姚弘毅 李燕霞 梅其杰 曹靜 楊健 王琳*

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以軟骨退行性變?yōu)橹饕卣鞯穆躁P(guān)節(jié)疾病。由于OA的影響因素眾多，其發(fā)病機(jī)制不明確，目前以緩解癥狀為主，尚無(wú)有效手段阻止其病程進(jìn)展。隨著老齡化社會(huì)的加重，OA 發(fā)病率逐漸上升，深入探究其發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療方法迫在眉睫。

關(guān)節(jié)軟骨是一種無(wú)血管組織，自愈能力較差，其損傷和修復(fù)成為艱巨的臨床挑戰(zhàn)[1]。軟骨細(xì)胞作為軟骨中唯一的細(xì)胞類型，是影響OA進(jìn)展的關(guān)鍵因素[2]，軟骨細(xì)胞的異常凋亡、炎癥反應(yīng)與OA 中的基質(zhì)降解和軟骨破壞密切相關(guān)[3]。Notch信號(hào)通路通過調(diào)控細(xì)胞凋亡及炎癥因子影響關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[4]，在OA進(jìn)展中起到雙重調(diào)節(jié)作用[5]。關(guān)節(jié)軟骨中Notch信號(hào)通路持續(xù)激活將導(dǎo)致OA進(jìn)展加重，而當(dāng)Notch信號(hào)通路短暫激活則可使軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成增加以保護(hù)關(guān)節(jié)穩(wěn)定性[6-7]，因此，有效調(diào)控Notch信號(hào)通路可延緩OA進(jìn)展。O3是一種具有抗炎特性的強(qiáng)氧化劑[8]，可有效保護(hù)軟骨，治療膝骨關(guān)節(jié)炎療效顯著[9]，但其具體機(jī)制尚不明確[10]。

基于前期研究基礎(chǔ)，本研究通過構(gòu)建OA 大鼠模型，使用O3對(duì)OA 大鼠模型進(jìn)行干預(yù)，觀察大鼠軟骨細(xì)胞凋亡主要標(biāo)志物（caspase-3、Bcl-2、Bax）及Notch通路相關(guān)因子（Notch-1、Jagged 1、keratin 1、involucrin）表達(dá)情況，探討O3治療OA 的作用機(jī)制，以期為O3治療OA 提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑、儀器

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD 大鼠24 只，雄性，SPF 級(jí)，6 ～8 周齡，體重200 ～300 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004，經(jīng)中洪博元生物技術(shù)有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)倫理批準(zhǔn)（2021042501），適應(yīng)性喂養(yǎng)，所有大鼠均自由進(jìn)食及飲水。

主要試劑：木瓜蛋白酶（美國(guó)Sigma公司）；HSYA 凍干粉（成都康邦生物科技有限公司），純度89.5%，規(guī)格：50 mg/支，批號(hào)：160412，HSYA 加入0.9%氯化鈉注射液配制濃度為0.5 mg/mL 的溶液；白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、γ 干擾素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]；IL-6 與IL-17 ELISA 試劑盒（北京華英生物技術(shù)研究所）；兔抗鼠Notch1多克隆抗體、兔抗鼠Hes5多克隆抗體（美國(guó)Proteintech公司）；兔抗鼠Hes1多克隆抗體、兔抗鼠Jagged 1多克隆抗體（美國(guó)SantaCruz 公司）；Trizol 試劑（美國(guó)Invitrogen 公司）；MiniOpticon 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）試劑盒（美國(guó)Bio-Rad公司）。主要儀器：臭氧治療儀（濟(jì)南三氧科技有限公司）。

1.2 分組、造模、給藥及標(biāo)本采集

將24只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組和模型+O3治療組，每組8只?？瞻捉M大鼠不做處理；模型組及模型+O3治療組大鼠在第1、3、5 d 行右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射4%木瓜蛋白酶和0.3 mol/L半胱氨酸混合液0.25 mg/kg復(fù)制OA 模型[11]。造模后48 h 內(nèi)出現(xiàn)腫脹、屈伸功能障礙、跳步、拖步、活動(dòng)減少等癥狀表明造模成功。造模成功后模型組每周注入2 mL空氣；模型+O3治療組注入25 μg/mL臭氧，每周1 次，每次2 mL[12]。4 周后所有實(shí)驗(yàn)鼠采取安樂死，迅速行手術(shù)獲取大鼠右下肢組織，予清除右膝關(guān)節(jié)周圍的軟組織及韌帶等，從股骨髁和脛骨平臺(tái)的承重區(qū)域收集軟骨組織保留備用。

1.3 軟骨評(píng)分及HE染色

根據(jù)國(guó)際軟骨修復(fù)協(xié)會(huì)（ICRS）規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)軟骨進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：①一度的軟骨損傷是表淺的，鈍性的缺口和表淺的開裂；②二度的軟骨損傷是損傷小于軟骨厚度的一半；③而對(duì)于三度的軟骨損傷，大于等于軟骨厚度的一半，但未達(dá)到軟骨下骨；④而對(duì)于四度的軟骨損傷主要是導(dǎo)致了全程的撕裂合并軟骨下外露的情況。

取出的組織在流水下沖洗數(shù)小時(shí)，然后用70%、80%、90%各級(jí)乙醇溶液進(jìn)行脫水，等量純乙醇、二甲苯混合液15 min，二甲苯Ⅰ15 min、Ⅱ15 min（直至透明為止）。然后置入二甲苯與石蠟各半的混合液中15 min，再置入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ透蠟各50 ～60 min。最后予以石蠟包埋，進(jìn)行切片。

1.4 免疫組化檢測(cè)

65℃烤箱中將組織切片烤2 h；于二甲苯中放置10 min，更換二甲苯再放置10 min；然后于100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇和純化水中各放置5 min。抗原修復(fù)：將修復(fù)盒中的切片加入抗原修復(fù)液（檸檬酸緩沖液），在高壓鍋中加熱，直至自動(dòng)放氣，2 min后脫離熱源，等其自然冷卻，然后去掉檸檬酸緩沖液，用PBS將切片進(jìn)行淋洗。將切片轉(zhuǎn)移到濕盒中，將新鮮配制好的3%雙氧水加入濕盒中，在室溫中孵育10 min，再用PBS 進(jìn)行充分淋洗。使用PBS 淋洗玻片3 次，每次5 min，組織周圍的PBS 用吸水紙吸干，將5%BSA 滴加在玻片上，37°C 下封閉30 min。將組織周圍的封閉液用吸水紙吸掉，不洗。將稀釋好的一抗滴加在每張玻片上，量足夠：Caspase-3（1∶200）、Notch-1（1∶200）；置入濕盒中，4°C孵育過夜。二抗：將4°C孵育過夜?jié)窈腥〕?，靜置于室溫下45 min，用PBS將玻片浸洗3次，每次5 min，羊抗兔（1∶100），37°C 孵育30 min，PBS 充分淋洗。顯色5 ～10 min（顯色復(fù)染DAB），染色程度在顯微鏡下掌握，PBS 沖洗1 min；再?gòu)?fù)染3 min（蘇木精）、分化（鹽酸酒精）、返藍(lán)；自來水沖洗1 min，脫水、透明、封片和鏡檢。

1.5 Western Blot檢測(cè)

取各組細(xì)胞分別加入裂解液，然后放在冰上裂解30 min，4℃、10 000 rpm/min 離心10 min，小心吸取上清，則可獲得總蛋白。使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性，上樣，十二烷基苯磺酸鈉凝膠進(jìn)行電泳1 ～2 h，后濕法轉(zhuǎn)膜30 ～50 min。一抗溶液孵育，4℃過夜；在二抗溶液中室溫孵育1 ～2 h。將ECL曝光液滴加在膜上，曝光于凝膠成像系統(tǒng)中。在“Quantityone”軟件中分析出各抗體條帶的灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有的數(shù)據(jù)重復(fù)分析3次，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組之間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用S-N-K法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OA模型驗(yàn)證及軟骨組織學(xué)觀察

造模后48 h內(nèi)模型組及模型+O3治療組大鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少、關(guān)節(jié)腫脹、跳步、屈伸功能障礙、拖步等癥狀，造模成功?？瞻捉M軟骨白，表面平滑；模型組軟骨光澤減少，呈黃色，軟骨軟化，表面結(jié)節(jié)狀膨隆不整，軟骨表面磨損，殘存的軟骨纖維狀；模型+O3治療組關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，無(wú)纖維化現(xiàn)象。造模后大鼠軟骨組織學(xué)改變?nèi)鐖D1所示。

圖1 軟骨組織學(xué)觀察：A.空白組；B.模型組；C.模型+O3治療組

2.2 軟骨評(píng)分及HE染色

按國(guó)際軟骨修復(fù)協(xié)會(huì)（ICRS）規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分及HE 染色觀察顯示：空白組關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，結(jié)構(gòu)完整；模型組軟骨表面纖維增生，軟骨細(xì)胞排列不規(guī)則，軟骨中層細(xì)胞簇生，層次紊亂，潮線消失；模型+O3治療組關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，無(wú)纖維化現(xiàn)象，軟骨細(xì)胞成簇增生，潮線間斷；總體觀察，與模型組相比，模型+O3治療組的病理現(xiàn)象有一定改善。具體如圖2所示。

圖2 A.三組軟骨評(píng)分；B.三組HE染色結(jié)果（×40）

2.3 軟骨細(xì)胞凋亡檢測(cè)

檢測(cè)caspase-3、 Notch-1、 Jagged1、 Bax、 Bcl-2、keratin1、involucrin 的蛋白表達(dá)情況。經(jīng)免疫組化及Western Blot 檢測(cè)，模型組與空白組相比，caspase-3、Notch-1、Jagged1 和Bax 蛋白含量在模型組顯著性增高（P＜0.05）；模型+O3治療組與模型組相比，caspase-3、Notch-1、Jagged1 和Bax 蛋白含量均有所下降，其中，caspase-3 和Notch-1 蛋白含量與模型組相比下降程度更顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。模型組與空白組相比，Bcl-2、keratin1 和involucrin 蛋白含量在模型組顯著性降低（P＜0.05），模型+O3治療組與模型組相比Bcl-2、keratin1 和involucrin 蛋白含量顯著性增高（P＜0.05）。如圖3、圖4所示。

圖3 A.免疫組化結(jié)果圖（×40）；B.三組caspase-3、Notch-1蛋白含量的比較

圖4 A.Western Blot檢測(cè)結(jié)果圖；B.三組Bax、Bcl-2、involucrin、Jagged1、keratin1、Notch-1蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

3 討論

OA 是一種中老年人常見的退行性關(guān)節(jié)疾病，影響全球超過3億人的生活質(zhì)量[13]。OA的發(fā)病機(jī)制不明確，目前尚無(wú)有效方法治愈。隨著我國(guó)老齡化社會(huì)的加重，OA 的發(fā)病率逐年上升，不僅嚴(yán)重影響人們的身心健康，還帶來沉重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，已成為一個(gè)亟需解決的公共衛(wèi)生問題[14]。因此，對(duì)OA 發(fā)病機(jī)制的深入研究以探索新的治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。

OA 以軟骨進(jìn)行性退變及破壞為主要特征，由于關(guān)節(jié)軟骨本身較差的自愈能力和無(wú)血管性質(zhì)，其損傷和修復(fù)成為日益嚴(yán)重的問題[1]。軟骨細(xì)胞作為軟骨中唯一的細(xì)胞類型，在OA進(jìn)展過程中發(fā)生大量變化[4]，軟骨細(xì)胞的異常凋亡、炎癥反應(yīng)與OA 中的基質(zhì)降解和軟骨破壞密切相關(guān)[5]。Notch 信號(hào)通路是軟骨發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可通過調(diào)節(jié)凋亡蛋白作用于軟骨細(xì)胞及軟骨基質(zhì)的代謝活動(dòng)[15]，在軟骨形成過程中具有重要的管控作用，被確定為緩解OA 進(jìn)展的治療靶點(diǎn)[16]，但具體機(jī)制尚不明確。

Notch 信號(hào)通路由Notch 配體、Notch 受體及細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器分子等組成[17]。Notch受體與配體結(jié)合后激活Notch信號(hào)通路，參與關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)[18]。其中Notch配體Jagged 1在OA 中呈顯著高表達(dá)狀態(tài)[19]，而抑制受體Notch-1，降低炎癥因子的表達(dá)，拮抗炎癥反應(yīng)[20]。表皮顆粒層特異性蛋白keratin1和棘皮層特異性蛋白involucrin在Notch信號(hào)通路激活時(shí)表達(dá)明顯下調(diào)，在阻斷Notch 信號(hào)通路時(shí)大幅上調(diào)，作為Notch 信號(hào)通路的重要激活信號(hào)[21]，這在本研究中也得以體現(xiàn)。軟骨細(xì)胞凋亡與OA 軟骨破壞與基質(zhì)耗竭嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[22]，說明軟骨細(xì)胞凋亡標(biāo)志物可有效反映OA退變情況。Bcl-2相關(guān)X 蛋白（Bax）、Bcl-2 和Caspase-3 是細(xì)胞凋亡典型標(biāo)志，高表達(dá)的Bax和Caspase-3可加劇軟骨退變，Bax與Bcl-2通過形成同源或異源二聚體來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，當(dāng)形成同源二聚體時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而形成異源二聚體時(shí)則實(shí)現(xiàn)Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡的功能，被認(rèn)為是軟骨細(xì)胞凋亡的生物標(biāo)志物[23]。

O3能夠抑制軟骨細(xì)胞促炎因子釋放，誘導(dǎo)OA 軟骨細(xì)胞凋亡，提高軟骨細(xì)胞的抗氧化能力，從而降低軟骨細(xì)胞的分解代謝，達(dá)到保護(hù)膝OA 軟骨細(xì)胞的目的[24]，但其具體作用機(jī)制目前尚未明確。

以往對(duì)Notch 通路的研究多見于神經(jīng)系統(tǒng)疾病及腫瘤等方面，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合前人研究O3治療OA 的成果[25-26]，提出O3可能通過Notch通路影響軟骨細(xì)胞凋亡作用于OA，從而緩解OA 癥狀甚至延緩OA 進(jìn)展。因此，本研究通過觀察大鼠OA 軟骨細(xì)胞中凋亡標(biāo)志物（caspase-3、Bcl-2、Bax）及Notch通路相關(guān)因子（Notch-1、Jagged 1、keratin 1、involucrin）的表達(dá)情況，明確O3是否通過Notch 通路影響軟骨細(xì)胞凋亡作用于OA。

本研究結(jié)果顯示，模型組軟骨表面較空白組纖維增生，軟骨細(xì)胞排列不規(guī)則，軟骨中層細(xì)胞簇生，層次紊亂，潮線消失，而模型+O3治療組關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，無(wú)纖維化現(xiàn)象，軟骨細(xì)胞成簇增生，潮線間斷；表明OA 大鼠經(jīng)過O3治療后，關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)得到一定改善，證實(shí)O3對(duì)OA關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用。模型組與空白組相比，caspase-3、Notch-1、Jagged1 和Bax 蛋白含量在模型組顯著性增高（P＜0.05），模型+O3治療組與模型組相比，上述蛋白含量均有所下降，其中caspase-3 和Notch-1 蛋白含量與模型組相比下降程度更顯著，具有顯著性差異（P＜0.05）；而Bcl-2、keratin 1和involucrin蛋白含量在模型組顯著性降低（P＜0.05），由于keratin1 和involucrin 在Notch 信號(hào)通路激活時(shí)表達(dá)明顯下調(diào)，在阻斷Notch 信號(hào)通路時(shí)大幅上調(diào)，因此認(rèn)為OA 中Notch 通路被激活，而經(jīng)O3治療后上述蛋白含量顯著性增高（P＜0.05），認(rèn)為O3此時(shí)抑制了Notch通路，結(jié)合HE染色結(jié)果模型+O3治療組病理現(xiàn)象有一定改善，此結(jié)果證實(shí)Notch信號(hào)通路通過調(diào)控OA軟骨細(xì)胞凋亡參與OA 發(fā)生發(fā)展的過程，這與陳德勝等[27]結(jié)果一致；而O3能通過抑制Notch信號(hào)通路減少OA軟骨細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減緩OA進(jìn)程。

綜上所述，Notch信號(hào)通路通過調(diào)控OA軟骨細(xì)胞凋亡參與OA 發(fā)生發(fā)展過程，而O3能通過抑制Notch 信號(hào)通路減少軟骨細(xì)胞凋亡保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，延緩OA 進(jìn)展。此外，受實(shí)驗(yàn)條件限制，后續(xù)研究尚需明確關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射受試藥物O3濃度對(duì)檢測(cè)指標(biāo)及Notch 信號(hào)通路的影響，并從關(guān)鍵基因mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證。