嚴(yán)耀超, 王亞楠, 何 波, 曲仁渝, 南甲戌, 林紅艷, 楊光富

(華中師范大學(xué) 化學(xué)學(xué)院 農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430079)

對羥基苯丙酮酸雙加氧酶 (4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, HPPD) 是一種普遍存在于微生物、植物和哺乳動物等需氧生物體中的依賴Fe(II)的非血紅素加氧酶，屬于α-酮酸依賴型加氧酶(αKAO) 家族中的重要一員，其在酪氨酸分解代謝途徑中起著重要的調(diào)控作用[1-2]。HPPD 參與催化酪氨酸分解代謝的第2 步，可將酪氨酸分解產(chǎn)生的對羥基苯丙酮酸 (4-hydroxyphenylpyruvic acid，HPPA) 轉(zhuǎn)化為尿黑酸 (homogentisic acid，HGA)，雖然在不同生物體內(nèi)尿黑酸的進(jìn)一步代謝產(chǎn)物迥然不同，但其代謝過程對維持生物體正常運(yùn)轉(zhuǎn)具有至關(guān)重要的作用[3]。在植物體內(nèi)，經(jīng)HPPD 催化過程得到的尿黑酸是合成植物光合作用所需的質(zhì)體醌 (plastoquinone) 和生育酚 (tocopherol) 的關(guān)鍵前體。當(dāng)植物體內(nèi)HPPD 被抑制時(shí)，HPPA 轉(zhuǎn)化為尿黑酸的過程就會受阻，致使質(zhì)體醌和生育酚無法正常合成，進(jìn)一步導(dǎo)致植物的光合作用受到影響，最終植物出現(xiàn)白化癥狀直至死亡[4-6]。因此，HPPD 可以作為一種具有發(fā)展?jié)摿Φ某輨┌袠?biāo)，而HPPD 抑制類除草劑近年來已成為除草劑領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

目前商品化HPPD 抑制劑多達(dá)20 多種，結(jié)構(gòu)類型主要可以劃分為三酮類、吡唑類和異噁唑類[7]。其中，以吡唑?yàn)樗幮F(tuán)的商品化HPPD 抑制劑近年來發(fā)展迅猛[8]。目前，已經(jīng)開發(fā)上市的吡唑類HPPD 除草劑的結(jié)構(gòu)如圖式1 所示。其中，我國農(nóng)藥企業(yè)在該類HPPD 抑制劑的創(chuàng)制工作中取得了優(yōu)異成果：環(huán)吡氟草酮可用于小麥田雜草的防治，特別是對抗性及多抗性看麥娘、日本看麥娘具有優(yōu)異的防效。雙唑草酮則可用于防除小麥田播娘蒿、豬殃殃等多種抗性闊葉雜草[9]。苯唑氟草酮可用于玉米田中馬唐、稗草、反枝莧和馬齒莧等雜草的防治，對玉米安全，并具有良好的后茬作物安全性。三唑磺草酮是全球首個(gè)水稻田苗后莖葉處理防治禾本科雜草的HPPD 除草劑，對水稻田中難以防治的稗草、千金子等雜草具有優(yōu)異防效，且對水稻高度安全[10]。

圖式1 已上市的吡唑類HPPD 抑制劑Scheme 1 Commercialized pyrazole-derived HPPD inhibitors

本課題組長期從事于新型HPPD 抑制劑的創(chuàng)制工作，前期通過基于藥效團(tuán)連接碎片的虛擬篩選方法[11]，成功篩選出了一類以喹唑啉二酮為骨架的新型HPPD 抑制劑[12]。通過不斷的結(jié)構(gòu)修飾，得到了全球第一個(gè)高粱專用超高效HPPD 除草劑喹草酮，該除草劑解決了高粱田中野糜子等“超級雜草”無藥可治的技術(shù)難題，并已于2020 年獲得正式登記[13-14]。為了進(jìn)一步挖掘喹唑啉二酮骨架的優(yōu)勢，得到可應(yīng)用于更多作物田的HPPD 抑制劑類除草劑，本課題組前期采用藥效團(tuán)替換的方法，將三酮片段替換成了吡唑結(jié)構(gòu)，得到了吡唑-喹唑啉二酮類HPPD 抑制劑 (圖式2，系列A)。結(jié)果表明，部分系列A 化合物在有效成分150 g/hm2下對所測試的禾本科和闊葉雜草展現(xiàn)出一定的抑制活性，但與喹草酮相比仍有一定差距[15]?；诖?，系列A 仍然有結(jié)構(gòu)改造空間。

本課題組前期在對喹草酮進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化的過程中，發(fā)現(xiàn)了一類以甲基喹草酮為代表的新型5-甲基喹唑啉二酮類化合物，該類化合物展現(xiàn)出了優(yōu)異的除草活性[13,16]?；谶@個(gè)改造思路，在系列A 結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，將甲基引入到了喹唑啉二酮的5 號位，設(shè)計(jì)了如圖式2 所示的新型吡唑-喹唑啉二酮類HPPD 抑制劑 (系列B) (設(shè)計(jì)策略見圖式2，合成路線見圖式3)。所有化合物均經(jīng)過核磁共振氫譜(1H NMR)、碳譜(13C NMR) 和高分辨質(zhì)譜(HRMS)的確證。同時(shí)，根據(jù)酶水平活性測試結(jié)果，對系列B 進(jìn)行了詳細(xì)的構(gòu)效關(guān)系分析。對所有化合物均進(jìn)行了溫室除草活性測試。最后，培養(yǎng)了代表性化合物9-28 與擬南芥HPPD (AtHPPD)的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，這為了解該系列化合物與靶標(biāo)的結(jié)合模式起到了至關(guān)重要的作用。

圖式2 目標(biāo)化合物的設(shè)計(jì)思路Scheme 2 Design strategy of the target compounds

圖式3 目標(biāo)化合物的合成路線Scheme 3 Synthetic route of the target compounds

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑及材料

Sartoruis BSA223S-CW 電子天平 (德國賽多利斯公司)；Heidolph MR Hei-Tec 磁力攪拌器 (德國海道夫公司)；Büchi R-200 和R-300 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士布奇公司)；Bruker NMR 400 MHz (德國布魯克公司) 或Varian VNMR 600 MHz 核磁共振儀 (美國瓦里安公司) (均使用氘代氯仿 (CDCl3) 為溶劑，以四甲基硅烷 (TMS) 為內(nèi)標(biāo))；Agilent Technologies Santa Clara CA 6224 TOF LC/MS 高分辨質(zhì)譜儀 (美國安捷倫科技公司)；Büchi M-545 數(shù)字熔點(diǎn)儀 (瑞士布奇公司)；DLSB-5/20 低溫冷卻循環(huán)泵 (武漢德力祥儀器設(shè)備有限公司)；SHB-(III)循環(huán)水式真空泵 (武漢德力祥儀器設(shè)備有限公司)；ZF-20D 暗箱式紫外分析儀 (武漢德力祥儀器設(shè)備有限公司)。

柱層析所用硅膠 (200～300 目，篩孔徑：0.048～0.075 mm)，由青島海洋化工廠提供；薄層硅膠板，煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司；所用石油醚的沸程為60～90 ℃，反應(yīng)所使用的試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純，其他溶劑或試劑若無特殊說明均為分析純或化學(xué)純。98.6%喹草酮(benquitrione)粉劑(本實(shí)驗(yàn)室合成[13])。

供試雜草為禾本科雜草：稗草Echinochloa crus-galli、狗尾草Setaria viridis、馬唐Digitaria sanguinalis及闊葉雜草：莧菜Amaranthus retroflexus、藜Chenopodium serotinum、苘麻Abutilon theophrasti(山東先達(dá)農(nóng)化股份有限公司提供)。

1.2 目標(biāo)化合物的合成

1.2.1 化合物1～7 的合成 根據(jù)文獻(xiàn)中報(bào)道的方法[16]合成。

1.2.2 目標(biāo)化合物9-1～9-30 的合成[17]將中間體7 (3 mmol) 加入到100 mL 史萊克管中，分別加入1,3-二甲基-5-吡唑酮 (8，6 mmol)、4,5-雙(二苯基膦)-9,9-二甲基氧雜蒽 (xantphos) (0.15 mmol)、氯化鈀 (PdCl2) (0.15 mmol) 和碳酸鉀 (6 mmol)。密封后抽真空、充氮?dú)猓貜?fù)操作3 次，最后一次呈真空狀態(tài)，充入一氧化碳?xì)怏w并密封體系。攪拌下加入20 mL 超干乙腈，最后加入三乙胺 (6 mmol)，將反應(yīng)體系升溫至80 ℃反應(yīng)22～24 h，薄層色譜(TLC，V(石油醚) :V(丙酮) = 3 : 1) 監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。待原料反應(yīng)完畢后停止升溫，加入15 mL 1 mol/L 的鹽酸酸化，用二氯甲烷 (3 × 20 mL) 萃取。合并有機(jī)相，干燥，墊硅藻土抽濾，減壓蒸干溶劑得到黃色油狀物，用甲醇重結(jié)晶得到白色固體，即為目標(biāo)化合物，收率為65%左右。

1.3 酶水平活性測試

采用已經(jīng)報(bào)道的偶聯(lián)法[18]測定目標(biāo)化合物9-1～9-30 對AtHPPD 的抑制活性，其主要原理為：在酪氨酸代謝過程中，HPPD 可以將HPPA催化轉(zhuǎn)化為HGA，但由于HPPA 和HGA 的紫外吸收峰分別是275 nm 和288 nm，兩者比較接近，難以運(yùn)用紫外分光光度計(jì)區(qū)分，而HGA 在尿黑酸雙加氧酶 (HGD) 催化下可轉(zhuǎn)化為馬來酰乙酰乙酸 (MAA)，其紫外吸收峰在318 nm 處，因此可以通過引入HGD，將HGA 轉(zhuǎn)化為MAA 后運(yùn)用紫外分光光度計(jì)監(jiān)測MAA 的含量，從而間接測定HPPD 的催化反應(yīng)速率和定量評價(jià)HPPD 的活性水平，實(shí)現(xiàn)化合物酶水平抑制活性的測定。關(guān)于AtHPPD 的預(yù)處理和測試過程根據(jù)文獻(xiàn)方法[19-20]進(jìn)行。

1.4 溫室除草活性測試

由山東先達(dá)農(nóng)化股份有限公司完成。采用盆栽法[21]測試，化合物的普篩試驗(yàn)劑量為有效成分150 g/hm2。以98.6%喹草酮粉劑作為對照藥劑。準(zhǔn)確稱取一定量的待測化合物 (精確至0.000 1 g)，用含體積分?jǐn)?shù)1% 吐溫-80 的N,N-二甲基甲酰胺(DMF) 溶解，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%～1%的母液，然后用蒸餾水稀釋備用。播種雜草，待長至4～5 葉期備用。采用自動噴霧塔噴施新化合物和對照藥劑喹草酮，待作物葉面藥液晾干后移入溫室培養(yǎng)，30 d 后調(diào)查結(jié)果[22-23]。生長抑制情況設(shè)為0～100%：A 代表抑制率為100%，B 代表抑制率≥80%，C 代表抑制率≥60%，D 代表抑制率≥40%，E 代表抑制率≥20%，F(xiàn) 代表抑制率＜20%。

1.5 晶體學(xué)研究

首先在上海同步輻射光源收集了復(fù)合物AtHPPD-9-28 的晶體結(jié)構(gòu)衍射圖片，隨后利用HKL2000[24]對衍射圖片進(jìn)行縮減、合并和縮放處理。此外，通過將AtHPPD-喹草酮 (PDB 代碼：5YY6) 的晶體結(jié)構(gòu)定義為標(biāo)準(zhǔn)模型，使用CCP4[25]進(jìn)行分子置換。然后，使用PHENIX[26]和Coot[27]調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)模型。最后，利用Pymol 1.3 (DeLano Scientific, Palo Alto, CA)使晶體結(jié)構(gòu)可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 化學(xué)合成部分

以2-甲基-6-硝基苯甲酸甲酯為起始原料，經(jīng)過還原、碘化反應(yīng)得到中間體3，隨后利用三光氣生成了異氰酸酯4。通過與不同的胺進(jìn)行反應(yīng)，得到了脲類化合物5-1～5-30。在甲醇鈉作堿的條件下，化合物5 發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化，接著甲基化得到了關(guān)鍵碘代物7-1～7-30。最后，以CO 為羰基源，xantphos 為配體，PdCl2為催化劑，通過插羰反應(yīng)得到了目標(biāo)化合物9-1～9-30，其結(jié)構(gòu)表征如下。

6-[(5-羥基-1,3-二甲基吡唑-4-基)羰基]-1,3,5-三甲基-1,2,3,4-四氫喹唑啉-2,4-二酮9-1：白色固體，產(chǎn)率61%，m.p. 214.2～216.1 ℃;1H NMR (400 MHz, CDCl3),δ: 7.47 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 7.18 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 3.65 (s, 3H), 3.64 (s,3H), 3.47 (s, 3H), 2.78 (s, 3H), 1.71 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, CDCl3),δ: 193.4, 162.1, 159.5, 150.9, 147.3, 142.6,140.1, 135.6, 131.6, 114.1, 111.7, 103.6, 32.5, 31.4, 28.5, 19.3,14.0. HRMS (ESI): C17H18N4O4[M + Na]+, 計(jì)算值365.122 0,測量值365.123 2.

6-[(5-羥基-1,3-二甲基吡唑-4-基)羰基]-1,5-二甲基-3-乙基-1,2,3,4-四氫喹唑啉-2,4-二酮9-2：白色固體，產(chǎn)率62%，m.p. 191.3～192.8 ℃;1H NMR (400 MHz, CDCl3),δ:7.45 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 7.16 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 4.12 (q,J=6.8 Hz, 2H), 3.63 (s, 3H), 3.62 (s, 3H), 2.77 (s, 3H), 1.70 (s,3H), 1.28 (t,J= 6.8 Hz, 3H).13C NMR (100 MHz, CDCl3),δ:193.4, 161.6, 159.6, 150.5, 147.3, 142.7, 140.1, 135.6, 131.6,114.3, 111.6, 103.6, 37.2, 32.5, 31.3, 19.3, 14.1, 12.9. HRMS(ESI): C18H20N4O4[M + Na]+, 計(jì)算值379.137 7, 測量值379.137 0.

6-[(5-羥基-1,3-二甲基吡唑-4-基)羰基]-1,5-二甲基-3-丙基-1,2,3,4-四氫喹唑啉-2,4-二酮9-3：白色固體，產(chǎn)率65%，m.p. 162.2～163.9 ℃;1H NMR (400 MHz, CDCl3),δ:7.46 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 7.16 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 4.06～3.99(m, 2H), 3.64 (s, 3H), 3.62 (s, 3H), 2.77 (s, 3H), 1.80～1.64 (m,5H), 0.99 (t,J= 7.2 Hz, 3H).13C NMR (100 MHz, CDCl3),δ:193.4, 161.8, 159.6, 150.7, 147.3, 142.7, 140.2, 135.6, 131.6,114.3, 111.6, 103.7, 43.6, 32.5, 31.4, 21.0, 19.4, 14.1, 11.3.HRMS (ESI): C19H22N4O4[M + H]+, 計(jì)算值371.171 4, 測量值371.172 8.

6-[(5-羥基-1,3-二甲基吡唑-4-基)羰基]-1,5-二甲基-3-丁基-1,2,3,4-四氫喹唑啉-2,4-二酮9-4：白色固體，產(chǎn)率66%，m.p. 174.9～175.8 ℃;1H NMR (400 MHz, CDCl3),δ:7.45 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 7.16 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 4.05 (t,J=7.2 Hz, 2H), 3.64 (s, 3H), 3.62 (s, 3H), 2.77 (s, 3H), 1.71 (s,3H), 1.69～1.62 (m, 2H), 1.46～1.36 (m, 2H), 0.96 (t,J= 7.2 Hz, 3H).13C NMR (100 MHz, CDCl3),δ: 193.5, 161.8, 159.6,150.6, 147.3, 142.7, 140.1, 135.6, 131.6, 114.3, 111.6, 103.7,42.0, 32.6, 31.4, 29.8, 20.3, 19.4, 14.1, 13.8. HRMS (ESI):C20H24N4O4[M + Na]+, 計(jì)算值407.169 0, 測量值407.1687.

6-[(5-羥基-1,3-二甲基吡唑-4-基)羰基]-1,5-二甲基-3-(丙-2-基)-1,2,3,4-四氫喹唑啉-2,4-二酮9-5：白色固體，產(chǎn)率63%，m.p. 153.1～154.5 ℃;1H NMR (400 MHz, CDCl3),δ: 7.43 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 7.13 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 5.37～5.23(m, 1H), 3.64 (s, 3H), 3.58 (s, 3H), 2.75 (s, 3H), 1.71 (s, 3H),1.52 (d,J= 6.8 Hz, 6H).13C NMR (100 MHz, CDCl3),δ:193.5, 162.3, 159.7, 150.5, 147.3, 142.8, 140.1, 135.5, 131.4,114.8, 111.5, 103.7, 46.6, 32.5, 31.2, 19.5, 19.4, 14.1. HRMS(ESI): C19H22N4O4[M + Na]+, 計(jì)算值393.153 3, 測量值393.154 0.

6-[(5-羥基-1,3-二甲基吡唑-4-基)羰基]-1,5-二甲基-3-(丁-2-基)-1,2,3,4-四氫喹唑啉-2,4-二酮9-6：白色固體，產(chǎn)率65%，m.p. 142.3～143.9 ℃;1H NMR (400 MHz, CDCl3),δ: 7.44 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 7.13 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 5.11～5.00(m, 1H), 3.64 (s, 3H), 3.59 (s, 3H), 2.75 (s, 3H), 2.14～1.86 (m,2H), 1.72 (s, 3H), 1.50 (d,J= 6.8 Hz, 3H), 0.88 (t,J= 7.6 Hz,3H).13C NMR (100 MHz, CDCl3),δ: 193.4, 162.4, 159.6,150.6, 147.3, 142.8, 140.0, 135.4, 131.4, 114.6, 111.4, 103.6,52.5, 32.5, 31.2, 26.2, 19.4, 17.6, 14.1, 11.4. HRMS (ESI):C20H24N4O4[M + Na]+, 計(jì)算值407.169 0, 測量值407.168 5.

6-[(5-羥基-1,3-二甲基吡唑-4-基)羰基]-1,5-二甲基-3-(2-氟乙基)-1,2,3,4-四氫喹唑啉-2,4-二酮9-7：白色固體，產(chǎn)率68%，m.p. 119.2～120.7 ℃;1H NMR (400 MHz,CDCl3),δ: 7.48 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 7.18 (d,J= 8.4 Hz, 1H),4.72 (dt,J= 47.2, 5.2 Hz, 2H), 4.46 (dt,J= 23.6, 5.2 Hz, 2H),3.64 (s, 3H), 3.63 (s, 3H), 2.77 (s, 3H), 1.71 (s, 3H).13C NMR(100 MHz, CDCl3),δ: 193.3, 161.8, 159.5, 150.7, 147.3, 142.7,140.3, 135.8, 131.9, 114.1, 111.8, 103.6, 80.8 (d,JC-F= 170 Hz), 41.7 (d,JC-F= 22 Hz), 32.6, 31.5, 19.4, 14.1. HRMS(ESI): C18H19FN4O4[M + Na]+, 計(jì)算值397.128 3, 測量值397.128 4.

6-[(5-羥基-1,3-二甲基吡唑-4-基)羰基]-1,5-二甲基-3-(2,2-二氟乙基)-1,2,3,4-四氫喹唑啉-2,4-二酮9-8：白色固體，產(chǎn)率69%，m.p. 208.9～10.2 ℃;1H NMR (400 MHz,CDCl3),δ: 7.50 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 7.20 (d,J= 8.8 Hz, 1H),6.13 (td,J= 56.8, 28.4 Hz, 1H), 4.49 (td,J= 13.2, 4.8 Hz,2H), 3.61 (s, 3H), 3.60 (s, 3H), 2.76 (s, 3H), 1.70 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, CDCl3),δ: 193.1, 161.6, 159.5, 150.5, 147.2,142.7, 140.5, 136.0, 132.2, 113.2 (t,JC-F= 102 Hz), 111.9,110.4, 103.6, 43.1 (t,JC-F= 30 Hz), 32.6, 31.6, 19.4, 14.1.HRMS (ESI): C18H18F2N4O4[M + Na]+, 計(jì)算值415.118 8, 測量值415.118 4.

6-[(5-羥基-1,3-二甲基吡唑-4-基)羰基]-1,5-二甲基-3-(2,2,2-三氟乙基)-1,2,3,4-四氫喹唑啉-2,4-二酮9-9：白色固體，產(chǎn)率69%，m.p. 187.0～188.4 ℃;1H NMR (400 MHz,CDCl3),δ: 7.51 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 7.21 (d,J= 8.8 Hz, 1H),4.87～4.75 (m, 2H), 3.65 (s, 3H), 3.64 (s, 3H), 2.76 (s, 3H),1.71 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, CDCl3),δ: 192.9, 161.0,159.6, 150.2, 147.2, 142.6, 140.8, 136.2, 132.4, 123.8 (q,JC-F=280 Hz), 113.8, 111.9, 103.6, 41.6 (q,JC-F= 36 Hz), 32.5,31.8, 19.3, 14.1. HRMS (ESI): C18H17F3N4O4[M + Na]+, 計(jì)算值433.109 4, 測量值433.109 8.

6-[(5-羥基-1,3-二甲基吡唑-4-基)羰基]-1,5-二甲基-3-(3-氟丙基)-1,2,3,4-四氫喹唑啉-2,4-二酮9-10：白色固體，產(chǎn)率70%，m.p. 139.2～140.9 ℃;1H NMR (400 MHz,CDCl3),δ: 7.47 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 7.17 (d,J= 8.4 Hz, 1H),4.56 (dt,J= 47.2, 6.0 Hz, 2H), 4.23 (t,J= 7.2 Hz, 2H), 3.63 (s,3H), 3.63 (s, 3H), 2.77 (s, 3H), 2.20～2.05 (m, 2H), 1.70 (s,3H).13C NMR (100 MHz, CDCl3),δ: 193.2, 161.7, 159.6,150.6, 147.2, 142.7, 140.2, 135.7, 131.7, 114.2, 111.7, 103.6,82.1 (d,JC-F= 166 Hz), 38.8 (d,JC-F= 6 Hz), 32.5, 31.4, 28.9(d,JC-F= 20 Hz), 19.3, 14.1. HRMS (ESI): C19H21FN4O4[M +Na]+, 計(jì)算值411.143 9, 測量值411.143 4.

6-[(5-羥基-1,3-二甲基吡唑-4-基)羰基]-1,5-二甲基-3-(3,3,3-三氟丙基)-1,2,3,4-四氫喹唑啉-2,4-二酮9-11：白色固體，產(chǎn)率63%，m.p. 181.4～183.2 ℃;1H NMR (400 MHz,CDCl3),δ: 7.47 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 7.18 (d,J= 8.8 Hz, 1H),4.39～4.28 (m, 2H), 3.62 (s, 6H), 2.75 (s, 3H), 2.60～2.46 (m,2H), 1.69 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, CDCl3),δ: 193.1,161.5, 159.6, 150.3, 147.2, 142.6, 140.3, 135.9, 132.0, 125.9(q,JC-F= 276 Hz), 114.0, 111.8, 103.6, 35.3 (q,JC-F= 4 Hz),32.5, 32.3 (q,JC-F= 36 Hz), 31.4, 19.3, 14.0. HRMS (ESI):C19H19F3N4O4[M + Na]+, 計(jì)算值447.125 1, 測量值447.124 5.

6-[(5-羥基-1,3-二甲基吡唑-4-基)羰基]-3-(2-甲氧基乙基)-1,5-二甲基-1,2,3,4-四氫喹唑啉-2,4-二酮9-12：白色固體，產(chǎn)率63%，m.p. 141.8～143.4 ℃;1H NMR (400 MHz,CDCl3),δ: 7.45 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 7.16 (d,J= 8.8 Hz, 1H),4.31 (t,J= 5.2 Hz, 2H), 3.68 (t,J= 5.2 Hz, 2H), 3.63 (s, 3H),3.62 (s, 3H), 3.37 (s, 3H), 2.76 (s, 3H), 1.70 (s, 3H).13C NMR(100 MHz, CDCl3),δ: 193.4, 161.9, 159.7, 150.8, 147.3, 142.8,140.3, 135.7, 131.7, 114.3, 111.7, 103.67, 69.4, 58.7, 40.8,32.5, 31.5, 19.4, 14.1. HRMS (ESI): C19H22N4O5[M + Na]+,計(jì)算值409.148 2, 測量值409.148 0.

6-[(5-羥基-1,3-二甲基吡唑-4-基)羰基]-1,5-二甲基-3-(丙-2-烯基)-1,2,3,4-四氫喹唑啉-2,4-二酮9-13：白色固體，產(chǎn)率62%，m.p. 156.8～158.3 ℃;1H NMR (400 MHz,CDCl3),δ: 7.46 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 7.17 (d,J= 8.4 Hz, 1H),6.01～5.89 (m, 1H), 5.26 (dd,J= 38.4, 13.6 Hz, 2H), 4.68 (d,J=5.6 Hz, 2H), 3.63 (s, 3H), 3.62 (s, 3H), 2.77 (s, 3H), 1.70 (s,3H).13C NMR (100 MHz, CDCl3),δ: 193.3, 161.5, 159.6,150.5, 147.3, 142.7, 140.3, 135.7, 131.9, 131.7, 117.9, 114.3,111.7, 103.7, 44.0, 32.5, 31.4, 19.3, 14.1. HRMS (ESI):C19H20N4O4[M + Na]+, 計(jì)算值391.137 7, 測量值391.1383.

6-[(5-羥基-1,3-二甲基吡唑-4-基)羰基]-1,5-二甲基-3-(丙-2-炔基)-1,2,3,4-四氫喹唑啉-2,4-二酮9-14：白色固體，產(chǎn)率62%，m.p. 205.1～206.9 ℃;1H NMR (400 MHz,CDCl3),δ: 7.48 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 7.19 (d,J= 8.4 Hz, 1H),4.84 (d,J= 2.0 Hz, 2H), 3.65 (s, 3H), 3.63 (s, 3H), 2.78 (s,3H), 2.21 (t,J= 2.0 Hz, 1H), 1.70 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, CDCl3),δ: 193.2, 161.0, 159.5, 150.0, 147.3, 142.6,140.5, 135.9, 132.0, 114.1, 111.8, 103.6, 78.3, 70.6, 32.5, 31.5,31.1, 19.3, 14.1. HRMS (ESI): C19H18N4O4[M + Na]+, 計(jì)算值389.122 0, 測量值389.122 2.

6-[(5-羥基-1,3-二甲基吡唑-4-基)羰基]-1,5-二甲基-3-(3-甲基丁-2-烯基)-1,2,3,4-四氫喹唑啉-2,4-二酮9-15：白色固體，產(chǎn)率70%，m.p. 172.1～173.8 ℃;1H NMR (400 MHz,CDCl3),δ: 7.45 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 7.15 (d,J= 8.8 Hz, 1H),5.36～5.24 (m, 1H), 4.66 (d,J= 6.8 Hz, 2H), 3.63 (s, 3H), 3.61(s, 3H), 2.78 (s, 3H), 1.85 (s, 3H), 1.72 (s, 3H), 1.70 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, CDCl3),δ: 193.4, 161.6, 159.6, 150.6,147.3, 142.7, 140.2, 136.8, 135.5, 131.5, 118.7, 114.4, 111.6,103.7, 40.2, 32.5, 31.4, 25.7, 19.4, 18.1, 14.1. HRMS (ESI):C21H24N4O4[M + Na]+, 計(jì)算值419.169 0, 測量值419.169 8.

6-[(5-羥基-1,3-二甲基吡唑-4-基)羰基]-1,5-二甲基-3-環(huán)丙基-1,2,3,4-四氫喹唑啉-2,4-二酮9-16：白色固體，產(chǎn)率59%，m.p. 119.2～120.7 ℃;1H NMR (400 MHz, CDCl3),δ: 7.44 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 7.14 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 3.65 (s,3H), 3.60 (s, 3H), 2.78 (q,J= 3.6 Hz, 1H), 2.75 (s, 3H), 1.72(s, 3H), 1.19 (t,J= 6.8 Hz, 2H), 0.87～0.71 (m, 2H).13C NMR(100 MHz, CDCl3),δ: 193.4, 163.2, 159.6, 151.5, 147.3, 142.8,139.9, 135.5, 131.5, 114.9, 111.6, 103.6, 45.9, 32.5, 31.3, 25.5,19.2, 14.1, 8.9. HRMS (ESI): C19H20N4O4[M + Na]+, 計(jì)算值391.137 7, 測量值391.1370.

6-[(5-羥基-1,3-二甲基吡唑-4-基)羰基]-1,5-二甲基-3-環(huán)丁基-1,2,3,4-四氫喹唑啉-2,4-二酮9-17：白色固體，產(chǎn)率69%，m.p. 134.5～136.2 ℃;1H NMR (400 MHz, CDCl3),δ: 7.43 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 7.12 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 5.32～5.18(m, 1H), 3.63 (s, 3H), 3.58 (s, 3H), 2.91～2.79 (m, 2H), 2.73 (s,3H), 2.37～2.31 (m, 2H), 1.95～1.73 (m, 2H), 1.70 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, CDCl3),δ: 193.4, 162.4, 159.6, 150.7, 147.3,142.7, 139.9, 135.4, 131.4, 114.9, 111.5, 103.6, 49.0, 32.5,31.1, 28.0, 19.3, 15.2, 14.1. HRMS (ESI): C20H22N4O4[M +Na]+, 計(jì)算值405.153 3, 測量值405.153 6.

6-[(5-羥基-1,3-二甲基吡唑-4-基)羰基]-1,5-二甲基-3-環(huán)戊基-1,2,3,4-四氫喹唑啉-2,4-二酮9-18：白色固體，產(chǎn)率69%，m.p. 188.1～189.9 ℃;1H NMR (400 MHz, CDCl3),δ: 7.43 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 7.13 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 5.48～5.38(m, 1H), 3.63 (s, 3H), 3.59 (s, 3H), 2.76 (s, 3H), 2.21～2.11 (m,2H), 2.05～1.95 (m, 2H), 1.93～1.83 (m, 2H), 1.71 (s, 3H),1.68～1.58 (m, 2H).13C NMR (100 MHz, CDCl3),δ: 193.5,162.3, 159.6, 150.5, 147.3, 142.6, 140.0, 135.5, 131.4, 114.7,111.5, 103.6, 54.1, 32.5, 31.2, 28.3, 25.8, 19.4, 14.1. HRMS(ESI): C21H24N4O4[M + Na]+, 計(jì)算值419.169 0, 測量值419.168 8.

6-[(5-羥基-1,3-二甲基吡唑-4-基)羰基]-1,5-二甲基-3-環(huán)己基-1,2,3,4-四氫喹唑啉-2,4-二酮9-19：白色固體，產(chǎn)率59%，m.p. 234.9～236.8 ℃;1H NMR (400 MHz, CDCl3),δ: 7.43 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 7.12 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 4.93～4.84(m, 1H), 3.64 (s, 3H), 3.58 (s, 3H), 2.75 (s, 3H), 2.53～2.40 (m,2H), 1.91～1.82 (m, 2H), 1.71 (s, 3H), 1.70～1.64 (m, 3H),1.46～1.25 (m, 3H).13C NMR (100 MHz, CDCl3),δ: 193.5,162.4, 159.6, 150.6, 147.3, 142.7, 140.0, 135.4, 131.4, 114.7,111.5, 103.6, 55.1, 32.5, 31.2, 28.8, 26.4, 25.3, 19.5, 14.1.HRMS (ESI): C22H26N4O4[M + Na]+, 計(jì)算值433.184 6, 測量值433.184 6.

6-[(5-羥基-1,3-二甲基吡唑-4-基)羰基]-1,5-二甲基-3-(四氫呋喃-3-基)-1,2,3,4-四氫喹唑啉-2,4-二酮9-20：白色固體，產(chǎn)率63%，m.p. 183.1～184.7 ℃;1H NMR (400 MHz,CDCl3),δ: 7.46 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 7.15 (d,J= 8.4 Hz, 1H),5.79～5.69 (m, 1H), 4.30 (q,J= 7.6 Hz, 1H), 4.06～3.92 (m,3H), 3.64 (s, 3H), 3.61 (s, 3H), 2.75 (s, 3H), 2.44～2.14 (m,2H), 1.70 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, CDCl3),δ: 193.3,162.0, 159.5, 150.3, 147.2, 142.5, 140.2, 135.7, 131.7, 114.4,111.6, 103.6, 68.8, 68.2, 52.3, 32.5, 31.3, 29.0, 19.4, 14.1.HRMS (ESI): C20H22N4O5[M + Na]+, 計(jì)算值421.148 2, 測量值421.150 0.

6-[(5-羥基-1,3-二甲基吡唑-4-基)羰基]-1,5-二甲基-3-(3,4,5,6-四氫-2H-吡喃-4-基)-1,2,3,4-四氫喹唑啉-2,4-二酮9-21：白色固體，產(chǎn)率59%，m.p. 238.3～240.0 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3),δ: 7.45 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 7.14 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 5.20～5.10 (m, 1H), 4.12～4.05 (m, 2H), 3.64 (s, 3H),3.59 (s, 3H), 3.51 (t,J= 11.6 Hz, 2H), 2.92～2.80 (m, 2H), 2.74(s, 3H), 1.71 (s, 3H), 1.64～1.55 (m, 2H).13C NMR (100 MHz,CDCl3),δ: 193.3, 162.2, 159.5, 150.4, 147.2, 142.7, 140.1,135.6, 131.6, 114.5, 111.6, 103.6, 68.0, 51.9, 32.5, 31.2, 29.0,19.4, 14.1. HRMS (ESI): C21H24N4O5[M + Na]+, 計(jì)算值435.163 9,測量值435.164 0.

6-[(5-羥基-1,3-二甲基吡唑-4-基)羰基]-1,5-二甲基-3-(環(huán)丙基甲基)-1,2,3,4-四氫喹唑啉-2,4-二酮9-22：白色固體，產(chǎn)率63%，m.p. 109.4～111.6 ℃;1H NMR (400 MHz,CDCl3),δ: 7.46 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 7.17 (d,J= 8.8 Hz, 1H),3.97 (d,J= 7.2 Hz, 2H), 3.63 (s, 3H), 3.63 (s, 3H), 2.77 (s,3H), 1.71 (s, 3H), 1.36～1.27 (m, 1H), 0.52～0.46 (m, 2H),0.46～0.40 (m, 2H).13C NMR (100 MHz, CDCl3),δ: 193.4,162.0, 159.6, 150.9, 147.3, 142.8, 140.2, 135.5, 131.6, 114.4,111.6, 103.6, 46.3, 32.5, 31.4, 19.4, 14.1, 9.9, 3.8. HRMS(ESI): C20H22N4O4[M + Na]+, 計(jì)算值405.153 3, 測量值405.153 3.

6-[(5-羥基-1,3-二甲基吡唑-4-基)羰基]-1,5-二甲基-3-(環(huán)丁基甲基)-1,2,3,4-四氫喹唑啉-2,4-二酮9-23：白色固體，產(chǎn)率65%，m.p. 149.0～150.9 ℃;1H NMR (400 MHz,CDCl3),δ: 7.45 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 7.16 (d,J= 8.8 Hz, 1H),4.14 (d,J= 7.2 Hz, 2H), 3.65 (s, 3H), 3.62 (s, 3H), 2.79～2.75(m, 4H), 2.07～1.97 (m, 2H), 1.87～1.75 (m, 4H), 1.72 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, CDCl3),δ: 193.4, 161.9, 159.5, 150.9,147.3, 142.6, 140.1, 135.5, 131.5, 114.3, 111.6, 103.6, 46.5,34.3, 32.5, 31.4, 26.3, 19.4, 18.2, 14.1. HRMS (ESI):C21H24N4O4[M + Na]+, 計(jì)算值419.169 0, 測量值419.1695.

6-[(5-羥基-1,3-二甲基吡唑-4-基)羰基]-1,5-二甲基-3-(環(huán)戊基甲基)-1,2,3,4-四氫喹唑啉-2,4-二酮9-24：白色固體，產(chǎn)率68%，m.p. 139.2～141.1 ℃;1H NMR (400 MHz,CDCl3),δ: 7.46 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 7.17 (d,J= 8.8 Hz, 1H),4.06 (d,J= 7.6 Hz, 2H), 3.64 (s, 3H), 3.62 (s, 3H), 2.77 (s,3H), 2.45～2.32 (m, 1H), 1.75～1.63 (m, 7H), 1.57～1.47 (m,2H), 1.40～1.29 (m, 2H).13C NMR (100 MHz, CDCl3),δ:193.3, 162.0, 159.5, 150.9, 147.2, 142.6, 140.1, 135.5, 131.5,114.2, 111.6, 103.6, 46.1, 38.6, 32.5, 31.4, 30.3, 24.8, 19.4,14.1. HRMS (ESI): C22H26N4O4[M + Na]+, 計(jì)算值433.184 6,測量值433.185 6.

6-[(5-羥基-1,3-二甲基吡唑-4-基)羰基]-1,5-二甲基-3-(環(huán)己基甲基)-1,2,3,4-四氫喹唑啉-2,4-二酮9-25：白色固體，產(chǎn)率62%，m.p. 163.9～165.4 ℃;1H NMR (400 MHz,CDCl3),δ: 7.45 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 7.16 (d,J= 8.8 Hz, 1H),3.94 (d,J= 7.2 Hz, 2H), 3.64 (s, 3H), 3.62 (s, 3H), 2.77 (s,3H), 1.90～1.79 (m, 1H), 1.73～1.62 (m, 8H), 1.23～1.03 (m,5H).13C NMR (100 MHz, CDCl3),δ: 193.4, 162.0, 159.5,151.0, 147.3, 142.7, 140.2, 135.5, 131.5, 114.2, 111.6, 103.6,47.6, 36.3, 32.5, 31.4, 30.8, 26.3, 25.8, 19.4, 14.1. HRMS(ESI): C23H28N4O4[M + Na]+, 計(jì)算值447.200 3, 測量值447.199 3.

6-[(5-羥基-1,3-二甲基吡唑-4-基)羰基]-1,5-二甲基-3-(四氫呋喃-3-基甲基)-1,2,3,4-四氫喹唑啉-2,4-二酮9-26：白色固體，產(chǎn)率57%，m.p. 151.1～152.0 ℃;1H NMR (400 MHz, CDCl3),δ: 7.47 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 7.18 (d,J= 8.4 Hz,1H), 4.22～4.15 (m, 1H), 4.12～3.90 (m, 2H), 3.87～3.74 (m,2H), 3.66～3.59 (m, 7H), 2.80～2.72 (m, 4H), 2.05～1.74 (m,2H), 1.71 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, CDCl3),δ: 193.2,162.4, 159.3, 150.1, 147.3, 142.9, 140.1, 135.2, 131.3, 114.3,109.1, 102.1, 71.2, 68.0, 44.7, 39.3, 32.6, 31.0, 30.6, 16.2,14.8. HRMS (ESI): C21H24N4O5[M + H]+, 計(jì)算值413.181 9,測量值413.182 7.

6-[(5-羥基-1,3-二甲基吡唑-4-基)羰基]-1,5-二甲基-3-(3,4,5,6-四氫-2H-吡喃-4-基甲基)-1,2,3,4-四氫喹唑啉-2,4-二酮9-27：白色固體，產(chǎn)率69%，m.p. 169.0～170.5 ℃;1H NMR (400 MHz, CDCl3),δ: 7.47 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 7.17 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 4.00 (d,J= 7.2 Hz, 2H), 3.99～3.93 (m, 2H),3.64 (s, 3H), 3.62 (s, 3H), 3.39～3.31 (m, 2H), 2.77 (s, 3H),2.15～2.05 (m, 1H), 1.71 (s, 3H), 1.62～1.55 (m, 2H), 1.54～1.45(m, 2H).13C NMR (100 MHz, CDCl3),δ: 193.2, 162.0, 159.5,150.9, 147.2, 142.6, 140.2, 135.7, 131.7, 114.1, 111.6, 103.6,67.5, 47.0, 34.0, 32.5, 31.5, 30.7, 19.4, 14.1. HRMS (ESI):C22H26N4O5[M + Na]+, 計(jì)算值449.179 5, 測量值449.179 9.

6-[(5-羥基-1,3-二甲基吡唑-4-基)羰基]-1,5-二甲基-3-(2-甲基苯基)-1,2,3,4-四氫喹唑啉-2,4-二酮9-28：白色固體，產(chǎn)率69%，m.p. 160～162 ℃;1H NMR (600 MHz,CDCl3),δ: 7.54 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 7.37 (dt,J= 3.6, 1.2Hz,2H), 7.36 -7.32 (m, 2H), 7.17 (d,J= 7.2 Hz, 1H), 3.68 (s, 3H),3.66 (s, 3H), 2.76 (s, 3H), 2.18 (s, 3H), 1.79 (s, 3H). 13C NMR(150 MHz, CDCl3),δ: 193.2, 161.6, 159.6, 150.3, 147.3, 143.2,140.8, 135.9, 135.6, 134.8, 132.1, 131.1, 129.1, 128.2, 127.2,114.4, 111.9, 103.6, 32.6, 31.5, 19.3, 17.5, 14.2. HRMS (ESI):C23H23N4O4[M + H]+, 計(jì)算值419.171 4, 測量值419.172 0.

6-[(5-羥基-1,3-二甲基吡唑-4-基)羰基]-1,5-二甲基-3-(3-甲基苯基)-1,2,3,4-四氫喹唑啉-2,4-二酮9-29：白色固體，產(chǎn)率60%，m.p. 245～247 ℃;1H NMR (600 MHz,CDCl3),δ: 7.46 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 7.35 (t,J= 7.7 Hz, 1H),7.20 (s, 1H), 7.18 (s, 1H), 7.01 (d,J= 12.0 Hz, 2H), 3.60 (s,3H), 3.57 (s, 3H), 2.67 (s, 3H), 2.34 (s, 3H), 1.68 (s, 3H).13C NMR (150 MHz, CDCl3),δ: 193.3, 162.1, 159.5, 150.8, 147.3,143.0, 140.7, 139.6, 135.8, 135.5, 132.0, 129.7, 129.3, 128.7,125.1, 114.5, 112.0, 103.6, 32.5, 31.5, 21.4, 19.4, 14.1. HRMS(ESI): C23H23N4O4[M + H]+, 計(jì)算值419.171 4, 測量值419.170 4.

6-[(5-羥基-1,3-二甲基吡唑-4-基)羰基]-1,5-二甲基-3-(4-甲基苯基)-1,2,3,4-四氫喹唑啉-2,4-二酮9-30：白色固體，產(chǎn)率63%，m.p. 275～277 ℃;1H NMR (400 MHz,CDCl3),δ: 7.52 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 7.33 (d,J= 8.0 Hz, 2H),7.24 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 7.15 (d,J= 8.0 Hz, 2H), 3.67 (s, 3H),3.65 (s, 3H), 2.74 (s, 3H), 2.41 (s, 3H), 1.76 (s, 3H).13C NMR(150 MHz, CDCl3),δ: 193.3, 162.1, 159.4, 150.8, 147.3, 143.0,140.6, 138.7, 135.7, 132.9, 132.0, 130.2, 127.9, 114.4, 111.9,103.6, 32.5, 31.5, 21.2, 19.4, 14.1. HRMS (ESI): C23H23N4O4[M + H]+, 計(jì)算值419.171 4, 測量值419.171 6.

2.2 酶水平活性測試和構(gòu)效關(guān)系分析

為了得到活性優(yōu)異的HPPD 抑制劑，在母體結(jié)構(gòu)的R 位點(diǎn)引入了不同類型的取代基，例如：直鏈烷基、環(huán)烷基、含雜原子或不飽和鍵的烷基以及具有強(qiáng)疏水性的芳基結(jié)構(gòu)。目標(biāo)化合物9-1～9-30 對AtHPPD 的抑制活性測定結(jié)果如表1 所示?？偟膩砜?，該系列大部分化合物的酶抑制活性均優(yōu)于對照藥劑喹草酮 (IC50= (0.375 ± 0.012)μmol/L)。接下來，將分別討論不同類別的取代基對化合物活性的影響。

首先，合成了簡單直鏈烷基取代的吡唑-喹唑啉二酮衍生物9-1～9-30，發(fā)現(xiàn)R 位置的烷基鏈類型與它們對應(yīng)的IC50值有著一定的關(guān)聯(lián)性 (表1)，表現(xiàn)為碳鏈的長度顯著影響了分子的酶抑制活性。與甲基取代的化合物 (9-1) 相比 (IC50= (0.295 ±0.002) μmol/L)，乙基和丙基取代的化合物9-2和9-3 (IC50值分別為 (0.227 ± 0.022) μmol/L 和(0.208 ± 0.010) μmol/L) 對AtHPPD 擁有更優(yōu)的抑制活性。當(dāng)繼續(xù)延長分子側(cè)鏈的碳鏈長度，發(fā)現(xiàn)正丁基取代并未進(jìn)一步提高酶抑制活性 (化合物9-4，IC50= (0.311 ± 0.009) μmol/L)。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是因?yàn)镽 部分引入鏈長較長的基團(tuán)，會使小分子的末端伸出AtHPPD 的活性空腔，從而引起酶抑制活性的降低。根據(jù)上述的活性數(shù)據(jù)可以總結(jié)出一個(gè)簡要的構(gòu)效關(guān)系 (SAR) 信息：正丙基 (9-3) ＞乙基 (9-2) ＞ 甲基 (9-1) ＞ 正丁基 (9-4)，這表明：R 位置中等長度烷基鏈 (C2～C3) 的引入更能提高抑制劑與靶標(biāo)的結(jié)合力?；诖?，嘗試在保持側(cè)鏈為2～3 個(gè)碳原子烷基取代的同時(shí)，在α 位引入甲基，以此來進(jìn)一步研究構(gòu)效關(guān)系。結(jié)果表明，化合物9-5 和9-6 的酶抑制活性 (IC50值分別為 (0.183 ± 0.009) μmol/L 和 (0.172 ± 0.014)μmol/L) 相比于其母體化合物有了一定的提升，這說明適當(dāng)增加α處的位阻有利于酶抑制活性的提高。

表1 目標(biāo)化合物9-1～9-30 的溫室除草活性 (150 g/hm2) 和對AtHPPD 的IC50 值Table 1 Greenhouse herbicidal activities of compounds 9-1-9-30 at 150 g/hm2 and IC50 values against AtHPPD

接下來，討論了在優(yōu)勢烷基鏈上引入雜原子，并研究其對分子酶抑制活性的影響。結(jié)果表明，當(dāng)R 為CH2CH2F 時(shí)，所得到的化合物9-7對AtHPPD 活性的抑制水平 (IC50= (0.254 ± 0.018)μmol/L) 不如其母體化合物9-2。當(dāng)繼續(xù)在其末端增加氟原子時(shí)，導(dǎo)致相應(yīng)化合物9-8 和9-9 的酶抑制活性顯著降低 (IC50值分別為 (0.274 ± 0.018)μmol/L 和 (0.336 ± 0.033) μmol/L)，這種現(xiàn)象在以化合物9-3 為母體時(shí)同樣存在。例如，當(dāng)R 分別為CH2CH2CH2F和CH2CH2CF3時(shí)，化合物9-10和9-11 的酶抑制活性 (IC50值分別為 (0.228 ±0.007) μmol/L 和 (0.294 ± 0.014) μmol/L) 與9-3 相比有了部分程度的降低，這說明吸電子基團(tuán)的引入不利于提高化合物的酶抑制活性。進(jìn)一步的，在化合物9-3 的支鏈烷基側(cè)鏈中插入一個(gè)氧原子來增加分子的柔性，結(jié)果表明，對應(yīng)化合物9-12的酶抑制活性也有所降低 (IC50= (0.253 ± 0.017)μmol/L)。由于AtHPPD 活性空腔的末端由多個(gè)疏水性氨基酸殘基組成，而氧原子和氟原子屬于極性基團(tuán)，因此這些雜原子的引入不利于化合物與AtHPPD 的結(jié)合。緊接著，在R 位置引入不飽和取代基，發(fā)現(xiàn)對應(yīng)化合物 (9-13～9-15) 的酶抑制活性有了一定程度的提升 (IC50值在0.176～0.190 μmol/L 之間)。

在隨后的分子優(yōu)化中，繼續(xù)合成了R 位置為環(huán)烷基取代的衍生物，用于探究這些強(qiáng)疏水基團(tuán)的類型對靶標(biāo)酶抑制能力的影響。首先，當(dāng)引入環(huán)丙基時(shí)，相應(yīng)化合物的酶抑制活性 (化合物9-16，IC50= (0.463 ± 0.015) μmol/L) 不及對照藥劑喹草酮。隨后，通過擴(kuò)大環(huán)的尺寸，分別引入了環(huán)丁基、環(huán)戊基和環(huán)己基，R 位置被各種環(huán)烷基取代的化合物對AtHPPD 的親和力順序可以總結(jié)為：環(huán)戊基 (9-18，IC50= (0.157 ± 0.008) μmol/L) ＞環(huán)己基 (9-19，IC50= (0.169 ± 0.002) μmol/L) ＞ 環(huán)丁基 (9-17，IC50= (0.238 ± 0.005) μmol/L) ＞ 環(huán)丙基 (9-16，IC50= (0.463 ± 0.015) μmol/L)，這說明環(huán)烷基的張力過大不利于化合物與靶標(biāo)的結(jié)合。此外，用四氫呋喃-3-基 (9-20) 和四氫-2H-吡喃-4-基(9-21) 代替環(huán)戊基和環(huán)己基部分使分子的AtHPPD抑制作用下降 (IC50值分別為 (0.172 ± 0.011) μmol/L和 (0.208 ± 0.010) μmol/L)。進(jìn)一步對表1 數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，通過在環(huán)烷基和喹唑啉二酮環(huán)之間添加一個(gè)亞甲基將會提高分子的酶抑制活性，對應(yīng)化合物9-22 至9-27 的IC50值介于0.136～0.332 μmol/L 之間。在該子系列衍生物中，上述有關(guān)環(huán)張力的構(gòu)效關(guān)系規(guī)律也適用于插入亞甲基橋鏈的衍生物中。由以上構(gòu)效關(guān)系可以看出，在R 處引入具有強(qiáng)疏水作用的基團(tuán)，將會與AtHPPD 活性空腔末端的疏水性氨基酸殘基形成相互作用，從而有利于化合物酶抑制活性的提升，基于此，在R 處引入了甲基取代的苯基，得到了化合物9-28～9-30。結(jié)果表明，3-甲基苯基取代的化合物 (9-29，IC50= (0.199 ± 0.010) μmol/L) 的酶抑制活性優(yōu)于4-甲基苯基取代 (9-30，IC50= (0.247 ± 0.013)μmol/L) 和2-甲基苯基取代 (9-28，IC50= (0.370 ±0.026) μmol/L) 的化合物。

2.3 除草活性

目標(biāo)化合物的溫室除草活性測試結(jié)果 (表1)表明，大部分吡唑-喹唑啉二酮衍生物對6 種靶標(biāo)雜草 (稗草、狗尾草、馬唐、莧菜、藜、苘麻) 表現(xiàn)出一定的防治效果 (調(diào)查時(shí)間30 d)。具體而言，在有效成分150 g/hm2的劑量下，飽和直鏈烷基取代的化合物9-1、9-2 和9-3 在對6 種測試雜草進(jìn)行苗后處理后，對除莧菜之外的5 種雜草表現(xiàn)出了60%以上的生長抑制作用，而正丁基取代的化合物9-4 的除草活性相比于其他直鏈烷基有了明顯降低。對于α位有甲基取代的化合物9-5 和9-6，其對闊葉雜草的防效優(yōu)于對禾本科雜草，兩個(gè)化合物對莧菜、藜和苘麻的防效均達(dá)到了80%以上。當(dāng)烷基側(cè)鏈帶有單個(gè)或多個(gè)氟原子時(shí)，化合物9-7 至9-11 能夠以80%以上的除草抑制率控制所測試禾本科雜草狗尾草和馬唐的生長。在烯基和炔基系列化合物中，當(dāng)不飽和鍵末端不連接任何取代基時(shí)，相應(yīng)化合物9-13 和9-14 對除馬唐之外的測試雜草的抑制率均有80%以上，當(dāng)不飽和鍵末端連接甲基時(shí)，相應(yīng)化合物9-15 對6 種雜草的除草活性除藜外均有不同程度的下降。該結(jié)果表明，盡管化合物9-15 與AtHPPD具有較好的親和力，但是在不飽和烷基中引入額外的疏水基團(tuán)則不利于其活體活性的提高。

在環(huán)烷基取代的衍生物中，R 為環(huán)丙基取代的化合物9-16對狗尾草的活性達(dá)到了80%以上，但是對于其他供試雜草的活性并不理想。當(dāng)將環(huán)烷基的體積擴(kuò)大時(shí)，相應(yīng)化合物9-17至9-19的除草活性有了大幅度的提升，特別是化合物9-19，在150 g /hm2下對供試的5 種雜草具有80%以上的防效，對稗草和藜具有完全的防效。當(dāng)在環(huán)烷基上引入雜原子時(shí) (化合物9-20和9-21)，將不利于除草活性的維持。而當(dāng)在環(huán)烷基與喹唑啉二酮之間增加一個(gè)亞甲基時(shí)，盡管相應(yīng)化合物 (9-22～9-27) 的離體活性相比于不帶亞甲基的衍生物有一定的提高，但除草活性并不理想，對狗尾草和馬唐的活性幾乎喪失，可能是由于亞甲基的存在降低了化合物的穩(wěn)定性，從而影響了除草活性。當(dāng)R 為甲基取代的苯基時(shí)，其整體的除草活性優(yōu)于烷基取代，這可能是由于芳基的引入有利于化合物在植物體內(nèi)的吸收傳導(dǎo)代謝，特別是R 為2-甲基苯基取代時(shí)，對應(yīng)化合物9-28在150 g/hm2的劑量下對6 種供試雜草具有80%以上的防效，并且對稗草和馬唐的防效達(dá)到了100%，具有進(jìn)一步研究的潛力。

2.4 代表性化合物9-28 與AtHPPD 的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)

為了更好地了解化合物與靶標(biāo)酶的作用模式，利用已報(bào)道的方法[20]獲得了代表性化合物9-28與AtHPPD 的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu) (圖1)，分辨率為1.886 ? (0.188 6 nm) (PDB 編號：7EZQ)。從圖1A中可以看到，化合物9-28的雙羰基與AtHPPD 活性空腔的金屬離子形成了配位作用。除此之外，金屬離子還與His226、His308、Glu394 和一個(gè)水分子也形成了配位作用。從活性空腔中的小分子電子云密度分布 (圖1B) 可以看出，其輪廓與化合物9-28的結(jié)構(gòu)相一致，這說明了復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的正確性。圖1C 顯示了化合物9-28與AtHPPD活性空腔的相互作用?？梢钥闯?，除了化合物9-28的雙羰基與金屬離子之間的螯合作用之外，小分子的喹唑啉二酮部分與酶活性空腔中的Phe381和Phe424 形成了π-π 堆積作用，并且R 處的鄰甲基苯基處在由Gln293、Phe424、Leu427、Leu368、Met335 和Phe381 組成的疏水空腔中，形成了疏水相互作用。同時(shí)，觀察了AtHPPD-9-28與AtHPPD-喹草酮的疊合圖，從圖1D 中可以看到，化合物9-28與喹草酮在活性空腔中的構(gòu)象大致相同，兩者均與活性空腔形成了螯合作用和π-π 堆積作用。與喹草酮末端的2,6-二甲基苯基相比，化合物9-28末端的鄰甲基苯基更加接近于靶標(biāo)酶的疏水空腔。

圖1 目標(biāo)化合物9-28 與AtHPPD 的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)Fig. 1 Co-crystal structure of AtHPPD-9-28

3 結(jié)論

本研究以喹草酮為先導(dǎo)化合物，根據(jù)前期的構(gòu)效關(guān)系，將其中的藥效團(tuán)三酮替換成了吡唑，并在喹唑啉二酮的5 號位引入了甲基，設(shè)計(jì)并合成了30 個(gè)新型吡唑-喹唑啉二酮類HPPD 抑制劑。在離體活性測試中，大部分化合物的酶水平抑制活性優(yōu)于對照藥劑喹草酮。在溫室除草活性測試中，化合物9-28在有效成分150 g/hm2的劑量下對狗尾草、莧菜、藜和苘麻均有80%以上的防效，對稗草和馬唐的防效達(dá)到了100%，優(yōu)于對照藥劑喹草酮。復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)研究表明，化合物9-28與AtHPPD 之間擁有經(jīng)典的鰲合作用和π-π 堆積作用，這與對照藥劑喹草酮與AtHPPD 的結(jié)合模式相類似。上述結(jié)果表明，化合物9-28可作為新的苗頭化合物進(jìn)行更加深入的結(jié)構(gòu)改造，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

謹(jǐn)以此文慶賀中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)學(xué)科成立70 周年。

Dedicated to the 70th Anniversary of Pesticide Science in China Agricultural University.

作者簡介：

嚴(yán)耀超，男，2017 年畢業(yè)于湖北師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，獲理學(xué)學(xué)士學(xué)位；2020 年畢業(yè)于華中師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，獲理學(xué)碩士學(xué)位；2020 年9 月于華中師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院繼續(xù)攻讀博士學(xué)位，研究方向?yàn)榘邢驅(qū)αu基苯丙酮酸雙加氧酶抑制劑的設(shè)計(jì)與合成。

王亞楠，女，2018 年畢業(yè)于鄭州師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，獲理學(xué)學(xué)士學(xué)位；2021 年畢業(yè)于華中師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，獲理學(xué)碩士學(xué)位。

何波，男，2020 年畢業(yè)于華中師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，獲理學(xué)博士學(xué)位；博士期間創(chuàng)制出可用于水稻田雜草防控的新型化合物吡唑喹草酯，目前正在進(jìn)行新農(nóng)藥登記?，F(xiàn)任職于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，研究方向?yàn)榛诮Y(jié)構(gòu)的綠色農(nóng)藥分子合理設(shè)計(jì)與合成，以及靶向抑制劑分子的類農(nóng)藥性優(yōu)化及活性評估。

林紅艷，女，2017 年畢業(yè)于華中師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，獲理學(xué)博士學(xué)位；博士期間獲得并解析了多個(gè)抑制劑與擬南芥對羥基苯丙酮酸雙加氧酶復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，為深入理解酶催化反應(yīng)機(jī)制奠定了良好的基礎(chǔ)?，F(xiàn)任職于華中師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，研究方向?yàn)檗r(nóng)藥化學(xué)生物學(xué)，結(jié)構(gòu)生物學(xué)，以及基于靶標(biāo)結(jié)構(gòu)的新型藥物分子的合理設(shè)計(jì)。

楊光富，男，1997 年畢業(yè)于南開大學(xué)元素有機(jī)化學(xué)研究所，獲理學(xué)博士學(xué)位。2004—2005 年赴美國肯塔基大學(xué)藥學(xué)院高級訪問學(xué)者，2012 年8 月赴加拿大麥克馬斯特大學(xué)高級訪問學(xué)者?，F(xiàn)任華中師范大學(xué)教授、農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任、校學(xué)術(shù)委員會副主任及《農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)》副主編。長期從事農(nóng)藥創(chuàng)制研究，在農(nóng)藥分子設(shè)計(jì)研究方面取得系統(tǒng)性研究成果，創(chuàng)制出喹草酮、吡唑喹草酯和氟苯醚酰胺等6 個(gè)農(nóng)藥候選新品種。2009 年獲國家杰出青年科學(xué)基金資助，2016 年入選“萬人計(jì)劃”科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才。曾獲教育部自然科學(xué)一等獎、湖北省自然科學(xué)一等獎及藥明康德生命化學(xué)研究獎各1 項(xiàng)。先后被授予全國模范教師、全國優(yōu)秀科技工作者等榮譽(yù)稱號。所指導(dǎo)的博士學(xué)位論文中，獲全國百篇優(yōu)秀博士學(xué)位論文獎1 項(xiàng)、提名獎2 項(xiàng)。