權(quán)永剛，姜輝，武曉剛，楊恒超，藺懷龍，常寶學(xué)，郭建強(qiáng)，陳愛(ài)民

(1.九圣禾種業(yè)股份有限公司，新疆 昌吉 831100；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北內(nèi)陸棉花品種創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 昌吉 831100)

棉花是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物和紡織工業(yè)原料，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中具有不可替代的地位。根據(jù)棉花種植區(qū)域的生態(tài)條件以及生產(chǎn)的特點(diǎn)，我國(guó)棉花生產(chǎn)主要集中在黃河流域、長(zhǎng)江流域和西北內(nèi)陸三大棉區(qū)。近年來(lái)，隨著國(guó)內(nèi)外經(jīng)濟(jì)形勢(shì)的變化和國(guó)家產(chǎn)業(yè)政策的調(diào)整，我國(guó)棉花生產(chǎn)區(qū)域化，種植面積在長(zhǎng)江流域和黃河流域大幅下滑，機(jī)械化水平較高的新疆成為我國(guó)主產(chǎn)棉區(qū)，也是我國(guó)唯一的長(zhǎng)絨棉產(chǎn)區(qū)，其棉花種植面積和產(chǎn)量達(dá)到全國(guó)的80%以上。隨著棉花產(chǎn)業(yè)形勢(shì)的發(fā)展，中國(guó)培育和審定棉花新品種的速度快且數(shù)量多，而棉花長(zhǎng)期遺傳定向改良，骨干親本數(shù)量有限且反復(fù)集中利用，導(dǎo)致新疆棉花品種的遺傳基礎(chǔ)較為單一，遺傳差異越來(lái)越小，完全依據(jù)傳統(tǒng)生物學(xué)形態(tài)特征進(jìn)行棉花品種的辨別和分類越來(lái)越困難。同時(shí)，推向大田生產(chǎn)的速度也在加快，導(dǎo)致新疆種子市場(chǎng)“混、雜、亂”現(xiàn)象突出，嚴(yán)重阻礙了棉花產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。

分子標(biāo)記因不受環(huán)境影響且可以從 DNA分子層面上反映出生物個(gè)體間的遺傳差異而被廣泛應(yīng)用。目前，在植物育種中使用的分子標(biāo)記很多，其中，SSR標(biāo)記(簡(jiǎn)單重復(fù)序列，Simple Sequence Repeat)因其多態(tài)性豐富，遺傳上呈共顯性， 重復(fù)性好，且覆蓋整個(gè)基因組的編碼區(qū)和非編碼區(qū)，目前已被廣泛用于作物品種指紋圖譜構(gòu)建和遺傳多樣性分析中。馬軒，等(2003)、潘兆娥，等(2010)、李成奇，等(2011)、孫寧，等(2011)、匡猛，等(2011)、趙亮，等(2012)、馮艷芳，等(2015)利用SSR分子標(biāo)記分別構(gòu)建了“18個(gè)彩色棉品系、中棉所48、百棉系列棉花自交系品種(系)、2009年度黃河流域國(guó)家棉花區(qū)試57份參試品材料、2008年中國(guó)3大棉區(qū)8個(gè)棉花主產(chǎn)省份32份棉花主栽品種、12個(gè)不同來(lái)源系統(tǒng)的棉花品種、20份新疆棉花品種”的DNA指紋圖譜以及進(jìn)行遺傳多樣性分析。

本研究擬通過(guò)對(duì)新疆190份棉花材料進(jìn)行遺傳多樣性評(píng)價(jià)，為育種家在種質(zhì)資源創(chuàng)制、親本有效選配和品種合理種植提供有效參考，使雜交親本的選擇更有針對(duì)性，減少配置雜交組合的盲目性，提高雜交后代育種選擇效率，從而加快棉花新品種的選育。

1 材料與方法

1.1 材料

190份不同的棉花種質(zhì)材料均來(lái)自于新疆的農(nóng)家種，包括80份北疆主栽棉花品種和110份南疆主栽棉花品種；根據(jù)山東棉花中心前期研究的報(bào)道，選取26個(gè)棉花基因組SSR標(biāo)記用于本次實(shí)驗(yàn)研究。SSR引物由北京擎科生物科技有限公司。

1.2 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)與性狀調(diào)查

2021年，80份北疆主栽棉花品種種植于新疆昌吉州瑪納斯縣六戶地鎮(zhèn)陳家渠村，膜幅寬2.05 m，一膜6行，行距為66 cm和10 cm模式，株距9.5 cm，密度為277020 株/公頃， 拖拉機(jī)將地膜滴灌帶鋪好，機(jī)械膜上打孔劃區(qū)人工點(diǎn)播；110份南疆主栽棉花品種種植于庫(kù)爾勒市阿瓦提農(nóng)場(chǎng)4分場(chǎng)，密度為205125 株/公頃。田間大田管理方法均同常規(guī)大田；吐絮后，收花軋花考種，考種后每個(gè)材料稱取20 g棉樣，寄送農(nóng)業(yè)部棉花品質(zhì)監(jiān)督測(cè)試中心(安陽(yáng))利用 HVI1000 測(cè)定，采用 HVICC 國(guó)際校準(zhǔn)棉樣，測(cè)定纖維上半部平均長(zhǎng)度、整齊度指數(shù)、斷裂比強(qiáng)度、馬克隆值和伸長(zhǎng)率5項(xiàng)纖維品質(zhì)指標(biāo)。

1.3 DNA提取和PCR擴(kuò)增

在培養(yǎng)箱中種植供試材料，溫度28℃，光照 16h/8h 黑暗，濕度60%。兩葉一心期，每個(gè)供試材料隨機(jī)選取三株，每株取幼嫩新鮮的葉片混合于2 ml的EP管內(nèi)，加入700 uL提取液，并在每一管中加入一粒鋼珠，用全自動(dòng)樣品快速研磨儀研磨180 s，最后利用改良的CTAB法提取棉花基因組DNA。DNA純度和濃度使用多功能酶標(biāo)儀(SparkTM 10M)檢測(cè)。

PCR反應(yīng)體系為10 μL：DNA模板2 μL，2×3G Taq Master Mix for PAGE(Red Dye)5.0 ul，前后引物各0.5 μL，ddHO 2.0 μL。本實(shí)驗(yàn)使用的2×3G Taq Master Mix for PAGE(Red Dye)購(gòu)于南京諾唯贊生物技術(shù)公司，包含3G Taq DNA Polymerase、dNTP Mix、可視化紅色染料和優(yōu)化的緩沖體系；PCR熱循環(huán)程序：第一步，95℃預(yù)變性5 min，第二步，94℃變性30 s，第三步，55℃退火45 s，第四步，72℃延伸1 min，第二步到第四步30個(gè)循環(huán)，第五步，72℃延伸10 min，10℃保存。

1.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)在8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，具體操作步驟如下：把成套的兩塊干凈的玻璃板對(duì)齊，平放，兩邊用夾子夾緊，至于平板上；用玻璃棒引流，緩慢倒入8%的聚丙烯酰胺凝膠(29∶1)，插入梳子，放置15 min；待膠凝固后，松掉夾子，把有凝膠的玻璃板裝入電泳槽中，倒入1×TBE電泳緩沖液，并用夾子兩邊加緊，繼續(xù)加入電泳緩沖液，沒(méi)過(guò)凝膠，拔梳子；點(diǎn)樣(上樣量為1 μL)，180 V恒壓環(huán)境下電泳1.5 h。讀帶標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)于同一引物在190個(gè)品種中擴(kuò)增出的條帶，帶型占多數(shù)的帶型記錄為1，其余記錄為2、3、4等。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

190份棉花材料農(nóng)藝性狀的最小值、最大值、平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差以及變異系數(shù)等描述性統(tǒng)計(jì)信息使用 Microsoft Excel 2016 進(jìn)行分析，并使用 Shannon 多樣性指數(shù)衡量研究上述材料的遺傳多樣性，公式為： H′ = -∑PLnP；采用POPGENE 32軟件計(jì)算基于26對(duì)SSR分子標(biāo)記的群體等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)和多樣性指數(shù)(Shannon，H′)等。使用PowerMarker 3.25計(jì)算主要等位基因頻率(Minor Allele frequencies, MAF)和多態(tài)性信息量(polymorphism information content，PIC)等，并根據(jù)Nei's分子遺傳距離進(jìn)行非加權(quán)組平均法(Unweighted Pair-group Method With Arithmetic Means, UPGMA)聚類分析，最終使用MEGA 5.2 軟件繪制樹(shù)形聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型性狀的遺傳多樣性分析

收集的新疆190份棉花資源在8個(gè)主要性狀上呈現(xiàn)較大的變幅度范圍(表1)，籽棉產(chǎn)量最大值為7674.00 kg/hm，最小值為1250.10 kg/hm，平均值為5589.61 kg/hm，變異幅度為6423.90 kg/hm；皮棉產(chǎn)量最大值為3551.25 kg/hm，最小值為390.00 kg/hm，平均值為2337.25 kg/hm，變異幅度為 3161.25 kg/hm；衣分最大值為54.93%，最小值為28.90%，平均值為41.15%，變異幅度為26.03%；纖維長(zhǎng)度最大值為40.00 mm，最小值為26.90 mm，平均值為32.35 mm，變異幅度為13.10 mm；斷裂比強(qiáng)度最大值為53.00 cN/tex，最小值為26.00 cN/tex，平均值為35.48 cN/tex，變異幅度為27.00 cN/tex；馬克隆值最大值為 5.50，最小值為3.30，平均值為4.40，變異幅度為2.20；纖維整齊度最大值為89.30%，最小值為80.50%，平均值為85.12%，變異幅度為8.80%；纖維伸長(zhǎng)率最大值為14.00%，最小值為2.80%，平均值為6.79%，變異幅度為11.20%。

新疆190份棉花資源在8個(gè)主要性狀上呈現(xiàn)較為豐富的表型變異(表2)，變異系數(shù)(CV)范圍為2.06%～25.62%，其中3個(gè)產(chǎn)量相關(guān)性狀中，皮棉產(chǎn)量(25.62%)的變異系數(shù)最高，超過(guò)了20%，而籽棉產(chǎn)量和衣分的變異系數(shù)分別為18.73%和12.13%。與纖維品質(zhì)相關(guān)的5個(gè)性狀，變異系數(shù)變化范圍較大，為2.06%～22.13%，其中斷裂比強(qiáng)度的變異系數(shù)最大(22.13%)，依次為伸長(zhǎng)率(16.70%)、上半部平均長(zhǎng)度(11.52%)和馬克隆值(10.88%)，而整齊度指數(shù)的變異系數(shù)最小(2.06%)。香農(nóng)(Shannon)多樣性指數(shù)范圍為1.4771～2.0631，以纖維整齊度的最高，纖維斷裂比強(qiáng)度的最低，7 個(gè)纖維性狀指標(biāo)的Shannon多樣性指數(shù)均高于1.4000。

表1 新疆190份棉花材料主要性狀的統(tǒng)計(jì)參數(shù)

表2 新疆190份棉花材料主要性狀的多樣性情況

2.2 SSR 核心引物擴(kuò)增位點(diǎn)

利用26 對(duì)SSR 核心引物在新疆190份棉花材料中累計(jì)檢測(cè)到179個(gè)等位基因位點(diǎn)，等位基因位點(diǎn)變幅度范圍為3～14個(gè)，平均為6.88個(gè)(表3)；累計(jì)有效等位基因數(shù)(Ne)為96.5017，變幅范圍為2.2284～6.0081，平均值為3.7116；主要等位基因頻率(MAF)的變幅范圍為0.2849～0.5632，平均值為0.4084；基因多樣性指數(shù)變幅度范圍為0.5512～0.8336，平均值為0.7150；多態(tài)性信息含量(PIC)值的變幅度范圍為0.4525～0.8147，平均值為0.6714，Shannon 多樣性指數(shù)(H′)變幅度范圍為0.9221～2.0435，平均值為1.4562。

2.3 基于26個(gè)SSR標(biāo)記的聚類分析

利用26個(gè)SSR分子標(biāo)記信息對(duì)新疆190份棉花材料進(jìn)行Nei's分子遺傳距離計(jì)算，并構(gòu)建復(fù)合的一致性系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，將其分為8個(gè)類群，其中類群Ⅰ包含38份材料，類群Ⅱ包含19份材料，類群Ⅲ包含27份材料，類群Ⅳ包含21份材料，類群Ⅴ包含18份材料，類群Ⅵ包含31份材料，類群Ⅶ包含12份材料，Ⅷ包含24份材料(圖1)。

表3 新疆190份棉花材料 26個(gè)SSR位點(diǎn)的遺傳多樣性信息

8個(gè)類群在3個(gè)產(chǎn)量性狀(籽棉產(chǎn)量、皮棉產(chǎn)量和衣分)的平均值范圍分別為3468.67～6261.15 kg/hm、1486.97～2803.6 kg/hm和32.43%～44.61%，其中類群Ⅰ在3個(gè)產(chǎn)量性狀指標(biāo)中最小，類群Ⅷ最大；纖維品質(zhì)相關(guān)的5個(gè)性狀指標(biāo)中，纖維上半部平均長(zhǎng)度和斷裂比強(qiáng)度在8個(gè)類群的平均值范圍分別為29.52～39.04 mm和29.45～50.22 cN/tex， 類群Ⅳ最小，類群Ⅰ最大，馬克隆值的平均值范圍為4.11～4.80，類群Ⅰ最小，類群Ⅳ最大，纖維整齊度指數(shù)和伸長(zhǎng)率的平均值分別為84.16%～87.46%和6.12%～7.53%，類群Ⅴ最小，類群Ⅰ最大(圖1，表4)。

表4 新疆190份棉花材料各類群主要性狀的平均值統(tǒng)計(jì)

3 結(jié)論和討論

遺傳多樣性分析是作物種質(zhì)資源評(píng)價(jià)的重要方面，可以為育種家們?cè)诜N質(zhì)資源創(chuàng)新和親本選配過(guò)程中提供有力參考，使雜交親本的選擇更有針對(duì)性，從而提高雜交后代育種選擇效率。本研究對(duì)新疆190份棉花材料進(jìn)行了表型性狀的遺傳多樣性分析，8個(gè)主要性狀呈現(xiàn)出較為豐富的表型變異，表型變異系數(shù)范圍為2.06%～25.62%，香農(nóng)(Shannon) 多樣性指數(shù)范圍為1.4771～2.0631， 其中7 個(gè)性狀的香農(nóng)(Shannon)多樣性指數(shù)均高于1.4000。綜上數(shù)據(jù)說(shuō)明，190份棉花材料表現(xiàn)出了較高的遺傳多樣性，資源類型比較豐富，利于特異種質(zhì)資源的篩選和核心種質(zhì)的提取。

分子標(biāo)記能夠從DNA水平反映生物個(gè)體間基因組中的某些差異，且不受環(huán)境影響，被廣泛應(yīng)用于作物的遺傳多樣性分析和品種間的親緣關(guān)系鑒定。本研究利用26對(duì)SSR核心引物對(duì)新疆收集的190份棉花材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，基因多樣性指數(shù)變幅度范圍為0.5512～0.8336，多態(tài)性信息含量(PIC)值的變幅度范圍0.4525～0.8147，香農(nóng)(Shannon)多樣性指數(shù)(H′)變幅度范圍為0.9221～2.0435，說(shuō)明SSR標(biāo)記的遺傳信息比較豐富，190份棉花材料在DNA水平存在一定的遺傳多樣性。

基于26個(gè)SSR分子標(biāo)記信息，本研究對(duì)新疆190份棉花材料進(jìn)行了Nei's分子遺傳距離計(jì)算，將其分為8個(gè)類群，除了類群Ⅰ與其他7個(gè)類群分子遺傳距離較遠(yuǎn)外，其余7個(gè)類群分子遺傳距離較小。8個(gè)類群在8個(gè)主要性狀上呈現(xiàn)較為豐富的表型變異， 3個(gè)產(chǎn)量性狀(籽棉產(chǎn)量、皮棉產(chǎn)量和衣分)的平均值范圍分別為4468.67～6261.15 kg/hm、1486.97～2803.6 kg/hm和32.43%～44.61%，5個(gè)纖維品質(zhì)性狀(上半部平均長(zhǎng)度、斷裂比強(qiáng)度、馬克隆值、纖維整齊度指數(shù)和伸長(zhǎng)率)在8個(gè)類群的平均值范圍分別為29.52～39.04 mm、29.45～50.22 cN/tex、4.11～4.80、84.16%～87.46%和6.12%～7.53%。 類群Ⅰ的纖維上半部平均長(zhǎng)度、斷裂比強(qiáng)度、整齊度指數(shù)和伸長(zhǎng)率最優(yōu)，而籽棉產(chǎn)量、皮棉產(chǎn)量和衣分較低；類群Ⅷ的籽棉產(chǎn)量、皮棉產(chǎn)量和衣分較高，而纖維上半部平均長(zhǎng)度和斷裂比強(qiáng)度最低。遺傳相似系數(shù)聚類分析結(jié)果反映了新疆190份棉花材料之間的親緣關(guān)系，今后應(yīng)將更豐富的形態(tài)信息與分子數(shù)據(jù)結(jié)合在一起形成指紋圖譜，使品種信息更加全面、準(zhǔn)確，從而為后續(xù)棉花種質(zhì)資源創(chuàng)新和新品種選育提供了科學(xué)依據(jù)。

圖1 基于SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)的新疆190份棉花材料的遺傳聚類圖