馬 妍，熊 燕，趙 丹，岳永起，范依琳，張姬越，馮欣欣，李 鍵

(1.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；2.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；3.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041)

牦牛(Bos grunniens)是青藏高原特有的家畜，在高原區(qū)域社會(huì)發(fā)展和牧民的生活中是必不可少的生產(chǎn)生活資料[1].牦牛生活區(qū)域年均氣溫≤0℃，嚴(yán)寒時(shí)間占總季節(jié)時(shí)間長(zhǎng)，枯草期長(zhǎng)達(dá)多半年[2].牦牛體內(nèi)沉積的脂肪組織在生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆適應(yīng)性以及肉品質(zhì)形成中發(fā)揮著重要的作用[3]，目前關(guān)于牦牛脂肪沉積關(guān)鍵調(diào)控基因尚不完全清楚.

PKN是一種蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)，也稱為PRKs(蛋白激酶C相關(guān)激酶)，是AGC(cAMP依賴性，cGMP依賴性和蛋白激酶C)激酶家族成員，PKN有三個(gè)主要的亞型:PKN1，PKN2和PKN3[4-6].PKN廣泛分布于動(dòng)物的多種組織中，在不同的組織發(fā)揮生物學(xué)功能具有特異性[7].其中PKN2是一種必須的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶成員，與細(xì)胞分化、胚胎中胚層發(fā)育、細(xì)胞遷移和癌癥有關(guān)[8]，可作為mTORC1信號(hào)傳導(dǎo)的激活劑[9].PKN2缺失或PI3KC2-β中靶磷酸化位點(diǎn)失活抑制mTORC1信號(hào)傳遞[10-12].有文獻(xiàn)顯示，PKN2是Rho的效應(yīng)蛋白，PKN2對(duì)胰腺星狀細(xì)胞(Pancreatic stellate cells，PSC)分化為肌成纖維細(xì)胞分化至關(guān)重要，當(dāng)PKN2基因缺失時(shí)，促進(jìn)PSC的增殖，但收縮力和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscleactin，α-SMA)應(yīng)激降低[13].當(dāng)小鼠敲除PKN2基因時(shí)，胚胎成纖維細(xì)胞不能生長(zhǎng)，導(dǎo)致胚胎致死.此外，研究表明PKN2在培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞和小鼠體內(nèi)脛骨前肌中對(duì)胰島素信號(hào)和糖代謝有重要作用，干擾PKN2通過激活A(yù)MPK信號(hào)降低胰島素刺激葡萄糖攝取、糖原合成和氧化[11-12].其他研究顯示，敲低PKN2促進(jìn)PGC-1α和脂肪合成相關(guān)基因SREBP-1c的轉(zhuǎn)錄及其靶基因的表達(dá)[12].上述結(jié)果表明，PKN2基因?qū)τ谡{(diào)控骨骼肌中的糖脂代謝有重要作用，而目前PKN2基因在牦牛中的作用尚不清楚.

因此，本實(shí)驗(yàn)以牦牛為研究對(duì)象，克隆PKN2的基因序列，對(duì)其CDS序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能進(jìn)行生物信息學(xué)分析；繼而利用qPCR方法檢測(cè)了其在牦牛脂肪、肌肉、睪丸、心臟等部位中的表達(dá)，為進(jìn)一步探究PKN2基因在牦牛脂肪沉積中的作用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品的采集

本實(shí)驗(yàn)樣品均采自四川省成都市青白江唐家寺屠宰場(chǎng)，均由四川阿壩羌族藏族自治州金川縣慶林鄉(xiāng)牦牛養(yǎng)殖場(chǎng)提供.采用頸靜脈放血法處死公牦牛后，使用滅菌后的剪刀采集5～6歲健康牦牛的心、肝、脾、肺、腎、肌肉、脂肪、睪丸等組織樣.將組織樣品用高壓滅菌后的PBS清洗干凈，置于凍存管后裝入液氮罐，運(yùn)回-80℃冰箱后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn).

1.2 主要試劑和儀器

Trizol Reagent、DNA Marker DL5000、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2 x Taq PCR Master mix和2 x SYBR Green qPCR Mixture均購(gòu)自TaKaRa公司；瓊脂糖購(gòu)自Biowest公司；PCR儀(ETC811)購(gòu)自蘇州東盛興業(yè)科學(xué)儀器有限公司；熒光定量PCR儀(CFX96)購(gòu)自美國(guó)Bio Rad公司；瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)(CL1000)購(gòu)自Invitrogen公司；氯仿、無(wú)水乙醇、試劑耗材均購(gòu)自成都鵬世達(dá)有限公司.

1.3 組織總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

使用經(jīng)典Trizol法提取牦牛各個(gè)組織樣的RNA[14]，利用紫外分光光度儀評(píng)估組織RNA的質(zhì)量與濃度，使用諾唯贊的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將OD260/280在1.8～2.0之間的RNA樣進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得各個(gè)組織的cDNA于-20℃?zhèn)溆?

1.4 PKN2基因引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中普通牛PKN2(登錄號(hào):XM_024 988 972.1)基因的預(yù)測(cè)序列，并設(shè)計(jì)合成克隆引物和熒光定量引物；根據(jù)NCBI牦牛數(shù)據(jù)庫(kù)中PPIA(登錄號(hào):NM_178 320)的序列設(shè)計(jì)PPIA內(nèi)參基因的引物，克隆及定量序列片段交于擎科公司合成，如表1所示.

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.5 牦牛PKN2基因的PCR擴(kuò)增及測(cè)序

利用脂肪組織合成的cDNA為模板克隆PKN2基因.PCR擴(kuò)增體系25 μL:2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 3 μL，ddH2O 7.5 μL.PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，退火15 s(退火溫度見表1)，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存.PCR獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖濃度為2%的凝膠進(jìn)行電泳，切取目的片段于離心管中，使用試劑盒進(jìn)行回收及純化步驟.最終得到的20 μL PCR純化液送至擎科公司進(jìn)行雙向測(cè)通.

1.6 PKN2基因生物信息學(xué)分析

對(duì)牦牛PKN2基因進(jìn)行生物學(xué)分析軟件和功能分析見表2.

表2 生物信息學(xué)分析軟件與在線網(wǎng)址Table 2 Bioinformatics analysis software and online websites

1.7 牦牛PKN2基因qPCR擴(kuò)增

以脂肪中PPIA的相對(duì)表達(dá)量作為參考，利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)PKN2基因在各個(gè)組織(心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、脂肪、睪丸)表達(dá)量，三頭公牦牛為三個(gè)生物學(xué)重復(fù)且設(shè)置三個(gè)技術(shù)重復(fù).RT-qPCR的反應(yīng)體系為:2 x SYBR Green qPCR Mixture 7.5 μL、上下游引物各0.5 μL、5.5 μL ddH2O、1 μL cDNA.反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性4 min；(95℃，10 s；60℃，30 s；72℃，45 s)45個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min.讀取溶解曲線，檢測(cè)PKN2基因在牦牛各個(gè)組織中的表達(dá)情況.

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

RT-PCR結(jié)果利用2-ΔΔCt法計(jì)算PKN2在各個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量，利用GraphPad Prism 8中的one way-ANOVA程序分析各個(gè)組織的差異顯著性，當(dāng)P＜0.05時(shí)，表示差異顯著.

2 結(jié)果

2.1 牦牛PKN2基因產(chǎn)物檢測(cè)

以脂肪組織提取的cDNA為模板，如圖1所示獲得牦牛PKN2基因全長(zhǎng)為2 915 bp，與預(yù)期目的產(chǎn)物大小相符.NCBI ORF Finder在線獲得PKN2預(yù)測(cè)序列及翻譯的氨基酸序列，開放閱讀框大小為942 bp，共編碼313個(gè)氨基酸.

圖1 牦牛PKN2基因克隆Fig.1 Gene clone of yak PKN2

2.2 牦牛PKN2基因生物信息學(xué)分析

2.2.1 PKN2基因同源性比對(duì)和構(gòu)建進(jìn)化樹

利用在線BLAST對(duì)牦牛與穿山甲、大鼠、狗、馬、綿羊、普通牛、人、山羊、小鼠、雞、野豬的PKN2基因核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)，核苷酸與氨基酸比對(duì)結(jié)果為表3所示，牦牛與普通牛序列相似度最高，分別為99.84%和99.88%，與雞的核苷酸序列和氨基酸序列相似度最低，僅分別為84.59%和91.39%.同時(shí)發(fā)現(xiàn)牦牛與下表其他物種的核苷酸與氨基酸序列的相似性均在84.59%以上，表明PKN2基因在以下物種進(jìn)化過程中具有高度保守性[15].

表3 牦牛PKN2基因與其他物種的核苷酸、氨基酸序列對(duì)比結(jié)果Table 3 Comparison of nucleotide and amino acid sequences of PKN2 gene among yak and other species

此外，用MEGA 7.0構(gòu)建牦牛PKN2基因與其他物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示為圖2，與序列結(jié)果比對(duì)一致，牦牛首先與普通牛在分類學(xué)上聚為一類，其次與反芻動(dòng)物山羊、綿羊一類，與斑馬魚的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，說(shuō)明進(jìn)化過程比較保守.以上分析結(jié)果表明PKN2基因符合物種進(jìn)化規(guī)律.

圖2 牦牛與其他物種的PKN2基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 The phylogenetic tree of PKN2 in yak and other species

2.2.2 牦牛PKN2蛋白理化性質(zhì)分析

使用ExPASy-ProtParam、TMHMM 2.0、Signal P 5.0等在線工具對(duì)PKN2蛋白的理化性質(zhì)分析，得到其蛋白分子式為C4742H7535N1319O1442S38，分子質(zhì)量為107 315.25 U，氨基酸數(shù)為942；PKN2蛋白的氨基酸組成中含量最高的三種氨基酸分別是亮氨酸(Leu)10.2%、谷氨酸(Glu)8.2%、絲氨酸(Ser)7.9%.帶正電荷(Arg＋Lys)的氨基酸總數(shù)為126，帶負(fù)電荷(Asp＋Glu)的氨基酸總數(shù)為142.PKN2在哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞中半衰期為30 h；脂肪指數(shù)為82.68；親水性平均值為(GRAVY):-0.492；不穩(wěn)定指數(shù)(Ⅱ)為50.33.提示PKN2蛋白屬于親水不穩(wěn)定蛋白.

利用TMHMM 2.0在線工具分析發(fā)現(xiàn)PKN2蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽；使用PSORTII在線工具分析發(fā)現(xiàn)，PKN2蛋白主要存在于細(xì)胞核(65.2%)，也存在于細(xì)胞質(zhì)(26.1%)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(4.3%)、線粒體(4.3%)[16].使用Net Phos 3.1在線工具預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)牦牛PKN2蛋白有101個(gè)磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果顯示為圖3，其中絲氨酸(Ser)磷酸化位點(diǎn)67個(gè)、蘇氨酸(Thr)磷酸化位點(diǎn)29個(gè)、酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(diǎn)5個(gè)[17].

圖3 牦牛PKN2蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)圖Fig.3 Phosphorylation site of PKN2 protein predicted in yak

2.2.3 牦牛PKN2蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

利用SOPMA在線工具預(yù)測(cè)PKN2蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，PKN2蛋白在α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲等中分別占比為41.61%、10.62%、4.67%、43.10%(圖4A和4B).此外，利用SWISS-MODEL在線工具預(yù)測(cè)PKN2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致[17](圖4C).

圖4 牦牛PKN2蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 The prediction of secondary and tertiary structure of PKN2 protein in yak

2.2.4 蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析

根據(jù)STRING 11.0在線工具分析顯示為圖5，與PKN2緊密作用的蛋白有RHOA、PKN3、KYAT3、PDPK1、PIK3CA、AKT3、YWHAE等.其中RhoA被研究報(bào)道調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo).在胰島素敏感性細(xì)胞中，如脂肪和肌肉細(xì)胞，敲除RhoA可以減少兩種細(xì)胞類型中胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，相反的RhoA過表達(dá)抑制該生物學(xué)過程.進(jìn)一步的分子機(jī)制解析發(fā)現(xiàn)RhoA主要是通過與PKN2蛋白的C端相互作用，激活PKN2蛋白活性，該過程依賴于GTP[18].此外，有文獻(xiàn)報(bào)道，Akt3通過賴氨酸蛋白激酶1(with no lysine K1，WNK1)和血清/糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)激酶1(serum and glucocorticoid-inducible kinase 1，SGK1)抑制脂肪生成途徑，抵抗飲食誘導(dǎo)肥胖的發(fā)生[19].由此可見PKN2蛋白可能通過與RHOA和AKT等蛋白相互作用，參與糖脂代謝.

圖5 牦牛PKN2蛋白互作圖Fig.5 Yak PKN2 protein interaction

2.3 牦牛PKN2基因在不同組織中的表達(dá)

以脂肪中PPIA的相對(duì)表達(dá)量作為參考，利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)PKN2基因在牦牛不同組織(心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、脂肪、睪丸)的mRNA表達(dá)水平.如圖6所示，PKN2基因在8個(gè)組織中均有表達(dá)，在脂肪組織中表達(dá)量最高，極顯著高于肝臟和睪丸組織(P＜0.01)，顯著高于心臟、脾臟、肺臟(P＜0.05).

圖6 牦牛PKN2基因在不同組織中的表達(dá)Fig.6 The expression level of PKN2 gene in different tissues of yak

3 討論

牦牛作為青藏高原的優(yōu)勢(shì)畜種，對(duì)生活在高海拔地區(qū)的人民具有重要的意義[20，21].在高原地區(qū)，牦牛處于“夏肥、秋壯、冬瘦、春乏”的季節(jié)性生長(zhǎng).脂肪組織作為潛在的能量供應(yīng)器官，對(duì)牦牛的季節(jié)適應(yīng)性尤為重要[22，23]，在枯草期維持了牦牛機(jī)體的基本能量需求和抵抗外界的嚴(yán)寒[24].目前關(guān)于牦牛脂肪組織脂質(zhì)代謝分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)及其調(diào)控因子仍不清楚.

本實(shí)驗(yàn)采用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到了牦牛PKN2基因的全長(zhǎng)序列，發(fā)現(xiàn)ORF區(qū)為942 bp，共編碼313個(gè)氨基酸.生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PKN2為不穩(wěn)定親水蛋白，沒有跨膜結(jié)構(gòu).PKN2共由101個(gè)磷酸化位點(diǎn)構(gòu)成，其中絲氨酸(Ser)含量最多，蘇氨酸(Thr)次之，酪氨酸(Tyr)含量最少，分別為66%、29%和5%.PKN2是一種具有催化活性的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯后修飾中起重要的作用[25].PKN2的二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲組成，分別占比為41.61%、10.62%、4.67%、43.10%.三級(jí)結(jié)構(gòu)域與二級(jí)結(jié)構(gòu)相似.同源性對(duì)比發(fā)現(xiàn)牦牛與普通牛、綿羊、山羊有較高的相似性，PKN2基因在進(jìn)化上相對(duì)保守.

RT-qPCR結(jié)果顯示，脂肪在牦牛組織中表達(dá)量最高，與睪丸和肝臟差異極顯著，與肌肉和腎臟差異不顯著.有文獻(xiàn)報(bào)道，PKN2過表達(dá)會(huì)促進(jìn)C2C12成肌細(xì)胞的分化，而不影響細(xì)胞的存活[26].體外干擾肌細(xì)胞中的PKN2表達(dá)，降低胰島素刺激葡萄糖攝取、糖原合成和氧化；體內(nèi)敲除PKN2也抑制葡萄糖攝取并提高了AMPK的磷酸化水平.在脂代謝研究方面，文獻(xiàn)報(bào)道PKN2 siRNA處理肌細(xì)胞通過AMPK信號(hào)通路刺激脂肪酸氧化和甘油三酯的合成，減少蛋白組合成，伴隨著脂代謝相關(guān)基因PGC-1α和SREBP-1c及其靶基因的表達(dá)的上調(diào)[12].通過蛋白互作發(fā)現(xiàn)，PKN2可以與AKT3相互作用，AKT3也是一種蛋白激酶，將敲除了AKT3基因的小鼠進(jìn)行高脂飼喂，發(fā)現(xiàn)能阻斷糖皮質(zhì)激素酶1，從而抑制小鼠脂肪的生成[19].因此我們推測(cè)PKN2基因在骨骼肌與脂肪沉積中有一定的調(diào)控作用.

4 結(jié)論

本試驗(yàn)成功克隆出牦牛PKN2基因的完整CDS區(qū)，其長(zhǎng)度為942 bp，共編碼313個(gè)氨基酸，核苷酸和氨基酸對(duì)比發(fā)現(xiàn)該基因在進(jìn)化過程中具有高度保守性；PKN2基因在各個(gè)組織中均有表達(dá)，在脂肪中的表達(dá)量最高.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)進(jìn)一步研究PKN2基因調(diào)控牦牛的脂肪沉積提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).