艾 姣，劉俊梅，閆 明

(榆林學院，陜西 榆林 719000)

生物修復技術(shù)是指利用原生或外部加入微生物的新陳代謝作用，降低有害物質(zhì)濃度[1-3]。此類問題的研究吸引了許多生物學家、數(shù)學工作者和工程技術(shù)人員的興趣[1]，是目前國內(nèi)外非?；钴S的研究課題之一。有效的生物修復技術(shù)依賴于準確預測微生物濃度的變化[4]，直接影響著污染物濃度的變化。生物參與修復的過程可以分為2類：基質(zhì)(污染物和營養(yǎng)物)和生物種群[5-7]，可理解為微生物對基質(zhì)進行同化降解，使其濃度降低或轉(zhuǎn)變?yōu)闊o害物質(zhì)，達到凈化土壤和水資源的目的。生物修復過程涉及到非常復雜的相互作用的生物化學反應過程[8]，并且現(xiàn)實世界中廣泛存在的環(huán)境波動(如光照強度、雨水供給量、pH值變化、氮磷營養(yǎng)物輸入濃度等)，使得生物修復過程不可避免受到這些不確定因素的干擾。雖然取得了許多令人滿意的結(jié)果，但將實驗室結(jié)果應用于現(xiàn)場實踐后，往往達不到預期的效果，有些實際情況甚至與實驗結(jié)果相差甚遠[9]。

現(xiàn)階段，研究人員利用接種耐受型微生物，建立結(jié)皮，修復土壤生物，解決土壤污染問題，研究發(fā)現(xiàn)藍藻土壤接種，可提升土壤溶解性，加快生物修復速度[10]；研究人員通過在土壤內(nèi)提取耐受性強菌株，修復土壤生物，研究表明，菌株可提升土壤生物的富集率與遷移率，有效修復土壤生物[11]。但上述技術(shù)均未考慮隨機影響因子，如重金屬污染、石油污染等具有隨機性的污染物對土壤生物修復技術(shù)的影響，為此研究重金屬污染影響下的礦區(qū)土壤生物修復技術(shù)，提升生物修復效果。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

該研究區(qū)是一個以結(jié)晶變質(zhì)巖系及其上地臺構(gòu)造層為基底，在新生代地殼水平拉張應力作用下逐漸裂解斷陷而成的雙斷式凹陷，走向北窄南寬，呈琵琶狀。該凹陷形成過程中，在古生界基巖上，沉積了一套巨厚以下第三系為主的中、新生界陸相沙泥巖地層，是油氣生成與儲存的極有利地區(qū)，同時，土壤類型有潮土、風砂土和堿土3個土類，9個亞類，15個土屬，62個土種，為平地、崗洼、沙丘、溝河相間的地貌特征，因湖相沉積發(fā)育廣泛，下第三系沉積很厚，對油氣生成及儲存極為有利。已知的主要礦藏是石油、天然氣、煤炭，另外還有鹽、鐵、鋁等。在開采區(qū)內(nèi)1 000 km2范圍內(nèi)，礦區(qū)最高海拔+876 m，最低+51 m，四季區(qū)分度較高，全年氣候較為濕潤，日氣溫最高可達41.3 ℃，最低-10 ℃，年均降水量1 542.5 mm，年均蒸發(fā)量1 432.8 mm。該礦區(qū)共包含3個區(qū)域，該礦區(qū)土壤內(nèi)主要包含銅、錳、鋅、鉛、鉻、砷重金屬，各區(qū)域的基本情況見表1。

表1 各區(qū)域的基本情況Tab.1 Basic information of each region

1.2 樣本采集

各個區(qū)域內(nèi)均設置4個采樣點，一共20個采樣點，如圖1所示。

圖1 采樣點分布Fig.1 Distribution of sampling points

依據(jù)5點采樣法，選擇礦區(qū)內(nèi)各區(qū)域土壤表層厚0～30cm的土樣，去掉雜物后按照4分法取樣6kg，放進聚乙烯自封袋內(nèi)，帶回實驗室，當樣品無水分后[12-14]，將其碾碎，選擇1.5 mm的尼龍篩進行篩選，用于展開試驗分析。

1.3 試驗設計

該礦區(qū)內(nèi)共包含重金屬污染與石油污染2種影響因子，對于重金屬污染影響問題，通過響應面優(yōu)化法配比糞肥與熟石灰的改良劑，共設計5種配比方案，糞肥含量分別是15 g/kg與35 g/kg，熟石灰含量是10 g/kg與20 g/kg，并設置空白試驗，分析重金屬污染影響下，不同糞肥與熟石灰配比時的礦區(qū)土壤生物修復效果。

對于石油污染影響問題，共設計3種礦區(qū)土壤生物修復技術(shù)，分別是保持土壤濕度20%(WHC)，生物強化修復(BA)與生物刺激修復(BS)，BA是通過Bush-hass，在石油污染礦區(qū)土壤內(nèi)分離得到降解菌，將其作為接種菌修復土壤生物；BS是在石油污染礦區(qū)土壤內(nèi)添加氮磷營養(yǎng)液，修復土壤生物。

2種影響因子影響下生物修復方案的修復時間均為7周。

1.4 測定方法

1.4.1 重金屬污染影響下的測定方法

重金屬污染影響下的土壤理化性質(zhì)測定方法見表2。

表2 土壤理化性質(zhì)測定方法Tab.2 Determination methods of soil biological and physicochemical properties

通過BCR三步提取法測定礦區(qū)的重金屬有效態(tài)，分析不同改良劑配比時礦區(qū)土壤生物修復效果，具體步驟如下。

(1)步驟1。選擇烘干后質(zhì)量為0.9 g的礦區(qū)土壤樣品，將其放入離心管內(nèi)，其容量為150 mL，材質(zhì)為聚丙烯[15-16]，在離心管內(nèi)添加0.1 mol/L的醋酸，添加量35 mL，在室溫下混合24 h，混合時需保證樣本呈懸浮狀態(tài)，再離心處理15 min，取出上清液，放入聚乙烯瓶內(nèi)，添加二次去離子水至殘渣內(nèi)，添加量20mL，混合20min，離心處理25min，再次取出上清液[17]，放入聚乙烯瓶內(nèi)，剩余殘渣為重金屬的可交換態(tài)及碳酸鹽結(jié)合態(tài)。

(2)步驟2。在步驟1的殘渣內(nèi)添加0.1 mol/L鹽酸羥胺，添加量35 mL，搖晃試管令殘渣均勻分布，重復步驟1的操作，獲取剩余殘渣[18-19]，即重金屬的鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)。

(3)步驟3。在步驟2的殘渣內(nèi)添加6.6 mol/L的雙氧水，添加量10 mL，密封離心管，避免樣品出現(xiàn)強烈反應，室溫下存放2 h，存放期間每隔20 min搖晃一下離心管，存放時間結(jié)束后，將其放入砂浴鍋內(nèi)，溫度維持在80 ℃，泡2 h后取出，在溶液蒸發(fā)到幾乎無水分時[20]，放涼，添加1.5 mol/L醋酸銨，添加量50 mL，依據(jù)步驟1的操作得到殘渣，即重金屬的有機物及硫化物結(jié)合態(tài)。

1.4.2 石油污染影響下的測定方法

利用高通量測序分析法，分析石油污染影響下的WHC、BA與BS三種修復方案時的土壤生物修復效果，具體步驟如下。

(1)步驟1。通過OMEGA試劑盒采集礦區(qū)土壤樣品的總DNA，通過DNA檢測試劑盒精準定量基因組DNA，通過通用引物擴增土壤生物的聚合酶鏈式反應(PCR)，添加PCR兼容引物，展開2輪擴增。

(2)步驟2。擴增完成后，通過瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物，并回收PCR產(chǎn)物，通過DNA檢測試劑盒分析PCR產(chǎn)物的DNA，等量混合各樣品的DNA。

(3)步驟3。通過Prinseq軟件控制土壤生物高通量測序結(jié)果質(zhì)量，求解生物多樣性指數(shù)。

通過最大可能數(shù)法，確定石油污染影響下的土壤內(nèi)降解菌數(shù)目。

2 試驗分析

2.1 重金屬污染影響下生物修復土壤理化性質(zhì)

分析不同改良劑配比修復生物時，重金屬污染影響下，礦區(qū)土壤的理化性質(zhì)變化情況，分析結(jié)果見表3、表4。

表3 不同改良劑配比修復生物后的土壤物理性質(zhì)Tab.3 Soil physical properties after bioremediation with different proportions of amendments

表4 不同改良劑配比修復生物后土壤化學性質(zhì)Tab.4 Soil chemical properties after bioremediation with different proportions of amendments

根據(jù)表3可知，方案1是未進行生物修復處理的土壤，方案5是糞肥與熟石灰均達到最高含量配比的生物修復處理后的土壤。經(jīng)過改良劑進行生物修復的土壤容重均低于方案1，改良劑含量越多，土壤容重下降量越大，容重最低的方案是方案5；僅有方案2的最大持水量低于方案1，其余3種方案的最大持水量均明顯高于方案1，最大出水量最高的方案是方案3；經(jīng)過改良劑進行生物修復的土壤黏粒含量明顯高于方案1，黏粒含量最高的方案是方案3；綜合分析可知，添加適量的改良劑，可有效修復重金屬污染影響下的礦區(qū)土壤生物，最優(yōu)糞肥、熟石灰配比為15 g/kg與20 g/kg，此時礦區(qū)土壤的物理形狀提升效果最為顯著，土壤黏粒含量最高，會提升土壤的持水能力，令生物修復后的土壤適合植物生長。

根據(jù)表4可知，經(jīng)過改良劑修復生物后，土壤的pH值由弱酸性逐漸轉(zhuǎn)變成酸性，最后變成堿性，熟石灰含量對土壤pH值影響較小，糞肥含量的增加，導致土壤由酸性轉(zhuǎn)為堿性，最接近中性的方案是方案4，此時的土壤最適合植物生長，添加過量的改良劑會導致土壤呈堿性，不利于植物生長；隨著改良劑修復生后，土壤內(nèi)的其余化學成分含量均高于方案1，各化學成分含量最高的是方案4，說明添加改良劑后可有效修復土壤生物，提升土壤內(nèi)的化學成分含量，令修復后的土壤適合植物生長。綜合分析可知，最優(yōu)糞肥、熟石灰配比為35 g/kg與10 g/kg，此時土壤化學性質(zhì)提升效果最為顯著。

2.2 重金屬污染影響下重金屬含量與形態(tài)分布

以Cu、Pb與As為例，分析改良劑修復生物后，重金屬污染影響下，土壤內(nèi)重金屬含量與重金屬形態(tài)的變化情況，分析結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同生物修復方案時土壤內(nèi)Cu、Pb、As含量與形態(tài)分布Fig.2 Distribution of Cu、Pb、As content and form in soil under different bioremediation schemes

綜合分析圖2可知，經(jīng)過改良劑修復生物后，重金屬污染影響下，土壤內(nèi)重金屬含量呈現(xiàn)一定程度的下降趨勢，3種結(jié)合態(tài)含量總和即重金屬的總量；對于Cu重金屬來說，方案1的重金屬含量明顯高于其余4種方案，其中有機物及硫化物結(jié)合態(tài)含量最高，原因是銅離子存在較高的有機絡合作用，同有機物質(zhì)存在較大的親和力，可穩(wěn)定結(jié)合有機鍵位，其次是鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)，含量最少的是可交換態(tài)及碳酸鹽結(jié)合態(tài)，隨著改良劑含量的增加，各Cu的結(jié)合態(tài)均呈先下降后上升的趨勢。綜合分析，方案3的各Cu的結(jié)合態(tài)含量最低，即生物修復效果最佳。

對于Pb來說，方案1的重金屬含量明顯高于其余4種方案，其中鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)含量最高，Pb在鐵、錳與鋁氧化物中的吸附能力較強，在硅土與泥炭表面也具備較強的吸附能力，Pb的可交換態(tài)及碳酸鹽結(jié)合態(tài)含量下降幅度最為顯著，該結(jié)合態(tài)存在較大的毒性與遷移性，經(jīng)過改良劑修復生物后，土壤內(nèi)Pb的可交換態(tài)及碳酸鹽結(jié)合態(tài)明顯得到改善，有效降低重金屬對植物生長的抑制作用，令土壤更適合植物生長。綜合分析，方案3的各Pb的結(jié)合態(tài)含量最低，即生物修復效果最佳。

對于As來說，當改良劑添加量較少時，土壤內(nèi)總金屬含量略微增加；當改良劑添加量增加至35 g/kg時，土壤內(nèi)總金屬含量降至最低，其中As的可交換態(tài)及碳酸鹽結(jié)合態(tài)含量最高，說明As主要以該結(jié)合態(tài)形式存在，該結(jié)合態(tài)和pH值的關系較強，逐漸添加改良劑，該土壤內(nèi)有機質(zhì)增加，pH值提升，降低該結(jié)合態(tài)含量。綜合分析，方案3的各As結(jié)合態(tài)含量最低，即生物修復效果最佳。

2.3 石油污染影響下土壤內(nèi)降解菌數(shù)目測定結(jié)果

測定石油污染影響下的WHC、BA與BS三種修復方案時，土壤內(nèi)石油烴、烷烴、多環(huán)芳烴的降解菌數(shù)，分析生物修復效果，降解菌數(shù)目測定結(jié)果如圖3所示。

根據(jù)圖3(a)可知，WHC生物修復方案的石油烴降解菌數(shù)目呈先上升后下降趨勢，當修復時間為4周時，降解菌數(shù)目達到極值，BA生物修復方案在修復時間為5周時，降解菌數(shù)目達到極值；BS在修復時間為7周時，降解菌數(shù)目達到極值，BA與BS兩種方案的最終降解菌數(shù)目以及最高降解菌數(shù)目均顯著高于WHC，其中石油烴降解菌數(shù)目最多的是BS方案，最高降解菌數(shù)目在107～108CFU/mL，說明BS方案的生物修復效果最佳，土壤內(nèi)降解菌數(shù)目增加，有利于合成土壤內(nèi)自身生長需要的物質(zhì)，增加新陳代謝需要的石油烴量，降低土壤內(nèi)的石油烴含量，具備較優(yōu)的石油烴降解作用。

圖3 土壤內(nèi)降解菌數(shù)目測定結(jié)果Fig.3 Determination results of the number of degraded bacteria in soil

根據(jù)圖3(b)可知，WHC生物修復方案的烷烴降解菌數(shù)目也呈先上升后下降趨勢，當修復時間為3～5周時，降解菌數(shù)目達到極值；BA生物修復方案在修復時間為4～5周時，降解菌數(shù)目達到極值，BS在修復時間為5周時，降解菌數(shù)目達到極值，BA與BS兩種方案的最終降解菌數(shù)目以及最高降解菌數(shù)目均顯著高于WHC，其中烷烴降解菌數(shù)目最多的是BS方案，最高降解菌數(shù)目超過107～108CFU/mL，說明BS方案時土壤內(nèi)烷烴含量的下降程度最大，生物修復效果最佳，具備較優(yōu)烷烴降解作用，其次是BA方案，最高降解菌數(shù)目在105～106CFU/mL。

根據(jù)圖3(c)可知，WHC生物修復方案在修復時間為3周時，降解菌數(shù)目達到極值；BA生物修復方案在修復時間為4周時，降解菌數(shù)目達到極值，BS在修復時間為4周時，降解菌數(shù)目達到極值，3種方案的降解菌數(shù)目均在5周時不再發(fā)生改變，BA與BS方案的最終降解菌數(shù)目均顯著高于WHC，其中多環(huán)芳烴降解菌數(shù)目最多的是BS方案，最高降解菌數(shù)目接近104CFU/mL。說明BS方案土壤內(nèi)多環(huán)芳烴含量下降最多，生物修復效果最佳，具備較優(yōu)的多環(huán)芳烴降解作用，BA方案的多環(huán)芳烴降解菌數(shù)目改善效果并不顯著，生物修復效果不佳。

綜合分析可知，在石油污染影響下，在石油污染礦區(qū)土壤內(nèi)添加氮磷營養(yǎng)液，即生物刺激修復方案的生物修復效果最佳，顯著減少石油烴、烷烴與多環(huán)芳烴含量。

2.4 石油污染影響下土壤多樣性指數(shù)測定結(jié)果

多樣性指數(shù)代表土壤生物群落的豐富度與均勻度，Ace指數(shù)和生物群落豐富程度呈正比，Shannon指數(shù)與生物群落均勻度呈正比，Simpson指數(shù)與生物群落均勻度呈反比，WHC、BA與BS三種修復方案下，石油污染影響下土壤多樣性指數(shù)測定結(jié)果見表5。

表5 多樣性指數(shù)測定結(jié)果Tab.5 Results of diversity index measurement

根據(jù)表5可知，BA的Ace指數(shù)最低，說明BA方案可有效抑制土壤生物群落的生長，降低土壤生物群落的豐富度；BA方案的Shannon指數(shù)最低，說明BS方案會降低土壤生物群落的均勻度度；BA方案的Simpson指數(shù)最高，說明BA方案會降低土壤生物群落的均勻度度；BS的Ace指數(shù)最高、Shannon指數(shù)最高、Simpson指數(shù)最低，說明BS方案會提升土壤生物群落的豐富度與均勻度。綜合分析可知，BS方案在提升土壤內(nèi)降解數(shù)目的同時，也不會破壞土壤生物群落的豐富度與均勻度。

3 結(jié)論

通過環(huán)刀法與高通量測序分析法等，研究重金屬污染影響下的礦區(qū)土壤生物修復技術(shù)，研究結(jié)果表明，在重金屬污染影響下，添加糞肥與熟石灰配比的改良劑后，可有效降低土壤內(nèi)各重金屬的結(jié)合態(tài)含量，糞肥為15 g/kg、熟石灰為20 g/kg時，各重金屬結(jié)合態(tài)含量下降程度最大，即生物修復效果最優(yōu)；在石油污染影響下，生物刺激修復方案即在土壤內(nèi)添加氮磷營養(yǎng)液，可提升土壤生物群落的豐富度與均勻度，在不影響生物群落多樣性的同時，有效修復土壤生物。