朱怡萱，劉詩芃，張 偉，李金榮，彭 菲，林 娜，王語嫣，劉丹丹

(1.新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，烏魯木齊 830052；2.滿洲里海關技術中心，滿洲里 021400)

馬腺疫是一種以呼吸道感染、咽后淋巴結膿腫為特征的馬屬動物傳染病[1],馬鏈球菌馬亞種作為其主要致病菌，最早于1888年被分離鑒定，屬于蘭氏分群C群β溶血型鏈球菌，革蘭氏染色呈紫色，單個菌體呈圓球狀，通常成對或短鏈狀存在，在含有5%綿羊血清的培養(yǎng)基上生長良好，有明顯的β溶血環(huán)[2]。馬鏈球菌馬亞種傳染性極強，導致馬腺疫的發(fā)病率居高不下[3]，其發(fā)病是否與季節(jié)相關，目前仍存在爭議，因為各國所處的氣候帶不同，英國、印度的氣候對馬鏈球菌馬亞種流行影響較小[4-5]，在加拿大其冬季發(fā)病率高[6-7]，在巴基斯坦早春發(fā)病率高[8]，在中國每年的9月至來年4月期間發(fā)病率高[9]。從2015至2017年的血清學調查中發(fā)現(xiàn)，新疆地區(qū)每年廠區(qū)馬腺疫的陽性率均可達20%以上[10-13]，對當?shù)伛R養(yǎng)殖產業(yè)造成嚴重的經濟損失。近年來，馬腺疫治療主要采取抗生素結合排膿的方法進行，但因長期使用抗生素造成菌株耐藥、食品安全等一系列公共衛(wèi)生問題[10，14]。因此尋找一種療效好、低殘留的天然藥物迫在眉睫[15]。

馬腺疫在中國流行時間可追溯甚遠，在諸多馬病名著中均有記載，書中也描述了馬腺疫的病因癥候?！对喁燅R集》中記載“因蓄養(yǎng)失調，喂飲無節(jié)，春不抽六脈之血，夏失灌清涼之藥，以致氣血太盛，熱積心胸，傳之與咽喉，故成其患[16]?！庇纱丝芍R腺疫主要是因為心胸積熱、氣血紊亂所致。目前對于馬腺疫的治則是“泄心肺、清咽喉、補氣養(yǎng)血”[17]，圍繞該治則也有相應的中藥組方，如：黃芪散[18]、仙方活命飲[18]、清咽利膈湯[18]、閻超山祖?zhèn)髅胤絒19]、加味黃茂散[20]、六神青黛散(含服)[21]等，但多為臨床經驗自擬，存在以下幾個問題：試驗動物數(shù)量有限，治療效果不具有代表性；中藥組方毒性不明確；最佳給藥濃度無定值；這些因素導致上述組方并沒有在臨床治療上廣泛應用，使其在國內外的推廣應用面臨巨大困難?；诖耍狙芯扛鶕?jù)中獸醫(yī)辨證理論，選取了多味具有涼血解毒、逐瘀通經、降熱止咳、安神止痛、益氣養(yǎng)血的中藥，通過中藥對馬腺疫主要致病菌——馬鏈球菌馬亞種的體外抑菌試驗，結合正交試驗設計以及模型動物(小鼠)體內抑菌試驗，篩選治療馬腺疫的最佳組方，以期為臨床選用中獸藥治療馬腺疫提供參考，為中獸藥研發(fā)及相關的馬屬動物疾病基礎研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 標準菌株：馬鏈球菌馬亞種(Streptococcusequisubspeciesequi，S.equi)(ATCC9528)由新疆農業(yè)大學中獸醫(yī)實驗室保存；試驗菌株：馬鏈球菌馬亞種是由昭蘇地區(qū)患馬腺疫馬匹的鼻拭子中分離得到的強毒株。

1.1.2 動物 80只6周齡SPF級昆明小鼠，體重為20 g±2 g，雌雄各半，購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心(【SCXK(新)2018-0002】【SYXK(新)2018-0003】)，飼養(yǎng)于新疆農業(yè)大學動物實驗室，飼養(yǎng)期間各組小鼠自由飲水，飼喂Co60輻照實驗鼠維持飼料(美迪森生物【蘇飼證(2018)10030】)。飼養(yǎng)環(huán)境：恒溫恒濕，所有操作均符合新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學實驗倫理要求(審批號：2019018)。

1.1.3 藥材 浙貝母(2109158)、大黃(2201080)、苦參(2104064)、山豆根(2010158)、赤芍(2112073)、甘草(2112171)、蒲公英(2111031)、知母(2110073)、黃芩(2112083)、雪白睡蓮(2106051)、黃連(2110039)、荊芥(2111100)、薄荷(2110083)、射干(2109143)、連翹(2111051)、黃藥子(2010136)、苦楝皮、白芷(2109133)、黃柏(2111074)、梔子(2108054)、天花粉(2108021)、桔梗(2108049)、金銀花(2110129)、黃芪(2202012)、防風(2201113)、地丁(2107029)、白蘞(2012198)27味中藥均購自新疆烏魯木齊尚德堂大藥房；藥敏片(20100290)購自杭州濱河微生物試劑有限公司；氨芐西林鈉(H23020927)購自哈藥集團制藥總廠。

1.1.4 主要試劑及儀器 瓊脂粉、THB培養(yǎng)基均購自青島海博生物技術有限公司。麥氏比濁管購自珠海貝索生物技術有限公司；恒溫水浴鍋(HH-W420)購自上海亞榮生化儀器廠；旋轉蒸發(fā)儀(RE-52)購自上海亞榮生化儀器廠；超凈工作臺(SW-CJ-2FD)購自上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；恒溫振蕩器(THZ-C)購自上海天呈實驗儀器制造有限公司；生化培養(yǎng)箱(DHP-9082D)購自北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 中藥水提物的制備 27味藥材均采用如下方法處理：稱取40 g藥材，粉碎后按1∶15料液比加入蒸餾水，室溫浸泡2 h，95 ℃回流提取2 h，倒出提取液，再按1∶10料液比加入蒸餾水95 ℃回流提取2 h；合并2次提取液，4 000 r/min離心10 min，抽濾，濃縮藥液至4 g/mL，冷卻后置4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌液的制備 將保存的純化馬鏈球菌馬亞種接種于THB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)18～24 h，根據(jù)后續(xù)不同試驗需要依據(jù)麥氏比濁法配制成相應所需濃度，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 細菌敏感的單味中藥篩選 采用牛津杯法[22]進行篩選。吸取100 μL培養(yǎng)至對數(shù)期、濃度為1×106CFU/mL的菌液加入TSA培養(yǎng)基表面，用玻璃涂布棒涂布均勻。定點放置牛津杯6個，將27味濃度為1 g/mL的中藥水提物分別取200 μL加入牛津杯中，27味藥均設3個平行。以青霉素、環(huán)丙沙星藥敏片作為陽性對照，生理鹽水作為陰性對照。37 ℃培養(yǎng)18～24 h，測量抑菌圈直徑(R)，R≥15 mm為極敏；10 mm≤R<15 mm為高敏；8 mm≤R<10 mm為低敏；R<8 mm為不敏感[22]。

1.2.4 敏感單味中藥最小抑菌濃度(MIC)及最小殺菌濃度(MBC)測定 采用美國國家臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)推薦的微量肉湯稀釋法[23]，將培養(yǎng)至對數(shù)期的菌液，校準濃度至1×106CFU/mL。取100 μL濃度為1 g/mL的敏感單味中藥水提物，在96孔板中用THB液體培養(yǎng)基以2倍稀釋法至藥液終濃度為0.001 g/mL，每孔中加入稀釋好的菌液10 μL。只加菌液作為陽性對照，加藥不加菌作為陰性對照，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。在培養(yǎng)完成后，向其中加入5 g/L氯化三苯四氮唑(TTC)[22]。當孔內不顯示紅色時，細菌生長的最低藥物濃度為MIC。將所有無菌生長的孔內液體以涂布法接種于THB瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，以菌落不超過5個為該單藥的MBC。

1.2.5 敏感單味中藥聯(lián)合藥敏(FIC)指數(shù)測定 采用微量棋盤稀釋法[24]，將單味敏感藥物兩兩組合，用無菌96孔板延X軸方向1～7行每孔依次加入THB肉湯、1/16 MIC、1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC、2 MIC的甲藥水提物各50 μL，延Y軸A-G列每孔依次加入2 MIC、MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC的乙藥水提物和THB肉湯各50 μL，每孔加入稀釋好的菌液100 μL，混勻后蓋上板，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，培養(yǎng)完成后加入氯化三苯四氮唑(TTC)觀察細菌生長情況，計算FIC指數(shù)。FIC指數(shù)=MIC甲藥聯(lián)合/MIC甲藥單用+MIC乙藥聯(lián)合/MIC乙藥單用[25]。所有試驗均重復3次，每次進行質控菌株的檢測。判斷標準：FIC指數(shù)≤0.5時兩藥為協(xié)同作用，0.52.0時兩藥為頡頏作用[22]。

1.2.6 抗馬鏈球菌馬亞種基礎組方藥物主次作用測定 根據(jù)各單味藥物之間的FIC結果，將篩選出的6味藥物設置加藥和不加藥2個水平，分別用1和2表示，再按照L8(26)正交設計配制相應的8種組方溶液(分別為試驗1、2、3、4、5、6、7、8組)，采用牛津杯法，測量8種組方溶液對馬鏈球菌馬亞種的抑菌圈直徑。試驗結果采用極差分析法統(tǒng)計,初步篩選出能夠抑制馬鏈球菌馬亞種的優(yōu)選因素。

1.2.7 抗馬鏈球菌馬亞種基礎組方劑量優(yōu)化試驗 根據(jù)1.2.6的試驗結果，對優(yōu)選出的6個因素設計3個水平(1、0.5、0.25 g/mL)，分別用1、2和3表示，再按照L18(36)正交設計，配制18種組方溶液(分別為試驗1～18組)，測量每組抑菌圈直徑，每組平行測定3次，篩選出能夠抑制馬鏈球菌馬亞種的最佳劑量組合，即得到基礎組方的最優(yōu)配比。

1.2.8 抗馬鏈球菌馬亞種加味組方體內抑菌試驗 根據(jù)中獸醫(yī)方劑配伍理論，將基礎組方中的6味單藥按優(yōu)選濃度分別與不同配比、濃度的補虛藥(黃芪、當歸)等體積混勻，分為8組(表1)。將80只昆明小鼠隨機分為8組，每組10只，每組每天均按照0.01 mL/g體重的藥量灌胃1次，連續(xù)給藥5 d，陰性對照組灌服等體積的生理鹽水，陽性對照組灌服等體積2 mg/mL氨芐西林鈉[26]。第5天灌胃1 h后，除空白對照組不做處理外，其余各組小鼠均腹腔注射0.5 mL濃度為0.8×109CFU/mL即80%最小致死量(MLD)[27-30]的馬鏈菌液，進行馬腺疫小鼠模型的構建。攻毒后通過觀察小鼠臨床癥狀，以肺臟出現(xiàn)充血及炎性細胞浸潤的病理變化作為模型建立的判定標準[29-30]。再按上述給藥方法連續(xù)灌胃2 d，其中空白對照組不作處理。在給藥第7天，計算每組小鼠存活數(shù)、死亡數(shù)，根據(jù)公式計算保護率[31]。保護率(%)=(陰性對照組死亡數(shù)―處理(給藥)組死亡數(shù))/陰性對照死亡數(shù)×100%。同時將每組未死亡小鼠脫頸處死，采集肺臟組織，于4%多聚甲醛中固定后進行切片染色，觀察病理組織學變化。

表1 小鼠體內抑菌試驗分組及給藥情況Table 1 Grouping and administration of in vivo antibacterial test in mice

2 結 果

2.1 馬鏈球菌馬亞種的敏感中藥篩選結果

通過牛津杯法測定27味中藥水提物對馬鏈球菌馬亞種抑菌效果如表2所示。由表2可知，馬鏈球菌馬亞種對浙貝母、大黃、苦參、山豆根、赤芍、甘草、蒲公英、知母極度敏感；對黃芩、雪白睡蓮、黃連、荊芥、薄荷、射干、連翹、黃藥子、苦楝皮、白芷、黃柏高度敏感；梔子、天花粉、桔梗、金銀花、黃芪、防風、地丁、白蘞對其無抑菌作用，最終選擇浙貝母、大黃、苦參、山豆根、赤芍、甘草、雪白睡蓮開展后續(xù)試驗。

表2 不同中藥對馬鏈球菌馬亞種的抑菌圈直徑Table 2 Diameter of inhibition zone of different herbs against Streptococcus equi subspecies equimm

2.2 敏感單味中藥MIC及MBC測定結果

通過微量肉湯稀釋法測定各敏感單味中藥的MIC及MBC，結果見表3。由表3可知，大黃和雪白睡蓮的MIC最小，均為0.078 g/mL，提示其抑菌作用最強，其次是山豆根、甘草、苦參，最后為浙貝母、赤芍。雪白睡蓮的MBC最小，為0.078 g/mL，其次是赤芍和山豆根，然后為甘草、大黃、苦參和浙貝母。

表3 敏感單味中藥MIC及MBC測定結果Table 3 Determination of MIC and MBC of single sensitive herbs g/mL

2.3 敏感單味中藥FIC測定結果

由聯(lián)合藥敏指數(shù)公式計算得出各敏感中藥間的FIC指數(shù)，發(fā)現(xiàn)浙貝母和雪白睡蓮的FIC指數(shù)>2.00，提示二者有頡頏作用，根據(jù)試驗結果綜合考慮刪減浙貝母，用剩余6味單藥開展后續(xù)試驗。

表4 敏感單味中藥FIC測定結果Table 4 Determination of FIC of single sensitive herbs

2.4 抗馬鏈球菌馬亞種基礎組方單味中藥主次作用結果

極差法分析結果表明，在基礎組方中各因素抗馬鏈球菌馬亞種的作用主次順序為：苦參>大黃>雪白睡蓮>甘草>赤芍、山豆根，即組方中抑制馬鏈球菌馬亞種效果最佳的是苦參，其次是大黃、雪白睡蓮、甘草，最后是赤芍、山豆根(表5)。

表5 敏感藥物對馬鏈球菌馬亞種的抑菌效果主次作用分析Table 5 Primary and secondary effect analysis of antibacterial effect of sensitive drugs against Streptococcus equi subspecies equi

續(xù)表

2.5 抗馬鏈球菌馬亞種基礎組方劑量優(yōu)化結果

采用極差分析法對結果進行分析，得出基礎組方最佳配比組合為赤芍∶甘草∶大黃∶雪白睡蓮∶山豆根∶苦參=4∶2∶2∶4∶4∶1。

表6 優(yōu)選因素各組合對馬鏈球菌馬亞種抑菌作用結果Table 6 Bacteriostasis results for each combination of preferred factors against Streptococcus equi subspecies equi

2.6 抗馬鏈球菌馬亞種加味組方配比優(yōu)化試驗結果

2.6.1 抗馬鏈球菌馬亞種加味組方體內抑菌試驗結果 由表7可知，與模型組相比，各藥物組小鼠體內抑菌試驗保護率明顯增加，其中加味組方Ⅱ組(87.5%)=陽性對照組(87.5%)>加味組方Ⅲ組(62.5%)>加味組方Ⅰ組(37.5%)>加味組方Ⅳ組(25%)>基礎組方組(25%)，由此可知加味組方Ⅱ組為抗馬鏈球菌馬亞種最優(yōu)組合。

表7 加味組方體內抑菌保護率Table 7 In vivo antibacterial protection rate of modified formula

2.6.2 各組小鼠肺臟病理組織學變化結果 由圖1可知，空白對照組肺臟結構完整，肺泡無充血和炎性細胞，肺泡腔無滲出(圖1A)；加味組方Ⅰ組在第7天灌胃結束后，肺臟結構完整，但肺泡腔中有大量滲出物(圖1B)；加味組方Ⅱ組在第7天灌胃結束后，肺臟結構完整，染色均勻，修復良好(圖1C)；加味組方Ⅲ組在第7天灌胃結束后，肺泡壁依舊有嚴重的充血及炎性細胞浸潤(圖1D)；加味組方Ⅳ組、基礎組方組在第7天灌胃結束后，肺泡壁依舊有少量炎性細胞浸潤(圖1E、1F)；陰性對照組在第7天灌胃結束后，肺泡壁充血且有炎性細胞浸潤，肺泡腔中有漿液性滲出混有少量的紅細胞及脫落的上皮細胞(圖1G)；陽性對照組在第7天灌胃結束后，肺泡壁毛細血管擴張充血，有炎性細胞浸潤，肺泡腔體積縮小(圖1H)。

①A～H，分別代表空白對照組、加味組方Ⅰ組、加味組方Ⅱ組、加味組方Ⅲ組、加味組方Ⅳ組、基礎組方、陰性對照組、陽性對照組。②a，脫落的上皮細胞和漿液性分泌物；b，炎性細胞浸潤；c，恢復正常的肺泡；d、e，嚴重充血和炎性細胞浸潤 ①A-H,Blank control group,modified formula group Ⅰ,modified formula group Ⅱ,modified formula group Ⅲ,modified formula group Ⅳ,basic formula,negative control group and positive control group,respectively.②a,Sloughed epithelial cells and serous secretions;b,Inflammatory cell infiltrates;c,Normal alveoli;d and e,Severe hyperemia and inflammatory cell infiltration圖1 各組肺臟病理切片觀察(HE染色，100×)Fig.1 Observation of lung pathological sections of each group (HE staining,100×)

3 討 論

目前研究結果表明，在中國的新疆北部地區(qū)、加拿大、埃及均出現(xiàn)了馬鏈球菌馬亞種對β內酰胺類、萬古霉素普遍耐藥的現(xiàn)象[32-36]，尋找一種替代療法迫在眉睫。中藥來源于植物、動物或礦物，耐藥性低、毒性低以及副作用小，現(xiàn)已成為研究的熱點?；诖?，本試驗根據(jù)馬腺疫治療原則以及“十八反、十九畏”[11,37-38]選取了27味中藥，首先開展了體外抑菌試驗，結果顯示馬鏈球菌馬亞種對浙貝母、大黃、苦參、山豆根、赤芍、甘草、蒲公英、知母極度敏感，結果與王雨朦[30]結果相似，其中蒲公英和知母清熱解毒的藥性與前幾種中藥有重合，所以將其剔除。劉丹丹等[39]研究發(fā)現(xiàn)，雪白睡蓮對金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌等常見菌種展現(xiàn)出的極強的廣譜抗菌作用，且其作為新疆地道藥材其質量優(yōu)、產量高，因此納入敏感單藥中。MIC和MBC的測定結果顯示，大黃和雪白睡蓮的MIC最小，為0.078 g/mL，提示其抑菌作用最強，雪白睡蓮的MBC最小，為0.078 g/mL，該結果與牛津杯法結果并不完全符合，懷疑是不同試驗中藥物與細菌共培養(yǎng)的狀態(tài)不同而影響了藥物的抑菌效果。單一中藥通常只有1～2種藥理作用，當聯(lián)合使用多種中藥時，可能會發(fā)生協(xié)同效應并全面展現(xiàn)相關的藥理作用，因此試驗近一步對篩選出的敏感單味藥物組方。為避免直接按抑菌效果組方的盲目性，借助聯(lián)合藥敏試驗和正交試驗[40]，以剔除相頡頏藥物，消除各因素間干擾。聯(lián)合藥敏試驗結果顯示，浙貝母和雪白睡蓮FIC指數(shù)>2，提示二者頡頏，但因雪白睡蓮和其他藥物的協(xié)同相加作用更強，綜合考慮刪減浙貝母。通過正交試驗，得出抗馬鏈球菌馬亞種的基礎組方最佳配比為赤芍∶甘草∶大黃∶雪白睡蓮∶山豆根∶苦參=4∶2∶2∶4∶4∶1。

傳統(tǒng)中獸藥組方中除針對治則選取藥物外，還會相應添加補虛藥，研究發(fā)現(xiàn)補虛藥具有良好的免疫增強功能，有些可以刺激機體的免疫應答系統(tǒng)[41]，常見補虛藥物有黃芪、當歸、人參、白術等。在基礎組方前提下，添加黃芪與當歸2味補益藥物。根據(jù)相關文獻記載，黃芪當歸在5∶1配伍時，促血管新生療效最佳，黃芪當歸在1∶1配伍時，能提高骨髓造血機能[42-44]。結合本研究體內抑菌試驗結果可知，在黃芪當歸以1∶1配伍，濃度為0.5 g/mL加味時，治療馬腺疫小鼠模型的效果最佳，保護率可達87.5%，與陽性對照組(氨芐西林鈉)相當。氨芐西林鈉屬于青霉素類抗生素，主要用以治療敏感細菌所致的上、下呼吸道感染、胃腸道感染等，在本試驗中雖然其顯著降低了小鼠的死亡率，但肺臟病理切片結果顯示，對于馬鏈球菌馬亞種引起的肺臟炎性損傷，修復作用較差。而在組方治療下，小鼠肺臟的病理變化明顯減輕，表明組方不但可以降低小鼠的死亡率，并且對馬鏈球菌馬亞種所致小鼠肺臟的炎性損傷有一定的改善作用。雖然建立馬腺疫小鼠模型，可以顯著降低試驗成本，由于組方成分復雜，進入機體內后會受到溫度、pH、作用部位及宿主健康狀況等多種因素影響[45]，組方對于小鼠模型的治療效果是否與本體動物治療效果相當還有待近一步研究。

4 結 論

本研究通過單味中藥體外抑菌試驗(牛津杯法)、聯(lián)合藥敏試驗和正交試驗成功篩選出了一種抗馬鏈球菌馬亞種的中藥組方，配比為赤芍∶甘草∶大黃∶雪白睡蓮∶山豆根∶苦參∶黃芪當歸(1∶1)=4∶2∶2∶4∶4∶1∶1；中藥組方體內抑菌保護率可達87.5%，同時該組方對馬鏈所致肺臟炎性損傷有改善作用，在馬腺疫無特效藥的情況下，可為臨床用藥提供一定的技術支持。