申逸志 劉芳 左豐源 余丹 邵溢純 周鑫 殷義霞*

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是導(dǎo)致軟骨損傷的常見疾病，隨著人口老齡化的趨勢不斷加劇，骨關(guān)節(jié)炎患者日益增多，目前全球約有2.5 億人罹患骨關(guān)節(jié)炎，60 歲以后，大約9.6%的男性和18.0%的女性患有骨關(guān)節(jié)炎，給患者家庭及社會帶來了沉重的壓力與負(fù)擔(dān)[1-2]。同時，隨著運動性損傷的不斷增多，有關(guān)軟骨損傷疾病的發(fā)生率也日漸增高[3]。軟骨由于缺乏血管神經(jīng)營養(yǎng)，一旦損傷很難自我修復(fù)[4]。目前，臨床上常用的對軟骨損傷的治療方法，如物理療法、藥物療法、關(guān)節(jié)鏡下清理術(shù)、骨軟骨移植、微骨折等治療措施多為對癥治療或替代治療，且因透明軟骨無法再生而難以獲得長期穩(wěn)定的治療效果[5-6]。近年來，隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，利用組織工程支架促進(jìn)骨軟骨再生修復(fù)的研究日益受到重視[7-8]。但因為力學(xué)性能不匹配等多種原因，軟骨/骨表界面結(jié)合不牢固，極大地影響了軟骨損傷后的治療效果[9]。

本研究致力于研究組織工程軟骨支架甲基丙烯酸化明膠GelMA水凝膠材料，以獲得一種能夠承載誘導(dǎo)軟骨再生細(xì)胞（或因子）的支架，將其黏附于缺損軟骨處，達(dá)到促進(jìn)軟骨再生的目的，為日后組織工程軟骨支架的進(jìn)一步研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)，為臨床上運用組織工程軟骨水凝膠支架實現(xiàn)軟骨再生提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑及儀器

明膠（Gelatin，美國Sigma-Aldrich 公司）、甲基丙烯酸酐（Methacrylic anhydride，美國Sigma-Aldrich 公司）、磷酸鹽緩沖溶液（PBS，美國Hyclone 公司）、光引發(fā)劑Irgacure2959（上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司）、CCK-8 試劑盒（廣州賽國生物科技有限公司）、活/死細(xì)胞染色試劑盒（上海聯(lián)邁生物工程有限公司）、TCP人工仿生骨（武漢華威生物材料工程開發(fā)公司）、電子天平（上海精密儀器儀表有限公司）、恒溫磁力攪拌器（DF-101S型，鞏義市予華儀器有限公司）、倒置顯微鏡（上海光學(xué)儀器廠）、移液槍（上海大龍設(shè)備有限公司）、紫外光源（GHS-LFLG365，深圳光華士科技有限公司）、三維光學(xué)顯微鏡（KH-1000，日本HIROX 公司）、美特斯力學(xué)性能試驗機(jī)（5967，美國英斯特朗公司）、KQ2200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 甲基丙烯酸酯明膠（GelMA）的合成與GelMA水凝膠的制備

依據(jù)Van Den Bulcke 等[10]提出的方法，采用甲基丙烯酸化在明膠上引入雙鍵制得GelMA。取適量凍干后的海綿狀GelMA前體，溶解在含有1%（w/v）光引發(fā)劑的PBS中，配置成10%（w/v）的GelMA溶液，用移液槍轉(zhuǎn)移至直徑為10 mm、高為3 mm的圓柱狀模具中，分別于1、2、3 min紫外光照（UV）下光交聯(lián)后制備GelMA水凝膠樣品[11]（見圖1）。

圖1 人工軟骨材料制備及實驗示意圖

1.3 GelMA水凝膠的力學(xué)性能分析

按照1.2步驟制得的水凝膠樣品，使用美特斯力學(xué)性能試驗機(jī)進(jìn)行拉伸性能測試，在室溫下以0.01 N/s 的速度對樣品進(jìn)行測試。

1.4 掃描電子顯微鏡（SEM）表征

按照1.2步驟制得的水凝膠樣品，凍干后，對水凝膠樣品噴金，用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察其表面形貌。運用Image J軟件對其孔徑大小和孔隙率進(jìn)行分析。

1.5 水凝膠的溶脹性和降解率分析

按照1.2步驟制得不同紫外光照時間（1、2、3、4、5 min）光交聯(lián)下直徑為10 mm、高為3 mm 的圓柱狀水凝膠樣品，分別測量凍干后的GelMA 水凝膠的干重，記為Wd。將凍干的樣品分別浸泡在37℃的PBS 中，分別在2、4、6、8、10、12 h 時取出水凝膠，稱重記為Ws，計算溶脹率S。另外將凍干后的樣品浸泡在37℃降解酶溶液（20 U/mL）中，于特定時間取出后冷凍干燥，稱重記為Wr，計算降解率C。每組測定3個平行樣本，取平均值。

溶脹率（S）=（Ws-Wd）/Wd×100%

降解率（C）=（Wd-Wr）/Wd×100%

1.6 GelMA水凝膠的黏附性能

將制備而成的直徑為10 mm，高為1 mm，UV 1 min，10%（w/v）的圓柱狀GelMA 水凝膠黏附于TCP 人工仿生骨上，定性評估其黏附性能。

使用KQ2200DE型數(shù)控超聲波清洗器分別對直徑10 mm，高為1 mm和0.1 mm的兩組黏附于TCP人工仿生骨表面的水凝膠樣品進(jìn)行超聲分散處理，將樣本浸泡于生理鹽水中，時間60 min、功率99%、溫度控制在35 ～40℃，待其自然干燥后，用三維立體光學(xué)顯微鏡及掃描電鏡觀察其表界面結(jié)合情況。

分別取120 μL 10%GelMA 溶液采取滴加/吸附的方式到d=10 mm，h=5 mm 的立方體仿生骨材料上，UV 1 min，對其進(jìn)行超聲分散處理，室溫干燥24 h后，使用刀片將其從中間切開，用游標(biāo)卡尺分別測得兩種操作方式下GelMA溶液的浸潤深度；噴金后，用SEM觀察切面結(jié)合的表面形貌。每組3個重復(fù)樣本。

1.7 CCK-8細(xì)胞增殖實驗

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別接種至培養(yǎng)基（對照組）與UV 1 min 樣品中（實驗組）培養(yǎng)1、3、5、7 d 后，加入CCK-8 試劑與培養(yǎng)基以1∶9 比例配置的工作液0.5 mL，37℃下孵育2 h，取100 μL移入96孔板中，在450 nm測定吸光度（A值）。每組5個平行樣本。然后根據(jù)如下公式計算細(xì)胞的相對增殖率（relative proliferation rate，RGR）：

相對增殖率（RGR）=（A/A0）×100%

其中，A是實驗組吸光度，A0是對照組吸光度。

1.8 Live/Dead染色觀察

選用24孔板，將密度為1.0×104cells/mL骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞懸液，每孔加入200 μL。置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h 后，棄去原培養(yǎng)基，用PBS 清洗3 次后分別加入培養(yǎng)基（對照組）和10%GelMA（實驗組），放置孵箱內(nèi)分別培養(yǎng)1、3 d，取出進(jìn)行Live/Dead染色。測試前分別事先配好活/死細(xì)胞染液，先用活細(xì)胞染液進(jìn)行染色，培養(yǎng)20 min后，再用死細(xì)胞染液進(jìn)行染色，培養(yǎng)5 min后，即可取出拍照。利用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，拍照記錄活/死細(xì)胞分布。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用Graph Prism 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較用Student'st檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GelMA水凝膠的力學(xué)性能

GelMA 水凝膠的拉伸性能如圖2 所示?？梢钥闯?，隨著UV的延長，材料的彈性模量變大，拉伸性能變強(qiáng)。

圖2 A.1 min UV GelMA水凝膠的拉伸模量；B.2 min UV GelMA水凝膠的拉伸模量；C.3 min UV GelMA水凝膠的拉伸模量

2.2 掃描電子顯微鏡（SEM）表征

不同UV 水凝膠樣品凍干后的表面形貌SEM 圖如圖3A-C所示。根據(jù)此SEM圖，分別計算孔徑大小和孔隙率，如圖3D、3E 所示。UV 1 min 樣品平均孔徑為（110.25±6.51）μm，孔隙率為（45.24±2.78）%；UV 2 min 樣品平均孔徑為（80.42±6.28） μm，孔隙率為（37.79±2.63）%。UV 1 min樣品平均孔徑大于UV 2 min樣品平均孔徑，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。UV 3 min 樣品平均孔徑為（75.74±5.59）μm，孔隙率為（34.96±2.82）%，UV 1 min樣品平均孔徑大于UV 3 min 樣品平均孔徑（P＜0.05），UV 2 min 樣品平均孔徑小于UV 3 min 樣品平均孔徑（P＞0.05）。可以看出，隨著紫外光照時間的增加，GelMA水凝膠的孔隙率相對降低，孔的數(shù)目有減小的趨勢。

圖3 A.1 min UV GelMA水凝膠的截面SEM圖；B.2 min UV GelMA水凝膠的截面SEM圖；C.3 min UV GelMA水凝膠的截面SEM圖；D.三種UV下GelMA水凝膠的孔徑大小；E.三種UV下GelMA水凝膠的孔隙率

2.3 GelMA水凝膠的溶脹性和降解率

GelMA水凝膠的溶脹性能測試結(jié)果如圖4A、4B所示?？梢钥闯觯z在2 h 后的平衡溶脹比基本穩(wěn)定，其中UV為1 min組別的水凝膠樣品在12 h時的平衡溶脹比數(shù)值最大為（148.43±3.84）%，與其他組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。隨著光照時間的增加，GelMA 水凝膠的溶脹速率和平衡溶脹比都會減小，說明其溶脹能力減小。

GelMA 水凝膠的降解性能結(jié)果如圖4C 所示。結(jié)果顯示，水凝膠前7 d的降解速率最快，之后趨于平緩，其中UV為1 min組別的水凝膠樣品在28 d失重率（17.40±2.38）wt%。同時，隨著光照時間的增長，最終水凝膠的失重率越高，最高達(dá)（42.8±1.83）wt%。

圖4 A.各組GelMA水凝膠的平衡溶脹比隨時間變化曲線；B.12 h時各組GelMA水凝膠的平衡溶脹比；C.各組GelMA水凝膠的失重率隨時間變化曲線

2.4 GelMA水凝膠軟骨材料與骨修復(fù)材料的表界面結(jié)合

定性觀察GelMA水凝膠黏附性能如圖5所示?？梢钥闯?，制備的GelMA水凝膠可以較好地黏附于TCP人工仿生骨、橡膠、人皮膚表面，而無需使用其他黏合劑。

超聲分散處理后GelMA水凝膠三維立體光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果如圖6 所示，SEM 結(jié)果如圖7 所示。通過三維立體顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，超聲分散后，GelMA水凝膠仍黏附于仿生骨表面，未見明顯脫落。SEM觀察下，GelMA水凝膠形成膜樣結(jié)構(gòu)與TCP人工仿生骨緊密黏附在一起，超聲分散對TCP 人工仿生骨的結(jié)構(gòu)不會有明顯的破壞，不會導(dǎo)致GelMA水凝膠從TCP人工仿生骨表面脫落。

圖6 超聲分散前后，空白對照組、高為1 mm組、高為0.1 mm組各組三維立體光學(xué)顯微鏡觀察示意圖

圖7 超聲分散前后，空白對照組、高為1 mm組、高為0.1 mm組各組TCP人工仿生骨與GelMA結(jié)合面的SEM圖

采取滴加方式使GelMA 與仿生骨結(jié)合的切面SEM 結(jié)果如圖8A、8B 所示；采用吸附方式使GelMA 與仿生骨結(jié)合的切面SEM結(jié)果如圖8C、8D所示。GelMA浸潤仿生骨的深度界限大致清晰，兩種試驗方式下所觀察到的浸潤情況無明顯的差異性，SEM下所觀察到填充滿仿生骨孔樣結(jié)構(gòu)的微小顆粒狀物為切開操作過程中，仿生骨磨損所掉落下來的白色粉末狀物質(zhì)。

圖8 A.滴加方式下GelMA與TCP人工仿生骨結(jié)合表界面切面SEM觀察圖（×30）；B.滴加方式下GelMA與TCP人工仿生骨結(jié)合表界面切面SEM觀察圖（×100）；C.吸附方式下GelMA與TCP人工仿生骨結(jié)合表界面切面SEM觀察圖（×30）；D.吸附方式下GelMA與TCP人工仿生骨結(jié)合表界面切面SEM觀察圖（×100）

滴加方式用游標(biāo)卡尺測得大致浸潤深度（2.06±0.08）mm；吸附方式用游標(biāo)卡尺測得大致浸潤深度（2.03±0.09）mm。兩種試驗方式的平均浸潤深度的相近，無統(tǒng)計學(xué)差異性（P＞0.05）。可以認(rèn)為，滴加或吸附的試驗方式對GelMA與仿生骨的結(jié)合無影響。

2.5 樣本內(nèi)細(xì)胞增殖評估

CCK-8實驗結(jié)果如圖9所示，UV 1 min GelMA水凝膠浸提液的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在1、3、5和7 d的相對增殖率分別為95.37%、95.98%、98.05%和98.77%。

圖9 培養(yǎng)不同時間點兩組樣本內(nèi)的細(xì)胞增殖

2.6 細(xì)胞Live/Dead染色結(jié)果

共培養(yǎng)1 d后Live/Dead染色結(jié)果如圖10所示。對照組可見紅色細(xì)胞（死細(xì)胞）數(shù)量明顯多于實驗組，細(xì)胞形態(tài)正常、包膜完整。10%GelMA對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無明顯抑制作用。

圖10 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在10%GelMA培養(yǎng)1d時的Live/Dead染色（綠色：活細(xì)胞；紅色：死細(xì)胞）

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎（OA）和創(chuàng)傷帶來的軟骨損傷都面臨著軟骨缺損無法再生修復(fù)的問題，只有軟骨再生才是治療上述疾病的具有確切療效的方法[12-13]。眾多學(xué)者從組織工程學(xué)入手，已獲得了一定的研究成果與結(jié)論。但迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)性能理想，并運用于臨床的軟骨支架。

明膠是膠原蛋白部分水解而來的產(chǎn)物，是一種天然的高分子材料，具有良好的生物相容性、生物降解性和溫敏性，但純明膠水凝膠存在著熱穩(wěn)定性差與力學(xué)穩(wěn)定性差等問題[14-15]。故將其采用光交聯(lián)的方式與甲基丙烯酸酐結(jié)合，能夠提高其理化性能，使其更適合應(yīng)用于軟骨支架[16]。明膠與官能團(tuán)結(jié)合后可通過酶促反應(yīng)或光反應(yīng)共價交聯(lián)，相較于酶促交聯(lián)，光交聯(lián)更易于控制，反應(yīng)條件較溫和，可以影響預(yù)期強(qiáng)度，降解率和相容性[17-18]。同時，光交聯(lián)的操作簡便且對環(huán)境友好，可將光敏性的材料直接在病損位置原位交聯(lián)，通過改變光交聯(lián)反應(yīng)條件，可以調(diào)控GelMA的多孔結(jié)構(gòu)，使其孔徑大小和密度適合于凝膠內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣和代謝產(chǎn)物的輸送[19]。路冬冬等[20]使用紫外光交聯(lián)制備出負(fù)載BMSCs 的GelMA 水凝膠支架能夠產(chǎn)生較多的骨基質(zhì)，有效重現(xiàn)軟骨下骨的骨小梁結(jié)構(gòu)，促進(jìn)軟骨下骨的修復(fù)，也能夠有效形成軟骨樣組織來填充軟骨缺損。

本實驗通過紫外光交聯(lián)的方法，優(yōu)化配比，對材料的力學(xué)性能進(jìn)行了可控性探索，實驗顯示：紫外光照1 min交聯(lián)的10%（w/v）GelMA 水凝膠其孔隙大?。?10.25±6.51）μm，孔隙率（45.24±2.78）%；12 h時的平衡溶脹比達(dá)（148.43±3.84）%；28 d 失重率（17.40±2.38）wt%。其吸水速率和平衡溶脹比最佳，降解速快，拉伸性能與天然軟骨結(jié)構(gòu)類似，具有良好的生物相容性，與骨修復(fù)材料力學(xué)匹配。與其他機(jī)械性能較差、降解速率過快、穩(wěn)定性不足天然高分子材料（如膠原蛋白、透明質(zhì)酸、殼聚糖），以及難降解、細(xì)胞難黏附的人工材料（如聚乙二醇等）相比，本實驗所選擇的GelMA 水凝膠具有良好的力學(xué)性能，合適的孔隙大小及孔隙率，適宜的平衡溶脹比及生物降解率。Costantini 等[21]運用3D 打印技術(shù)制造了類細(xì)胞外基質(zhì)的GelMA 水凝膠支架負(fù)載BMSCs，發(fā)現(xiàn)BMSCs 的成骨、成軟骨分化能力增強(qiáng)。與文獻(xiàn)的結(jié)果類似，本研究發(fā)現(xiàn)該水凝膠能促骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，且活/死染色實驗顯示，GelMA水凝膠中的細(xì)胞存活率較高，表明其具有良好的生物相容性。因此，該水凝膠在軟骨缺損修復(fù)方面有潛在的臨床應(yīng)用價值。

本實驗還通過與骨修復(fù)材料表界面的研究顯示，10%（w/v）GelMA 水凝膠制備的人工軟骨材料，經(jīng)過1 min 紫外交聯(lián)，與骨修復(fù)材料結(jié)合牢固，具有較好的表界面穩(wěn)定性能。該材料運用于軟骨損傷患者時，將能夠承受患者日?；顒铀鶐淼臋C(jī)械沖擊力，構(gòu)建利于關(guān)節(jié)軟骨物質(zhì)運輸?shù)娜S立體微環(huán)境，并在軟骨/骨相關(guān)修復(fù)過程中與骨組織附著良好，能夠促進(jìn)軟骨修復(fù)，為軟骨/骨修復(fù)中的界面和促進(jìn)修復(fù)等問題提供了新方法和新思路。