趙琦琦張斌郭玉靜王艷珂于夢斐魏海峰王穎高文偉

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物種質(zhì)資源研究所，山東 濟(jì)南 250100；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000；3.湖南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南 長沙 410125；4.曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 曲阜 273165)

我國鹽漬化耕地面積廣闊，且呈逐年上升趨勢，土壤鹽漬化嚴(yán)重影響農(nóng)作物種子萌發(fā)、生長發(fā)育、產(chǎn)量及品質(zhì)等[1]，嚴(yán)重制約耕地的利用效率和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展。土壤鹽漬化對植物的危害主要是通過離子脅迫和滲透脅迫，進(jìn)而影響植物的光合作用[2]，干擾植物的新陳代謝[3]，破壞植物的細(xì)胞膜系統(tǒng)[4，5]，造成植物減產(chǎn)甚至死亡。利用工程措施改造鹽漬土耗資巨大且達(dá)不到理想效果，篩選創(chuàng)制耐鹽堿作物種質(zhì)資源、培育耐鹽堿作物新品種并加以推廣種植，是改良和利用鹽堿地的有效途徑。

油莎豆(Cyperus esculentus)為莎草科莎草屬多年生植物，原產(chǎn)于非洲及地中海沿岸[6]。油莎豆具有適應(yīng)性好、抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)量高等特點(diǎn)，可用于壓榨食用油、釀酒及飼料添加劑等，是一種綜合利用價(jià)值較高的新型油料作物[7]。油莎豆根系發(fā)達(dá)、生物質(zhì)量高，具有防風(fēng)固沙、環(huán)境生態(tài)修復(fù)等作用[8]。目前，油莎豆在新疆、甘肅、內(nèi)蒙古、吉林、河南等省區(qū)均有種植[9，10]。但國內(nèi)外針對油莎豆的研究主要集中在種植密度[11]、栽培技術(shù)[12]、營養(yǎng)成分及加工利用[13]等方面，而關(guān)于品種耐鹽性鑒定及耐鹽機(jī)理方面的研究較少。本試驗(yàn)以22份油莎豆種質(zhì)資源為材料，研究鹽脅迫條件下不同油莎豆種質(zhì)苗期生理生化指標(biāo)的變化規(guī)律、苗期鹽脅迫的耐受能力和適應(yīng)能力，旨在為優(yōu)質(zhì)抗逆油莎豆新種質(zhì)篩選創(chuàng)制和優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)耐鹽堿油莎豆新品種培育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)于2021年在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院溫室大棚內(nèi)進(jìn)行。供試油莎豆種質(zhì)資源共22份(以下統(tǒng)稱油莎豆種質(zhì))，其中20份源于新疆、甘肅、北京、內(nèi)蒙古、河北、河南、江蘇、湖北、廣西、云南、吉林共11個(gè)省區(qū)，另有本團(tuán)隊(duì)自育油莎豆新品種魯油莎1號、魯油莎2號，詳見表1。

表1 油莎豆種質(zhì)資源號及來源

盆栽脅迫組土壤為黃河三角洲農(nóng)高區(qū)試驗(yàn)示范田鹽漬土，含鹽量0.3%，pH 7.4；對照組土壤為常規(guī)土。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用盆栽方式，將22份籽粒飽滿、大小一致且無蟲眼的油莎豆種子浸種3～5 d，于6月初分別播種于底徑26 cm、高23 cm、口徑34 cm的花盆中，每盆3穴，每穴1粒。每個(gè)油莎豆種質(zhì)脅迫組和對照組均種植3盆，重復(fù)3次。

播種后定時(shí)澆水，脅迫組澆水時(shí)要適量不能溢出，否則會造成鹽分丟失。7月初，測定苗期油莎豆分蘗數(shù)和株高，并采集不同油莎豆種質(zhì)嫩葉，-80℃超低溫冰箱保存，用于生理指標(biāo)測定。

1.3 指標(biāo)測定及方法

1.3.1 植株生長指標(biāo) 每個(gè)處理隨機(jī)選3株幼苗測定統(tǒng)計(jì)株高和分蘗數(shù)，重復(fù)3次，并計(jì)算平均值。株高:植株根莖相交處到最長葉尖處距離，利用卷尺測量。

1.3.2 幼苗生理指標(biāo) 葉綠素含量測定采用浸提法[14]，可溶性蛋白含量測定采用BCA法，PRO含量測定采用酸性茚三酮法[15]，MDA含量測定采用硫代巴比妥酸顯色法[16]，SOD活性測定采用氮藍(lán)四唑法[17]。所用相關(guān)生理指標(biāo)測定試劑盒均購自蘇州科銘生物科技公司，具體步驟參照試劑盒內(nèi)說明書。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用Microsoft Excel 2013對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與作圖；用SPSS 19.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析和主成分分析；采用隸屬函數(shù)法[18]對22份油莎豆種質(zhì)進(jìn)行耐鹽性綜合評價(jià)。

為排除種質(zhì)間的差異，所有指標(biāo)均轉(zhuǎn)化為耐鹽系數(shù)，計(jì)算公式如下:

耐鹽系數(shù)(%)＝脅迫測定值/正常測定值×100。

隸屬函數(shù)值:μ(Xj)＝(Xj-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)。j＝1，2，…，n；Xj為第j個(gè)綜合指標(biāo)，Xjmin為第j個(gè)綜合指標(biāo)的最小值，Xjmax為第j個(gè)綜合指標(biāo)的最大值。

耐鹽性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn):0.7＜D值≤1為高度耐鹽；0.5＜D值≤0.7為耐鹽；0.3＜D值≤0.5為中度耐鹽；0＜D值≤0.3為鹽敏感。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對不同油莎豆種質(zhì)苗期株高的影響

鹽脅迫下，各油莎豆種質(zhì)幼苗生長都受到一定程度抑制，其株高均極顯著降低(圖1)。其中S03、S05降幅最大，分別達(dá)67.13%和66.82%；S01降幅最小，為34.03%。

圖1 鹽脅迫對不同油莎豆種質(zhì)苗期株高的影響

2.2 鹽脅迫對不同油莎豆種質(zhì)苗期分蘗的影響

鹽脅迫下不同油莎豆種質(zhì)的分蘗數(shù)絕大部分降低(圖2)。其中降幅最大的是S01、S09、S10，均為33.33%；而S03、S04、S08、S13、S22脅迫組的分蘗數(shù)高于對照組，其中S03的分蘗數(shù)比對照組高出33.33%。

圖2 鹽脅迫對不同油莎豆種質(zhì)分蘗數(shù)的影響

2.3 鹽脅迫對不同油莎豆種質(zhì)苗期葉片葉綠素含量的影響

鹽脅迫下，各油莎豆種質(zhì)幼苗葉片的葉綠素含量大多極顯著降低(圖3)。其中下降最顯著的是S14和S12，分別達(dá)63.61%和61.62%；下降最少的是S03，只降16.92%。

圖3 鹽脅迫對不同油莎豆種質(zhì)苗期葉片葉綠素含量的影響

2.4 鹽脅迫對不同油莎豆種質(zhì)苗期可溶性蛋白含量的影響

鹽脅迫下，S02、S06、S01苗期葉片可溶性蛋白含量極顯著增加(圖4)，分別達(dá)836.08%、332.74%和212.39%；S11的可溶性蛋白含量增加較少，為8.55%。

圖4 鹽脅迫對不同油莎豆種質(zhì)苗期可溶性蛋白含量的影響

2.5 鹽脅迫對不同油莎豆種質(zhì)苗期脯氨酸含量的影響

鹽脅迫下，各油莎豆種質(zhì)苗期葉片的脯氨酸(PRO)含量均顯著或極顯著高于對照組(圖5)。其中S16、S08和S17的脯氨酸含量增加最為顯著，分別達(dá)65.45%、65.17%和62.43%；S18增加最少，為0.52%。

圖5 鹽脅迫對不同油莎豆種質(zhì)苗期脯氨酸含量的影響

2.6 鹽脅迫對不同油莎豆種質(zhì)苗期丙二醛含量的影響

鹽脅迫下不同油莎豆種質(zhì)苗期葉片的丙二醛(MDA)含量均增加(圖6)。其中，S01、S02、S08的MDA含量與對照組相比分別增加279.78%、126.90%和118.68%；S09增加最少，為7.69%。

圖6 鹽脅迫對不同油莎豆種質(zhì)苗期丙二醛含量的影響

2.7 鹽脅迫對不同油莎豆種質(zhì)苗期超氧化物歧化酶活性的影響

鹽脅迫下各油莎豆種質(zhì)苗期葉片的超氧化物歧化酶(SOD)活性與對照組相比均有不同程度增加(圖7)。其中，S02、S01、S19、S14的SOD活性增幅最為顯著，分別增加160.67%、133.60%、127.77%和120.27%，而S20增幅最小，為5.44%。

圖7 鹽脅迫對不同油莎豆種質(zhì)苗期SOD活性的影響

2.8 不同油莎豆種質(zhì)苗期耐鹽性綜合評價(jià)

植物耐鹽性是多種因素相互作用的復(fù)雜性狀，用單一指標(biāo)進(jìn)行耐鹽性評價(jià)難以全面反映植物真實(shí)的耐鹽能力。因此本研究首先統(tǒng)計(jì)鹽脅迫下各個(gè)油莎豆種質(zhì)各指標(biāo)的耐鹽系數(shù)，并據(jù)此進(jìn)行相關(guān)性分析和主成分分析，而后再用隸屬函數(shù)值綜合評價(jià)各個(gè)油莎豆種質(zhì)的耐鹽性。相關(guān)性分析結(jié)果(表2)表明，分蘗數(shù)與株高呈顯著負(fù)相關(guān)，但與葉綠素含量呈顯著正相關(guān)。脯氨酸含量與可溶性蛋白含量呈顯著負(fù)相關(guān)。SOD活性與可溶性蛋白含量、MDA含量呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.605和0.621。

表2 鹽脅迫下油莎豆苗期各性狀的相關(guān)性分析

對7個(gè)特征指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果(表3)表明，第一主成分的貢獻(xiàn)率是35.115%，主要與可溶性蛋白含量、MDA含量和SOD活性有關(guān)；第二主成分的貢獻(xiàn)率是23.337%，主要與分蘗數(shù)和葉綠素含量有關(guān)；第三主成分的貢獻(xiàn)率是15.227%，主要與脯氨酸含量有關(guān)。3個(gè)主成分的起始特征值均大于1，主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率為73.729%，符合主成分分析要求。因此，可以利用3個(gè)相互獨(dú)立的綜合指標(biāo)對不同油莎豆種質(zhì)萌發(fā)苗期的耐鹽性進(jìn)行客觀分析。

表3 鹽脅迫下不同油莎豆種質(zhì)苗期各性狀的主成分分析

將主成分分析得到的各種質(zhì)的F值(表4)代入隸屬函數(shù)值公式，計(jì)算出相應(yīng)的μ(Xi)值，其值越高表明材料耐鹽性越好。第一綜合指標(biāo)下S02耐鹽性最強(qiáng)，S17耐鹽性最差；第二綜合指標(biāo)下S03耐鹽性最強(qiáng)，S09耐鹽性最差；第三綜合指標(biāo)下S08耐鹽性最強(qiáng)，S03耐鹽性最差。

表4 不同油莎豆種質(zhì)苗期耐鹽性綜合評價(jià)

根據(jù)隸屬函數(shù)值和各綜合指標(biāo)的權(quán)重計(jì)算出各種質(zhì)的D值，其中S02的D值最大，表明其綜合耐鹽能力最強(qiáng)；S09的D值最小，其綜合耐鹽能力最弱。依據(jù)耐鹽性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)將22份油莎豆種質(zhì)的苗期耐鹽性劃分為四類:第一類為高度耐鹽型，D值最高為0.744，只有1份種質(zhì)；第二類為耐鹽型，D值為0.687，也只有1份種質(zhì)；第三類為中度耐鹽型，D值為0.302～0.442，包含12份種質(zhì)；第四類為鹽敏感型，D值為0.131～0.288，包含8份種質(zhì)。

3 討論

3.1 鹽脅迫對不同油莎豆種質(zhì)形態(tài)發(fā)育的影響

植株生長形態(tài)可以直觀地反映鹽脅迫對植物造成的影響，是觀察植物耐鹽性的重要指標(biāo)[19]。對鹽(土)脅迫下油莎豆苗期表型觀察可以看出，鹽脅迫使22份油莎豆幼苗株高極顯著降低，但對苗期分蘗數(shù)的影響存在差異，絕大部分種質(zhì)減少，部分種質(zhì)有所增加。本試驗(yàn)結(jié)果與唐榕等[20]對油莎豆的研究結(jié)果一致。

3.2 鹽脅迫對不同油莎豆種質(zhì)生理代謝的影響

鹽脅迫下植物葉片中葉綠素含量下降，可能是由于逆境使葉綠素酶活性增強(qiáng)，造成葉綠素的大量分解[21]。本研究結(jié)果表明，鹽脅迫下各個(gè)油莎豆種質(zhì)葉綠素含量均顯著下降，其中降幅最大和最小的分別為S14和S03。

脯氨酸、可溶性蛋白作為植物重要的有機(jī)調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓。滲透調(diào)節(jié)是植物應(yīng)對逆境最常見的方式，是提高植物抗逆性、維持細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境相對穩(wěn)定的重要基礎(chǔ)。本研究結(jié)果表明，22份油莎豆種質(zhì)的可溶性蛋白、脯氨酸含量均有不同程度增加。可溶性蛋白含量與植物的抗逆性之間存在正相關(guān)，植物抗逆性的提高可能涉及特異性可溶性蛋白質(zhì)的形成[22]。鹽脅迫對油莎豆可溶性蛋白含量影響最大的是S02，增加836.08%，影響最小的是S11，增加8.55%。該研究結(jié)果表明，S02在鹽脅迫下產(chǎn)生的特異性可溶性蛋白最多，耐鹽性較強(qiáng)；而S11在鹽脅迫下產(chǎn)生的特異性可溶性蛋白最少，耐鹽性較弱。脯氨酸含量的升高是植物受到逆境后植物為調(diào)節(jié)自身生理代謝而采取的一種保護(hù)性措施[23，24]。Hichri等[25]的研究結(jié)果表明，鹽脅迫條件下植物體內(nèi)大量積累脯氨酸。本研究中，鹽脅迫下絕大部分油莎豆種質(zhì)的脯氨酸含量均顯著增加，但S18的脯氨酸含量幾乎沒有增加，說明鹽脅迫時(shí)該品種對細(xì)胞滲透勢的調(diào)節(jié)能力較小，受到的鹽脅迫危害較大。

丙二醛含量與植物耐鹽性密切相關(guān)，許多研究表明，耐鹽的植物丙二醛含量比較低[26]。MDA是植物逆境下受到傷害后發(fā)生膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量多少是反映細(xì)胞膜脂過氧化作用強(qiáng)弱的一個(gè)重要指標(biāo)，也是反映植物抗逆性的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，鹽脅迫下22份油莎豆種質(zhì)的MDA含量均大幅增加，說明各個(gè)油莎豆細(xì)胞膜均受到一定程度的傷害。

鹽脅迫能誘導(dǎo)植物體內(nèi)活性氧積累，對脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸造成氧化傷害從而嚴(yán)重破壞正常代謝[27]。為了減輕逆境脅迫對植物細(xì)胞造成的傷害，植物在長期的進(jìn)化過程中形成了一套活性氧清除系統(tǒng)，而抗氧化酶系統(tǒng)是清除活性氧的重要保護(hù)酶系統(tǒng)，該系統(tǒng)中酶活性的變化具有維持逆境條件下活性氧代謝水平、保持膜結(jié)構(gòu)等重要作用[28，29]。因此，SOD活性的高低在一定程度上能夠反映植物耐鹽性的強(qiáng)弱。本研究結(jié)果表明，鹽脅迫下所有油莎豆種質(zhì)的SOD活性均顯著提高，S02高出最多，達(dá)160.67%，說明該種質(zhì)最大程度減輕了鹽脅迫對油莎豆的傷害。

3.3 不同油莎豆種質(zhì)苗期耐鹽性綜合評價(jià)

植物耐鹽性是一種非常復(fù)雜的生理特性，單一指標(biāo)的變化常常很難斷定一個(gè)材料是否耐鹽，目前關(guān)于植物耐鹽性的評價(jià)主要通過各指標(biāo)對其耐鹽性的貢獻(xiàn)綜合分析進(jìn)行。本研究對22份油莎豆種質(zhì)的生長指標(biāo)和生理指標(biāo)進(jìn)行了相關(guān)性和主成分分析，再利用成分因子和各綜合指標(biāo)權(quán)重計(jì)算D值，顯示:S02耐鹽性最強(qiáng)，S09耐鹽性最弱。根據(jù)耐鹽評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，將22份油莎豆種質(zhì)劃分為四類，其中中度耐鹽型最多，為12份，占供試種質(zhì)的54.55%。

4 結(jié)論

綜上所述，鹽(土)脅迫下，22份油莎豆種質(zhì)株高均極顯著降低，分蘗數(shù)17份種質(zhì)下降5份增加；所有種質(zhì)葉綠素含量顯著下降，而可溶性蛋白、游離脯氨酸、丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性均顯著提高。通過相關(guān)性和主成分分析，利用D值對所有油莎豆種質(zhì)各指標(biāo)進(jìn)行綜合評價(jià)，表明S02耐鹽性最強(qiáng)，S09耐鹽性最弱。根據(jù)耐鹽評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，將不同D值的油莎豆種質(zhì)劃分為高度耐鹽型、耐鹽型、中度耐鹽型和鹽敏感型。通過研究油莎豆的耐鹽機(jī)理進(jìn)行耐鹽類型劃分，使其能夠在鹽漬土環(huán)境下有效生長，從而更有利于提高我國鹽漬化土壤的利用率。