)測全基因組中的正向重復(fù)序列和間隔區(qū)；用PhiSpy[22](http:∥phaster.ca)預(yù)測基因組中存在的原噬菌體；用IslandViewer4[23](http:∥www.pathogenomics.sfu.ca/islandviewer)預(yù)測基因組中存在的GIs。

1.2.6 蛋白編碼基因功能注釋 將所有預(yù)測得到的蛋白編碼基因與數(shù)據(jù)庫中包含的蛋白編碼基因進(jìn)行比對，若兩者具有顯著的序列相似性，則可初步確定其編碼合成的蛋白具有相似甚至是相同的功能；采用diamond(v 0.9.10.111)軟件完成序列比對[24]。序列比對的臨界值選取為1e-6。序列的功能判別規(guī)則為：E-value<1e-6。

1.2.7 亞系統(tǒng)分析 對組裝后的GD2107基因組進(jìn)行碳水化合物活性酶(CAZy)、毒力因子(VFDB)和耐藥因子(CARD)相關(guān)亞系統(tǒng)的信息學(xué)分析：采用hmmscan[25]軟件與CAZy數(shù)據(jù)庫比對來預(yù)測全基因組中存在的CAZy酶類基因；通過與VFDB[26]和CARD數(shù)據(jù)庫[27]進(jìn)行BLAST比對，預(yù)測存在的毒力基因和耐藥基因。

1.2.8 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 將測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對。選取NCBI數(shù)據(jù)庫中與GD2107株相似性相近的14條序列(表1)，利用Mega 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1 參考菌株信息Table 1 Reference strain information

2 結(jié) 果

2.1 ApxⅣ基因擴(kuò)增結(jié)果

采用針對APP菌種的特異性引物ApxⅣ基因擴(kuò)增，結(jié)果獲得大小為418 bp的特異性條帶(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相符。

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株GD2107只對氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、頭孢唑啉(先鋒Ⅴ)敏感，對青霉素、頭孢拉定(先鋒Ⅵ)、卡那霉素、鏈霉素等14種抗菌藥耐藥(表2)。

2.3 GD2107株的基因組結(jié)構(gòu)與分析

由圖2可知，GD2107株的全基因組包括1條大小為2 271 987 bp大小的環(huán)狀染色體，GC含量為41.21%，另存在2條大小為5 027和3 497 bp的環(huán)狀質(zhì)粒，GC含量分別為44.06%和36.06%。最后將基因組序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫中，得到對應(yīng)的染色體GenBank的登錄號(hào)為CP097377，2條質(zhì)粒的GenBank登錄號(hào)分別為CP097378和CP097379。

M，DL2000 DNA Marker；-，陰性對照；+，陽性對照；1，分離株 M，DL2000 DNA Marker; -，Negative control; +，Positive control; 1，The isolate圖1 分離株ApxⅣ基因PCR鑒定結(jié)果Fig.1 PCR identification results of ApxⅣ gene in the isolates

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Drug sensitivity test result mm

從內(nèi)到外，第1圈代表刻度；第2圈代表GC Skew；第3圈代表GC含量；第4、7圈代表每一個(gè)CDS所屬的COG；第5、6圈代表CDS、tRNA及rRNA在基因組上的位置 From inside to outside,the first circle represents the scale;The second circle represents GC Skew;The third circle represents GC content;The fourth and seventh circles represent the COG of each CDS;The positions of CDS,tRNA and rRNA in the genome in the fifth and sixth cycles圖2 胸膜肺炎放線桿菌GD2107全基因組染色體圈圖Fig.2 Circular map of Actinobacillus pleuropneumoniae GD2107 chromosome

測序得到的開放閱讀框(ORF)數(shù)量有2 290個(gè)，總長度為1 972 470 bp，占全基因組的86.82%；在非編碼RNA(ncRNA)中含有tRNA基因21個(gè)，rRNA基因19個(gè)(其中5S rRNA基因7個(gè)，16S rRNA基因6個(gè)，23S rRNA基因6個(gè))，其他ncRNA基因20個(gè)；使用PhiSpy預(yù)測基因組中存在的4個(gè)原噬菌體；經(jīng)CRISPR finder預(yù)測發(fā)現(xiàn)菌株含有2組CRISPR相關(guān)序列；通過IslandViewer4預(yù)測到菌株GD2107基因組中有23個(gè)基因島；基因組結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果見表3。

表3 基因組序列基本信息Table 3 Basic information of genome sequence

2.4 蛋白編碼基因功能注釋

將GD2107株基因的蛋白序列與表4中的功能數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，對于每一條序列選取得分最高的比對結(jié)果進(jìn)行注釋；GD2107株的全基因組共有2 290個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，其中，分別有2 263、1 979、2 112、1 549、1 866、1 735、514、557個(gè)基因在NR、Swiss-Prot、COG、KEGG、GO、Pfam、TCDB、PHI數(shù)據(jù)庫中得到注釋(表4)。

表4 蛋白編碼基因功能注釋匯總Table 4 Summary of protein coding gene function annotations

2.4.1 COG數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果 結(jié)果顯示，共注釋到2 112個(gè)蛋白，占全部基因的92.23%，分布于25個(gè)COG的條目中(圖3)，其中，參與復(fù)制、重組和修復(fù)的基因有166個(gè)，占7.25%；參與翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成的基因有179個(gè)，占7.82%；與細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、胞外被膜生物合成相關(guān)的基因有200個(gè)，占8.73%；參與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的基因有173個(gè)，占7.55%；與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基因有84個(gè)，占3.67%。

圖3 COG功能分類圖Fig.3 COG function classification diagram

2.4.2 KEGG和GO注釋結(jié)果 GD2107菌株主要富集在碳水化合物代謝、膜運(yùn)輸、輔助因子、維生素代謝和氨基酸這些代謝途徑，也是維持細(xì)菌新陳代謝所必需的。經(jīng)KEGG注釋可分為8類45個(gè)功能條目(圖4)，其分別注釋為31.9%新陳代謝、7.1%遺傳信息處理、6.5%環(huán)境信息處理、3.1%細(xì)胞過程、2.9%人類疾病及1.6%生物體系統(tǒng)，其中每一類型又包含有各自的亞型。

圖4 GD2107基因組KEGG功能注釋結(jié)果Fig.4 Results of KEGG functional annotation of GD2107 genome

通過GO注釋，共有1 866個(gè)基因，其基因產(chǎn)物共分為三大類：生物過程(biological process,BP)占45.4%；分子功能(molecular function,MF)占23.1%；細(xì)胞組分(cellular component,CC)占31.5%(圖5)。表明該菌株的基因產(chǎn)物主要集中在生物過程方面，其中大量基因與生物過程、細(xì)胞氮化合物代謝、生物合成和小分子代謝有關(guān)；在細(xì)胞組分方面，GD2107主要與細(xì)胞、細(xì)胞位置、胞外區(qū)、細(xì)胞質(zhì)和漿膜等相關(guān)；在分子功能方面，主要與分子功能、離子結(jié)合等相關(guān)。

圖5 GD2107基因組GO功能注釋結(jié)果Fig.5 Results of GO functional annotation of GD2107 genome

2.4.3 TCDB和PHI注釋結(jié)果 TCDB第一級(jí)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖6。由圖6可知，共有514個(gè)基因注釋到TCDB數(shù)據(jù)庫的9個(gè)功能分類中，分別為：通道/孔隙(channels/pores)80個(gè)基因；電化學(xué)勢驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)體(electrochemical potential-driven transporters)116個(gè)基因；主要活性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(primary active transporters)221個(gè)基因；轉(zhuǎn)錄組(group translocators)21個(gè)基因；跨膜電子載體(transmembrane electron carriers)17個(gè)基因；運(yùn)輸中涉及的附屬因素(accessory factors involved in transport)6個(gè)基因；不完全表征的運(yùn)輸系統(tǒng)(incompletely characterized transport systems)53個(gè)基因。

圖6 TCDB功能分類圖Fig.6 TCDB functional classification diagram

病原體PHI表型突變類型基因數(shù)目的統(tǒng)計(jì)情況見圖7。由圖7可知，這557個(gè)基因中有3個(gè)突變后致病菌株具有化學(xué)耐受性、2個(gè)具有化學(xué)敏感性、3個(gè)突變成效應(yīng)子、42個(gè)突變后毒力增加、39個(gè)喪失致病性、338個(gè)突變后毒力降低、122個(gè)突變后不受影響。

圖7 病原體PHI表型突變類型分布圖Fig.7 Distribution of PHI phenotype mutation types of pathogens

2.5 亞系統(tǒng)分析結(jié)果

2.5.1 CAZy數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果 由圖8可知，GD2107株中有72個(gè)基因注釋到CAZy數(shù)據(jù)庫中，其中包含與糖基轉(zhuǎn)移酶(GTs)相關(guān)基因35個(gè)、多糖裂解酶基因2個(gè)、糖類脂解酶基因10個(gè)、氧化還原酶基因6個(gè)、碳水化合物基因5個(gè)、糖苷水解酶基因14個(gè)。

圖8 CAZy功能分類圖Fig.8 CAZy function classification diagram

2.5.2 VFDB基因預(yù)測分析結(jié)果 將GD2107株全基因序列與致病菌毒力因子綜合數(shù)據(jù)庫VFDB進(jìn)行比對，共注釋到48個(gè)毒力基因，其中毒力因子脂寡糖(lipooligosaccharide，LOS)和莢膜(capsule)的基因占比最大(70.8%)。質(zhì)粒中并不存在毒力基因。

2.5.3 CARD分析 將測序序列與CARD進(jìn)行比對分析，共獲得了22個(gè)耐藥基因，分別為aph(3″)-Ⅰb、macA、macB、sul3、tet34、tet35、tetO、parC、parE、gyrA、gyrB、floR、rpoB、rpoC、dfrA3、hns、tuf2、golS、folP、crp和cpxR，且分別對應(yīng)表5中的抗菌藥，其中氟苯尼考藥物的耐藥基因floR位于質(zhì)粒上。

表5 GD2107株耐藥基因及相對應(yīng)抗菌藥Table 5 Resistance genes and corresponding antibiotics of GD2107 strain

2.6 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將PCR擴(kuò)增得到的APP菌株經(jīng)ApxⅣ基因擴(kuò)增后進(jìn)行測序，并將測序結(jié)果與14株參考菌株進(jìn)行序列相似性比對分析，系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，GD2107株與中國APP5株(CP063424.1)進(jìn)化關(guān)系最近，處在同一分支；其次是中國分離株JL03株(CP000687.1);與韓國KL16、瑞士CVJ13216、瑞士WF83、愛爾蘭S405等地的分離株進(jìn)化關(guān)系均較近；而與美國NCTC11384、英國MDG2331、加拿大L20、匈牙利A-85/14、德國AP76、中國APP6、瑞士P1875、丹麥NCTC10976等APP分離株進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)(圖9)。

圖9 GD2107分離株基于ApxⅣ基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.9 Phylogenetic tree of GD2107 isolate based on ApxⅣ gene sequence

3 討 論

APP是一種臨床上常見的呼吸道病原菌，已成為目前影響豬場經(jīng)濟(jì)效益的重要細(xì)菌性疾病之一[28]。近年來隨著飼料“禁抗”政策的推行和養(yǎng)殖場抗生素的濫用導(dǎo)致耐藥性APP的滋生和擴(kuò)散，這提示應(yīng)長期對APP耐藥性進(jìn)行監(jiān)測，盡量減少由APP感染引起的潛在危險(xiǎn)[29]。

全基因組測序技術(shù)的快速發(fā)展給研究微生物多樣性、進(jìn)化及物種間相互作用帶來了新的手段，利用全基因組測序技術(shù)進(jìn)行DNA水平的測序分析已成為近年來的發(fā)展趨勢[30]，盡管細(xì)菌基因組信息的獲取變得越來越容易，然而對APP完整基因序列的報(bào)道和研究相對較少。本研究所用GD2107株是從臨床上1頭發(fā)病豬的肺臟中分離得到的多重耐藥菌株。通過全基因組測序和生物信息學(xué)分析了解GD2107株的基因組結(jié)構(gòu)和功能，豐富了APP的基因組數(shù)據(jù)庫，為進(jìn)一步探明其致病機(jī)制和耐藥機(jī)制提供重要的生物信息學(xué)依據(jù)。

通過PacBio及Illumina測序平臺(tái)的相互結(jié)合，高效并準(zhǔn)確地完成了對GD2107株全基因組的測序。測序到的蛋白質(zhì)編碼基因經(jīng)GO、KEGG和COG數(shù)據(jù)庫注釋分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)數(shù)據(jù)庫的注釋結(jié)果高度一致，基因富集程度最高的都在代謝過程，這說明了代謝過程對于維持細(xì)菌的生命至關(guān)重要[31]。碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域能通過結(jié)合CAZy的底物提高CAZy催化底物的活性[32]。從注釋結(jié)果可知，糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷水解酶在GD2107株的碳水化合物活性酶中占比較大(68.1%)。特定的糖苷水解酶可使結(jié)構(gòu)多糖酶解，這是碳水化合物跨環(huán)境轉(zhuǎn)運(yùn)的基本過程，而糖基轉(zhuǎn)移酶是參與合成天然糖基結(jié)構(gòu)的CAZy，高效的糖基轉(zhuǎn)移酶對天然產(chǎn)物的糖基化至關(guān)重要，會(huì)影響其藥理特性，從而對宿主的臨床治療起指導(dǎo)作用，也為生物技術(shù)和制藥開辟了廣闊的可能性[33]。

毒力因子是衡量微生物毒性的重要指標(biāo)，是引起宿主發(fā)病的重要因素[34]。GD2107株有48個(gè)毒力因子得到注釋，其中毒力因子中脂寡糖和莢膜的基因最多(70.8%)。由黏性表層組成的莢膜是APP的基本結(jié)構(gòu)成分和致病因子，在感染過程中為保護(hù)細(xì)菌免受宿主防御提供了一種免疫學(xué)機(jī)制[35]。脂寡糖是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的一種結(jié)構(gòu)成分，同脂多糖結(jié)構(gòu)相似，生物功能也相近。其他被注釋的毒力因子還包括溶血素和黏菌素，與APP產(chǎn)生相互依賴的代謝生態(tài)系統(tǒng)相關(guān)，與蛋白酶相關(guān)的毒力因子具有防止吞噬作用和誘導(dǎo)膿腫形成的膠囊的作用，水解酶和脂多糖等毒力因子與降解免疫球蛋白和補(bǔ)體成分有關(guān)[36]。在毒力基因中，由某些基因共同調(diào)控形成的生物膜構(gòu)成了抗生素耐藥的第一道防線。

APP的多重耐藥表現(xiàn)通常與其同時(shí)攜帶多種耐藥基因有關(guān)。Bossé等[33]和Liu等[37]研究顯示，除了大環(huán)內(nèi)酯類藥物外，全基因組測序技術(shù)可準(zhǔn)確地預(yù)測APP對所測試的抗菌藥的耐藥性。經(jīng)全基因組測序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，在GD2107株中存在22種耐藥基因。四環(huán)素是最早用于臨床治療PCP的主要藥物，APP對四環(huán)素的耐藥現(xiàn)象也已被廣泛發(fā)現(xiàn)[38]。本試驗(yàn)藥敏檢測結(jié)果和測序到的耐藥基因(tetO基因等)同樣顯示,GD2107株對四環(huán)素類藥物耐藥。Chang等[39]報(bào)道位于質(zhì)粒上的耐藥基因blaROB-1可介導(dǎo)APP菌株間阿莫西林的耐藥性。GD2107株攜的耐藥基因(floR基因)也位于質(zhì)粒上，推測可能與APP自身的耐藥性和不同菌株間的傳播有關(guān)，這增加了臨床防控APP等細(xì)菌感染的難度。Kwong等[40]對肺炎克雷伯菌研究顯示，抗生素的耐藥基因在人類攜帶的分離株中也很常見，這些感染通常缺乏與侵襲性疾病相關(guān)的基因；COG注釋結(jié)果中GD2107株存在大量與基因重組、基因轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因。這提示毒力與抗性基因的整合可能會(huì)導(dǎo)致變異強(qiáng)毒株的出現(xiàn)。因此，未來在疫苗研發(fā)時(shí)，除了需要充分了解菌種的生物學(xué)信息外，也需敲除其自身所攜帶的耐藥基因和毒力基因等，以防止或減少細(xì)菌水平基因轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)化，保證疫苗產(chǎn)品的安全高效[41]。

本研究通過構(gòu)建GD2107株的基因ApxⅣ系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，GD2107株與來自中國的APP分離株(CP063424.1)處在同一分支，進(jìn)化關(guān)系最近；同國外的APP分離株進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，較符合疾病的流行規(guī)律，這與Donà等[42]研究APP的流行具有一定的地域流行性這一結(jié)論一致，為該病的流行病學(xué)調(diào)查提供了一定參考。

4 結(jié) 論

本研究完成了對菌株GD2107的全基因組測序與生物信息學(xué)分析，全面認(rèn)識(shí)了該菌株基因組的結(jié)構(gòu)和功能并探究了與耐藥和致病機(jī)制中的相關(guān)基因，結(jié)果表明菌株GD2107呈多重耐藥性且攜帶多種毒力和耐藥基因，進(jìn)化關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)該菌株與國內(nèi)分離株親緣關(guān)系最近，具有一定的地域流行性。本研究為預(yù)防PCP的疾病流行和探索APP的致病機(jī)制提供了參考。