林泉祥，宋遠輝，花 芹，歐陽晨林，孫家猛，張海濤

(安徽農業(yè)大學農學院，合肥 230036)

水稻(Oryza sativaL.)是世界上主要的糧食作物之一，是超50%人口日常飲食中最重要和最廣泛的碳水化合物來源（約占卡路里攝入量的50% ～ 80%）[1]。受全球人口的增長和溫室效應加劇、耕作灌溉方式不完善等問題的制約，土壤鹽漬化作為環(huán)境因子進程呈持續(xù)上升趨勢，通常在作物的生長和生產能力表現(xiàn)出滲透脅迫、離子毒性和營養(yǎng)缺乏等不利影響[2]。尤其過度使用化肥和土壤改良劑、排水不當、海水侵蝕等都加劇了土壤中 NaCl、CaSO4、MgSO4、Mg(HCO3)2和Ca(HCO3)2等的積累。目前，全球超過20%的耕地（約8×106km2）受到土壤鹽漬化的影響，直接威脅糧食安全[3]。鹽脅迫導致Na+與K+競爭，使K+從細胞膜中滲漏，造成離子穩(wěn)態(tài)失衡，從而阻礙光合作用并產生過量的ROS，最終導致生長減緩與細胞死亡[4]。對水稻耐鹽性基因SKC1的研究表明，該基因編碼一個定位在細胞膜上的Na+轉運蛋白，當水稻莖稈中有過多的Na+時，Na+轉運蛋白開始工作，能夠將細胞內多余的Na+運往地下部，減輕毒害[5]。Zhang 等[6]報道的一個擬南芥CPK12基因，與野生型相比，CPK12-RNAi突變體在幼苗期對鹽脅迫更敏感，H2O2含量顯著增加，表明CPK12參與到植物對鹽脅迫調控中。 Kim 等[7]報道了一個鹽脅迫基因OsDHSRP1，在鹽脅迫條件下，使OsGLYI-11.2 和OsACP1 蛋白泛素化，并通過UB/26S 蛋白酶體系降解, 從而導致細胞內甲基乙二醛增加和降低MDA 酶含量，影響種子萌發(fā)。Raina等[8]報道一個能有效增強作物光合效率，清除體內ROS，降低對細胞膜系統(tǒng)的損傷基因StCaM2，該基因有效提高了作物的耐鹽性。水稻的耐鹽性受到數(shù)量性狀位點(quantitative trait locus, QTL）調控，借助相關的QTL 位點進行分子標記的輔助選擇，可以加快耐鹽品種的選育[9]。Noushin[10]通過構建93-11 與Pei-ai64s 的重組自交系，對132 個自交系進行鹽脅迫相關的QTL分析，檢測到一個控制芽生長相關的QTL位點qSL7，該位點內包含一個編碼K+離子轉運的轉錄因子，在水稻鹽脅迫下對莖長調控發(fā)揮重要作用。

水稻作為中度鹽敏感作物，在萌發(fā)期、分蘗期和成熟期具有較強的耐鹽性，而在幼苗期和生殖期高度敏感[11]。土壤鹽漬化對水稻發(fā)芽的影響主要表現(xiàn)對發(fā)芽勢、整齊度及生長造成負面效應。因此，幼苗期耐鹽性是鹽漬土條件下保證水稻穩(wěn)產的重要影響因素，直接影響營養(yǎng)生長和生殖生長階段[12-14]。相比于成熟期，對水稻幼苗期進行耐鹽性考察，成本低，操作簡單易行[15]。Chen 等[16]研究表明，鹽脅迫下的水稻種子活力跟對照出現(xiàn)明顯差異，表現(xiàn)為發(fā)芽率明顯降低，幼苗芽和根的長度都明顯縮短。因此，要削弱土壤鹽漬化對水稻產量的影響，大力“改土消鹽”的同時，篩選耐鹽性強的種質資源、培育出耐鹽和高產的新品種尤為重要。在過去的幾十年里，對水稻耐種質資源的耐鹽性評價多是采用統(tǒng)計學方面、聚類分析[17]、隸屬函數(shù)[18]等簡單分析，對水稻種質資源進行耐鹽性分級往往不具有全面性。作者以來自中國農業(yè)科學研究院種質資源庫60份水稻品種(系)作為試驗對象，采用0.3%、0.5%和0.7% NaCl 鹽濃度模擬大田鹽環(huán)境，通過測定發(fā)芽勢、發(fā)芽率、根長、苗鮮重、苗干重、根鮮重、根干重、MDA 和耐鹽等級指標來評價水稻品種(系)的耐鹽性，建立基于發(fā)芽指數(shù)法、加權隸屬函數(shù)法等多元統(tǒng)計方法的水稻耐鹽鑒定體系，為育種家選育耐鹽水稻品種提供優(yōu)質的種質資源和理論支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究所用的60 個水稻品種（系）均由中國農業(yè)科學研究院種質資源庫保存。

1.2 試驗設計

本試驗于2017—2021 年在安徽農業(yè)大學農學院水稻分子育種實驗室進行。利用9311 和日本晴作為初期篩選種子萌發(fā)期和幼苗期耐鹽性適宜濃度，進行鹽脅迫預備試驗NaCl 溶液濃度為0 ～ 10% (梯度為1%)，測量發(fā)芽勢、發(fā)芽率和干鮮重。當 NaCl濃度為0.3%、0.5%和0.7%時(pH 6.98)，水稻的生長指標差異最為明顯，因此將這3 個處理濃度作為后續(xù)研究。選取60 份水稻品種（系）發(fā)育飽滿、整齊、健康種子置于45 ℃恒溫箱處理48 h 破除休眠，1% 次氯酸鈉溶液消毒20 min，用ddH2O 反復沖洗干凈。設置1 個空白對照與0.3%、0.5%和0.7%（pH 6.98）的3 個NaCl 濃度梯度，每個處理3 次重復（每個重復50 粒）。種子均勻放置在鋪有無菌濾紙的9 cm 規(guī)格的玻璃培養(yǎng)皿，置于智能人工氣候箱(RXZ-50CD 型，浙江寧波江南儀器廠)，在28 ℃條件下暗培養(yǎng)3 d 后，在培養(yǎng)條件為30 ℃/12 h、4 000 lx；25 ℃/12 h、黑暗條件下培養(yǎng)4 d。相同時間段內對種子進行觀察統(tǒng)計，每1 d 更換1 次培養(yǎng)液（參照國際水稻所的標準營養(yǎng)液），保證各處理間的鹽濃度與pH 穩(wěn)定。

1.3 指標測定及計算方法

參照農作物檢驗規(guī)程 GB/T3543.1—3543.7（1995 版），當種子胚根長度達到種子長度，胚芽達到種子長度一半作為發(fā)芽標準。脅迫處理第4 天調查各水稻品種的發(fā)芽勢；第7 天調查各水稻品種的發(fā)芽率；第7天在處理中抽取10粒長勢一致種子，測量各種子的胚芽長、胚根長以及根數(shù)。測定對照與高鹽濃度下的鮮重與干重，超純水沖洗根部，用吸水紙吸去多余水分后測量鮮重；幼苗高溫（105 ℃）20 min 殺青，75 ℃烘至恒重后測量干重；丙二醛（MDA）含量用硫代巴比妥酸法測定。候選種質資源的耐鹽性分析，以發(fā)芽勢、發(fā)芽率、相對芽長、相對根長、根數(shù)、相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率以及相對鹽害率作為水稻耐鹽性的綜合評價指標。各指標計算方式如下：

水稻品種的耐鹽性強弱區(qū)分，采用模糊函數(shù)法獲得60 份水稻種質資源的隸屬度，根據(jù)隸屬度大小把水稻品種分為6 個等級。計算隸屬度的公式如下:

其中，公式內X表示某一生長指標處理測定值的相對值，分別用Xmax、Xmin來表示測定值的最大值與最小值。計算各生長指標的隸屬值時，根據(jù)生長指標與抗性的相關性采取不同的計算公式，呈正相關采用( 1 )式，呈負相關采用( 2 )式。計算所得X(u)即作為該生長指標的抗逆隸屬值，品種所有生長指標的抗逆隸屬值的平均值作為該品種的抗逆隸屬度，并用于水稻種質資源耐鹽性的分級。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計應用Excel 2016 分析軟件，方差分析、相關分析及聚類分析利用SPSS20.0 分析軟件。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對水稻萌發(fā)的影響

為保證耐鹽種質篩選的可靠性，根據(jù)60 份種質資源在0.3%、0.5%和0.7% NaCl 濃度的初篩結果，選取發(fā)芽率分別為88.16%和88.75%的9311 和水原295 作為耐鹽品種；發(fā)芽率分別為15.09%和18.75%的日本晴和大空作為鹽敏感品種。利用不同濃度的NaCl 溶液對兩個耐鹽品種和兩個鹽敏感品種進行處理，結果表明，隨著NaCl 濃度的逐步提高（表1），耐鹽種質的相對發(fā)芽率在0.3%和0.5%水平下脅迫4 d 和7 d 均不具有差異性，在0.7%濃度下具有極顯著差異，相對發(fā)芽率降低20.65%；而鹽敏感種質的相對發(fā)芽率在0.3%、0.5%和0.7%鹽脅迫下均具有顯著性差異，在0.7%濃度下種子萌發(fā)率只為正常的17.94%。相對鹽害率4 d 時，耐鹽和鹽敏感均具有極顯著差異，當鹽濃度大于0.5%時，相對鹽害率均超過了60%，然而耐鹽和鹽敏感種質的相對鹽害率在脅迫處理7 d 后并無顯著差異，因此鹽脅迫對水稻發(fā)芽的影響主要表現(xiàn)在發(fā)芽速度，而并不減弱種子的生活力。 耐鹽種質的相對芽長在0.3%、0.5%和0.7%3 個濃度下具有顯著差異，而鹽敏感種質在0.5%濃度后具有極顯著影響，相對芽長均小于40%。耐鹽種質和鹽敏感種質的根長在鹽脅迫條件下均受到了顯著影響，相對根長均小于60%；耐鹽種質的相對側根數(shù)在鹽脅迫條件下并無顯著影響，然而鹽敏感種質的相對側根數(shù)在鹽濃度大于0.5%時，抑制率達到極顯著，相對側根數(shù)僅為正常的27%。

表1 不同濃度NaCl 脅迫條件下耐鹽和鹽敏感品種在芽期各評價指標表現(xiàn)Table 1 Phenotypic values of salt-tolerant and sensitive rice varieties under different NaCl concentrations at seedling germination stage

2.2 鹽脅迫對水稻苗期生長的影響

在0.7% NaCl 處理的鹽脅迫下，與對照相比，60 份水稻種質的根長、芽長、總鮮重、總干重均有下降（表 2）。脅迫抑制程度從大到小依次為鮮重(49.21%)、干重(40.00%)、芽長(20.76%)和根長(15.21%)。0.7% NaCl 處理的鹽脅迫下鮮重和干重的變異系數(shù)值分別為59.38%和66.67%，顯著大于對照處理下鮮重和干重變異系數(shù)47.62%和40.00%。此外，不同種質間差異顯著，耐鹽品種農墾58 的根長與芽長的變化幅度為-1.75%與4.39%，極顯著小于鹽敏感品種日本晴的26.34%與29.73%，表明耐鹽品種能夠有效抵御鹽脅迫帶來的危害。然而，對照處理的平均干鮮比為16.39%，顯著低于0.7%NaCl 處理的21.02%，表明干物質的積累有助于植物響應鹽脅迫，但具體代謝路徑還需進一步探究。

表2 水稻品種在對照處理與脅迫處理下的生長狀況Table 2 Growth status of rice varieties under control and stress treatments

2.3 鹽脅迫處理下各單項指標與苗期耐鹽級別的相關系數(shù)矩陣

相關性分析結果表明，相對發(fā)芽率、相對芽長、相對根長和相對根數(shù)均與NaCl 濃度呈顯著負相關，相關系數(shù)均在-0.38 以上，其中鹽脅迫后相對根長與NaCl 濃度的相關系數(shù)最大，為-0.691；相對鹽害率與 NaCl 濃度呈極顯著正相關，相對鹽害率（4 d）的相關系數(shù)比相對鹽害率（7 d）的大（表 3），表明了鹽溶液對種子萌發(fā)早期的抑制效應更強。除相對根數(shù)外，相對鹽害率與相對根長、相對芽長、相對根數(shù)、相對發(fā)芽率均呈負相關，但相對根數(shù)與相對鹽害率未達到顯著水平；其中相對鹽害率（4 d）與相對發(fā)芽率（4 d）達到極顯著水平，其相關系數(shù)最大，為-1.000。在發(fā)芽試驗中，除發(fā)芽率外，芽長與根長是種子活力的最直觀表現(xiàn)。相對芽長與相對根長在各項生理指標的相關性除相對根數(shù)上出現(xiàn)差異，其余均有顯著關系。相對芽長與其他指標間除相對根數(shù)外均達到極顯著水平，且與相對發(fā)芽率（7 d）相關系數(shù)最高，達到0.684。此外，鹽濃度與相對芽長和相對根長的相關系數(shù)分別為-0.477與-0.691，鹽濃度與相對根長的相關系數(shù)最大，表明在不同鹽濃度下種質的根較芽生長，鹽脅迫抑制效果更明顯。

表3 鹽脅迫下水稻幼苗期各生長指標的相關系數(shù)分析Table 3 Pearson correlation coefficients among evaluated traits in rice under salt treatment

2.4 鹽堿脅迫下不同水稻品種萌發(fā)期的耐鹽級別分類

根據(jù)鹽脅迫下水稻苗期耐鹽性狀相關分析結果可以看出，很多性狀間存在著不同程度的相關性，即各耐鹽性狀系數(shù)信息有著不同程度的重疊，而無法根據(jù)一兩個指標確定該性狀。因此，需要對該性狀進行綜合分析。綜合各種質萌發(fā)期的各項指標，運用隸屬函數(shù)法計算隸屬度后進行聚類分析，所得隸屬值大小客觀反應各品種（系）芽期耐鹽能力的大小，數(shù)值越大說明耐鹽能力越強。本研究根據(jù)各生長指標的平均抗逆隸屬值做為品種間的隸屬度用于60 份種質耐鹽性的分級標準。借助隸屬度大小將水稻種質分為6 個等級，分別是隸屬度在0.85 以上的高抗（HT）、隸屬度在0.7 以上的中抗（MT）、隸屬度在0.55 以上的低抗（T）、隸屬度在0.4 以上的敏感（S）、隸屬度在0.3 以上的中度敏感（MS）與隸屬度在0.3 以下的高度敏感（HS）。60 份種質分級見表4，其中表現(xiàn)耐鹽的品種主要有IR50、Bate Aus、Bhat Mukhu、水原295、9311 和L201，其隸屬值均在0.85 以上；敏感的品種有IRAT109 和TAE GU NA ，其隸屬值均在0.3 以下。

表4 鹽堿脅迫下水稻耐鹽性和耐級別分類Table 4 Varieties classified with respect to membership degree (MD) under NaCl treatments

當作物處于高鹽濃度環(huán)境下，體內積累的超氧自由基會導致細胞過氧化造成作物生物膜破損。為反映作物體內的細胞過氧化程度，通常借用細胞過氧化產物丙二醛（MDA）的含量表示[21]。在6 個等級的水稻種質隨機抽取一個品種進行MDA 測定（表5），發(fā)現(xiàn)隨著耐鹽能力的下降，鹽敏感品種的MDA 含量顯著高于耐鹽品種含量（相對含量升高97.46%）。結果表明，在鹽脅迫下，耐鹽品種對于自身生物膜的保護能力即清除超氧自由基能力強于鹽敏感品種，保證自身正常生長。

表5 不同等級水稻品種在NaCl 處理下MDA 含量Table 5 MDA contents in rice varieties treated with different NaCl grades

3 討論

3.1 鹽脅迫對不同耐鹽性水稻種質萌發(fā)的影響

種子的萌發(fā)和早期幼苗的生長是植物生長關鍵階段，是決定種子在鹽堿地上出苗量和出苗整齊度的關鍵[22]。本研究在對60 份水稻種質的發(fā)芽試驗中發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫處理下的各種質種子萌動時間與對照處理相比延遲了12～48 h；空白對照下的各種質發(fā)芽時間為72～96 h，鹽脅迫處理下的發(fā)芽時間出現(xiàn)了36 h 的延遲。萌動與發(fā)芽時間的延遲伴隨著鹽處理濃度的上升而延遲，在鹽敏感種質中的表現(xiàn)最為明顯。如TAE GU NA 在鹽脅迫7 d 時相對發(fā)芽率僅為52.83%，表明種子早期萌發(fā)在鹽脅迫處理下受到嚴重抑制。水稻的萌發(fā)需要保證光照、溫度、水分以及土壤離子濃度均在水稻生長適宜的范圍內。土壤中的鹽含量是水稻生長受限制的因素之一，高濃度鹽含量抑制水稻正常生長，嚴重時導致水稻的死亡。鹽脅迫處理造成水稻的發(fā)芽率、根長、芽長、鮮重、干重等低于對照處理[23]。水稻吸收水分和營養(yǎng)元素的主要途徑是根，根系的發(fā)育決定水稻的生長。鹽脅迫處理時，水稻的根系生長首先受到抑制，隨后影響水稻的地上部生長。水稻種質在萌發(fā)過程中根系受鹽毒害的變化最大（表3），相對根長與相對鹽害率（4 d）的相關系數(shù)為-0.549，表明鹽脅迫下水稻種質的根發(fā)育受到脅迫影響，主要表現(xiàn)在對主根的伸長和側根形成的抑制效果[24]。典型耐鹽種質的相對根長和相對側根數(shù)極顯著大于鹽敏感種質（圖1），特別是大空稻在0.7%濃度下，根的伸長幾乎完全被抑制，說明鹽脅迫通過抑制根的伸長及發(fā)生來影響水稻幼苗對水分的吸收；而脅迫7 d 不同種質的相對芽長在不同濃度下雖影響顯著，但在同鹽濃度下無顯著影響，表明水稻種子萌發(fā)時根的伸長對鹽脅迫最為敏感，芽次之，這與前人的研究結果一致[25]。

圖1 NaCl 脅迫條件下7 d 典型和鹽敏感水稻種質資源的表現(xiàn)型比較Figure 1 Comparison of the phenotypes of salt-tolerant and salt-sensitive rice germplasm accessions under different treatments for seven days in germination and seedling stages

3.2 耐鹽性鑒定的統(tǒng)計分析

對大麥、小麥、水稻、玉米等種質資源進行耐鹽性篩選時，國內外學者常常借用發(fā)芽勢、發(fā)芽率、芽長和根長等常見的生長指標作為評價種質資源的耐鹽性標準[26]，但國內外對耐鹽性評價的標準生理指標未進行統(tǒng)一，造成種質資源的耐鹽性分級不一致。種質資源的耐鹽性是作物的一個復雜性狀，受到來自外界環(huán)境與自身基因型的影響，在此基礎上借助簡單的指標對種質資源的耐鹽性分級，難以正確表現(xiàn)種質資源本身的耐鹽能力[27]。為客觀反映各種質資源的耐鹽性能力強弱，本研究對常見的耐鹽性評價指標進行相關性分析和多元統(tǒng)計分析，同時結合隸屬函數(shù)等方法，獲得綜合評價值隸屬度，借助隸屬度大小將60 份水稻種質資源根據(jù)耐鹽性強弱劃分成6 個等級，包括高抗品種、中抗品種、低抗品種、敏感品種、中度敏感品種和高度敏感品種。利用該評價體系，在相同的脅迫條件下，預測目標種質耐鹽性的強弱，為水稻耐鹽育種及資源篩選提供參考。

4 結論

環(huán)境變化在水稻的日常生長過程中起著十分關鍵的作用，水稻產量的最終制約因素就是土壤中的鹽分含量。在人工氣候箱內，我們通過3 個梯度的NaCl 溶液對供試的種質資源進行耐鹽性鑒定，并利用綜合評價隸屬度對供試材料進行分級。本研究共獲得6 份高度耐鹽的水稻品種、16 份中度耐鹽的水稻品種、19 份低度耐鹽水稻品種、13 份鹽敏感水稻品種、4 份中度鹽敏感水稻品種和2 份高度鹽敏感水稻品種。研究結果可為日后的水稻耐鹽種質資源的篩選和鑒定、為后續(xù)鹽脅迫相關基因定位和品種選育研究奠定基礎，以及對日益嚴重的土壤鹽堿問題提供新的解決思路和和基礎材料。

致謝：感謝中國農業(yè)科學院作物科學研究所國家水稻種質資源中期庫為本研究提供水稻種質資源，感謝《安徽農業(yè)大學學報》編輯部老師在論文修改中給予的幫助。