贠 晗,李嘉欣,羅冬艷,劉曉玲

(煙臺大學生命科學學院,山東 煙臺 264005)

STS基因,即類固醇硫酸酯酶基因,其產(chǎn)物STS蛋白常存在于內質網(wǎng)腔或高爾基體中,能作用于類固醇硫酸鹽等底物,催化底物的硫酸酯鍵發(fā)生斷裂,而類固醇硫酸鹽是雌激素、雄激素和膽固醇的代謝前體[1],故STS基因可在激素代謝途徑中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn),人體內STS蛋白可以調節(jié)多種組織中雌激素和雄激素的活化[2-3]。STS還可以作用于膽固醇硫酸鹽,使其脫硫生成膽固醇[4]。

目前,STS基因的克隆、表達和表征研究主要集中在哺乳動物中[5],在非哺乳動物中,僅有基因組學測序后獲得的相應STS序列,組織表達特性及功能相關研究尚未可見[6]。本研究對櫛孔扇貝STS基因CDS序列特征、組織表達特征、性腺發(fā)育周期表達特征進行了檢測分析,以期為后續(xù)研究該基因在櫛孔扇貝性腺發(fā)育中的具體作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)均購自煙臺崆峒島,選取健康扇貝于過濾海水中暫養(yǎng)過夜, 取各發(fā)育時期的性腺,一部分通過組織切片對發(fā)育時期進行鑒定,即增殖期、生長期、成熟期[7],剩余部分液氮速凍后存于-80 ℃冰箱,用于提取RNA;選取發(fā)育同步的雌雄各組織,包括性腺、閉殼肌、腎臟、外套膜、鰓、肝胰腺,液氮速凍后于-80 ℃冰箱,以提取RNA[8]。上述樣本取樣數(shù)各為5個。

1.2 總RNA的提取與cDNA的合成

柱式動物RNAout試劑盒(北京天恩澤基因科技有限公司)提取各組織RNA,提取的RNA經(jīng)電泳及超微量分光光度計檢測,檢驗合格的RNA反轉錄成cDNA(反轉錄試劑盒購自北京寶日醫(yī)生物技術有限公司),保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3 STS基因CDS序列分析

利用本實驗室已有櫛孔扇貝轉錄組數(shù)據(jù)(本實驗室未發(fā)表數(shù)據(jù)),進行序列分析與引物設計,利用Clustal X和DNAman軟件進行同源序列比對;利用MEGA 7軟件,采用鄰接法(Neibor-joining, NJ)構建系統(tǒng)進化樹。

1.4 STS基因在各組織及性腺發(fā)育周期的qRT- PCR

qRT-PCR特異引物為sq1/sq2(表1),內參基因β-actin引物為A1/A2。每個組織設置3個樣本重復,每個樣本設置2個技術重復,使用ABI7500型熒光定量PCR儀擴增:95 ℃10 min、(95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,72 ℃ 30 s)×40個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達量,以SPSS軟件中One-way ANOVA進行顯著性分析,最小顯著差法(Least Significant Difference,LSD)多重檢驗法進行統(tǒng)計分析(P<0.05為顯著水平)[9]。

表1 引物序列

2 結果與分析

2.1 櫛孔扇貝性腺發(fā)育時期的組織鑒定

如圖1所示,增殖期的精巢和卵巢中,性腺的濾泡內僅可見1～2層生殖細胞;而生長期的精巢和卵巢中,性腺的濾泡腔內,更多的生殖細胞出現(xiàn)在濾泡壁上;成熟期的精巢和卵巢中,濾泡內充滿了大量生殖細胞。

圖1 櫛孔扇貝性腺發(fā)育不同時期的組織學觀察

2.2 STS基因CDS序列特征與分析

如圖2所示,櫛孔扇貝STS基因CDS 長1755 bp,編碼584個氨基酸。STS蛋白序列多重序列比對結果(圖3)顯示,櫛孔扇貝STS蛋白具有與其他物種一樣的高度保守結構域:A、B和C,還具有硫酸酯酶家族基因特有的保守半胱氨酸[10-11]。

圖2 櫛孔扇貝STS基因CDS序列及推導的氨基酸序列

2.3 系統(tǒng)進化分析

如圖4所示,櫛孔扇貝STS蛋白首先與蝦夷扇貝的STS聚類,然后再與牡蠣聚類,最后與其他物種的STS蛋白聚類,這一結果與物種分類地位基本一致。

圖4 不同物種STS蛋白系統(tǒng)進化分析

2.4 STS基因的qRT-PCR結果

如圖5和圖6,STS基因在雌雄各組織中均有表達,說明其表達具有組織廣泛性;雌性各組織中,卵巢中的表達量顯著高于其他組織(P<0.05),而雄性各組織中,表達量無顯著差別。如圖7所示,性腺周期中,STS基因在增殖期卵巢中的表達量顯著高于其他時期的性腺。在卵巢中,該基因在性腺發(fā)育早期的增殖期表達量顯著高于發(fā)育后期,約為生長期的17.3倍,成熟期的22.4倍;而在精巢中,其表達量隨性腺發(fā)育無顯著差異。

不同字母表示組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

不同字母表示組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

不同字母表示相同組織不同組間的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討 論

櫛孔扇貝STS基因序列的N端含A、B、C三個保守區(qū),其中B結構域包含發(fā)揮重要酶功能的進化保守區(qū)(ECRs)活性位點,不同物種該基因的B結構域相似度在90%以上,除B保守區(qū)外其他保守區(qū)也含有發(fā)揮水解底物催化功能的氨基酸[12]。序列分析還發(fā)現(xiàn)，櫛孔扇貝STS具有硫酸酯酶中被2-氨基-3-氧丙酸殘基取代的保守半胱氨酸殘基,研究表明催化性硫酸酯酶的生成與半胱氨酸殘基轉化為2-氨基-3-氧丙酸殘基之間存在關聯(lián),這種轉化是產(chǎn)生具有催化活性硫酸酯酶的必要條件[10]。

REED等[1]發(fā)現(xiàn)STS廣泛表達于人體的多個組織器官,幾乎無處不在,具表達廣泛性,常見于人類的生殖道靶細胞(子宮內膜、卵巢、前列腺、睪丸、胎盤),乳房、皮膚、大腦骨骼和血液中,主要調節(jié)激素的活化。本研究發(fā)現(xiàn)STS在櫛孔扇貝不同組織中的表達也具廣泛性,與高等動物中的研究結果類似。周志楠等[13]檢測發(fā)現(xiàn)黔北麻羊(Ovislinnaeus)卵巢、垂體、子宮、輸卵管、下丘腦五個組織中STS廣泛表達,其中,卵巢表達量最高,推測認為該基因與合成性激素的關鍵酶有關,其在卵巢中的高表達對雌激素分泌具有影響。李嗣杰[14]認為STS蛋白可水解雌激素前體生成有活性的雌激素,PUROHIT等[15]認為STS是雌激素生成的一條途徑中的關鍵酶。

本研究發(fā)現(xiàn)STS在櫛孔扇貝卵巢中的表達量顯著高于其他組織,推測STS基因在櫛孔扇貝卵巢中的相對高表達,或許也與其在雌激素生成和活化中發(fā)揮的作用相關,這一發(fā)現(xiàn),或為低等生物中STS的相關研究奠定理論基礎。

PAATELA等[16]發(fā)現(xiàn),STS在女性青春期前的卵巢中表達量最高,但此時期雌激素水平顯著低于青春期,這種生理活動上的表達上調,可能是一種組織特異性雌激素激活的調控機制,并為后續(xù)青春期雌激素的大量產(chǎn)生做準備。本研究發(fā)現(xiàn),STS在櫛孔扇貝卵巢發(fā)育周期中增殖期的表達量最高,但此時卵巢中E2的含量也顯著低于發(fā)育后期[17],這一規(guī)律與PAATELA對女性卵巢中STS的研究類似,推測扇貝中該時期STS含量的顯著增高也是為后續(xù)成熟期雌激素的大量產(chǎn)生做準備。人體E2來源主要有幾個途徑,膽固醇經(jīng)線粒體內細胞素側鏈裂解酶催化形成孕烯醇酮,孕烯醇酮生成DHEA,DHEA在3β-HSD作用下脫氫生成A2,一部分A2在17β-HSD作用下進一步生成T,另外一部分A2在CYP19作用下生成E1,E1再通過還原性的17β-HSD轉化為E2;STS參與的一條途徑為DHEAS脫硫生成DHEA,DHEA再經(jīng)上述途徑生成激素,另一條途徑為E1S脫硫生成E1,E1在17β-HSD作用下轉化為E2[2-3]。STS參與E2生成活化的機制研究目前主要集中在人體中,其他物種中較少,KUROGI等[5]克隆了斑馬魚和人的STS基因,并通過外源表達制備了相應的STS蛋白,進一步比較了所制備的STS蛋白對底物膽固醇硫酸鹽、DHEA-S和E1-S的催化效率,發(fā)現(xiàn)斑馬魚與人類體外原核表達的STS酶活相當,研究者推測STS的生理功能在斑馬魚和人類之間可能是保守的,也說明其外源表達的STS無需剪切加工即為具有酶活性的蛋白產(chǎn)物。但STS在低等海洋無脊椎動物中的相關研究幾乎不可見。本研究推測,或許與在人體中的作用途徑類似,STS在扇貝卵巢中也僅通過部分途徑參與活化生成E2,發(fā)育后期E2的大量生成可能還有其他激素生成途徑發(fā)揮作用,具體機制需要進一步研究。劉建國研究發(fā)現(xiàn),增殖期卵巢中E2含量最低但此時期T的含量卻最高[17]。周英俏研究發(fā)現(xiàn),DHEA在雌性大鼠體內優(yōu)先向雄激素而不是雌激素轉化[18]。結合文獻推測認為,櫛孔扇貝增殖期卵巢中STS的顯著高表達,可能也會發(fā)揮如人體中一樣的作用,即STS可將DHEA-S脫硫生成DHEA,從而可能和小鼠一樣優(yōu)先向雄激素轉化。