羅鈺雯，夏 靜，李念靈，李永新，申玉璽，李淑蕓，陳 雯，樊順怡，崔 敏， 黃 勇

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130)

H9N2亞型禽流感病毒(H9N2 subtype of Avian influenza virues，H9N2 AIV)于1966年在美國(guó)威斯康星州首次被分離，至今蔓延全球，此病毒造成禽類呼吸困難，產(chǎn)蛋量下降。H9N2 AIV致病性較低，但其易與其他病原體混合感染禽類，導(dǎo)致病情加重，從而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。H9N2 AIV在我國(guó)廣泛流行，在雞、鴨、鵪鶉、野雞、鷓鴣、鴿子、白鷺和豬等動(dòng)物中均已分離到。遺傳進(jìn)化分析表明，在我國(guó)雞群中病毒主要流行亞型為Y280-like，而G1-like亞型僅在鵪鶉等珍禽中流行。此外，H9N2 AIV還可突破物種屏障，造成人的感染。截至2020年，世界衛(wèi)生組織(WHO)和中國(guó)疾病預(yù)防控制中心(CDC)共報(bào)告50例人感染H9N2的病例，且主要屬于Y280-like亞型，所幸暫無(wú)人傳人的報(bào)道。H9N2病毒除了可以從禽直接感染人之外，還可通過(guò)豬、寵物狗等其他中間哺乳動(dòng)物感染人。此外，H9N2 AIV還為H5N1、H1N1、H7N10等AIV亞型提供內(nèi)部基因。因此，H9N2 AIV成為具有大流行潛力的流感病毒之一。

流感病毒的基因組由8段負(fù)鏈RNA組成，基因組RNA(vRNAs)是病毒mRNA和cRNA在感染細(xì)胞中合成的模板。病毒mRNAs是vRNAs的不完全拷貝。在vRNA的3′端啟動(dòng)mRNA合成，以從宿主mRNAs搶奪的10～13個(gè)核苷酸的含帽片段作為引物，mRNA合成終止于距vRNA 5′端尿苷殘基16個(gè)核苷酸的延伸處，最后加入poly(A)尾。研究表明，在甲型AIV RNA 5′端附近的一段尿嘧啶(U)是病毒mRNA合成的多腺苷化位點(diǎn)。在AIV的轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，vRNA5′端末始終與RNA依賴的RNA聚合酶復(fù)合體相結(jié)合，而vRNA模板則以3′到5′的方向通過(guò)聚合酶復(fù)合體。由于5′末端存在5～7個(gè)堿基U，于是反復(fù)拷貝堿基U，從而產(chǎn)生一個(gè)poly(A)尾。vRNA模板的5～7個(gè)堿基U形成的聚腺苷酸化信號(hào)對(duì)于病毒基因的轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要。當(dāng)vRNA模板的5′末端發(fā)生突變時(shí)，失去與聚合酶的結(jié)合作用或?qū)е陆Y(jié)合能力減弱時(shí)，就會(huì)抑制聚腺苷酸化過(guò)程。而當(dāng)vRNA模板的5′端一連串U被替換為A時(shí)，就會(huì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生帶有poly(U)尾巴的mRNA轉(zhuǎn)錄本，因此不能由細(xì)胞核輸出到細(xì)胞質(zhì)中。

本實(shí)驗(yàn)室于2014年從四川省德陽(yáng)市的蛋雞場(chǎng)分離一株H9N2 AIV，命名為A/Chicken/China/Sichuan/CQY/2014(H9N2)。該分離株臨床上可引起雞群明顯的呼吸困難，剖檢可見(jiàn)嚴(yán)重的氣管和肺出血，發(fā)病率約40%?；蜻z傳進(jìn)化分析顯示，A/Chicken/China/Sichuan/CQY/2014(H9N2)屬于Y280-like亞型h9.4.2.5分支。對(duì)近年來(lái)H9N2 AIV分離株的全基因組核苷酸序列分析顯示，基因5′端多聚腺苷酸化信號(hào)位點(diǎn)處具有多樣性，多為5個(gè)(U)或6個(gè)(U)連續(xù)的堿基U，而其他基因則為單一的U結(jié)構(gòu)。因此，本研究以該分離株為骨架，構(gòu)建H9N2反向遺傳操作系統(tǒng)，同時(shí)對(duì)基因5′端多聚腺苷酸化信號(hào)位點(diǎn)5個(gè)或6個(gè)堿基U是否影響病毒的生物學(xué)特性進(jìn)行了初步的探究。

1 材料與方法

1.1 毒株與載體

A/Chicken/China/Sichuan/CQY/2014(H9N2)(以下簡(jiǎn)稱CQY-H9N2)AIV由本實(shí)驗(yàn)室分離保存；pHW2000質(zhì)粒購(gòu)于淼靈質(zhì)粒平臺(tái)。

1.2 菌種、細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

TOP10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自上海擎科生物科技有限公司；MDCK細(xì)胞由四川省自貢市疾病預(yù)防控制中心提供；293T細(xì)胞由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院豬病研究中心提供；SPF雞胚購(gòu)自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要試劑

PrimeSTAR Max Premix (2×)、Premix(TaKaRaVersion 2.0 plus dye)、5×PrimeScript RT Master Mix、QuickcutⅠ限制性核酸內(nèi)切酶、TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit均購(gòu)自TaKaRa公司；Gel&PCR Clean Up Kit購(gòu)自O(shè)MEGA公司；SE無(wú)縫克隆和組裝試劑盒購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司；FBS胎牛血清購(gòu)自PAN公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine3000 Reagent Protocol購(gòu)自ThermoFisher公司。

1.4 病毒的擴(kuò)繁

將本實(shí)驗(yàn)室保存的CQY-H9N2株稀釋1 000倍，采用絨毛尿囊腔接種法接種于9～10日齡的SPF雞胚。棄去24 h內(nèi)死亡雞胚，連續(xù)培養(yǎng)72 h后無(wú)菌收集絨毛尿囊液，并按照已建立的檢測(cè)方法對(duì)尿囊液進(jìn)行病毒檢測(cè)。

1.5 病毒RNA的提取及目的片段的擴(kuò)增

病毒RNA的提取方法按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，從200 μL陽(yáng)性尿囊液中抽提病毒的總RNA后立即沸水浴3 min，冰水浴2 min，隨后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系為RNA 5 μL，5 × PrimeScript RT Master Mix 4 μL，ddHO補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?7 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s。以此 cDNA 為模板，使用PrimeSTAR Max Premix高保真酶和表1中的克隆引物分別擴(kuò)增CQY-H9N2的8個(gè)片段：2、1、、、、、、，目的片段純化回收后，由生工生物工程(上海)股份有限公司成都分公司進(jìn)行測(cè)序，序列信息上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)：MW493190-MW493196、MW493229。

1.6 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

為減少克隆步驟，以及避免目的片段中IIs型內(nèi)切酶位點(diǎn)B I和I的沉默突變，本研究采用同源重組的方法將CQY-H9N2的八段基因分別克隆入pHW2000質(zhì)粒中。質(zhì)粒采用PCR擴(kuò)增的方式線性化，質(zhì)粒擴(kuò)增引物為pHW2000F：CCCCCCCAACTTCGGAGGTC和pHW2000R：AATAACCCGGCGGCCCAAAA。使用SE無(wú)縫克隆和組裝試劑盒將回收的線性化質(zhì)粒和1.5節(jié)中獲得的目的片段進(jìn)行同源重組，載體與目的片段的摩爾比為1∶(2～4)，37 ℃連接30 min后將重組子轉(zhuǎn)化至 TOP10 感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)20 h后進(jìn)行菌落PCR鑒定。菌落PCR陽(yáng)性菌置于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，采用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒，單酶切鑒定無(wú)誤后將質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，每個(gè)片段測(cè)3個(gè)樣本，選取無(wú)突變的質(zhì)粒保存?zhèn)溆?表1)。

表1 同源重組法構(gòu)建重組質(zhì)粒的引物

1.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與病毒拯救

將293T細(xì)胞培養(yǎng)于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至85%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟按照Lipofectamine3000 Reagent Protocol說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，具體如下：取2個(gè)無(wú)菌的EP管，編號(hào)為A和B。A管中加入1.87 μL Lipofectamine3000 Reagent和62.5 μL opti-MEM培養(yǎng)基，靜置5 min；B管中加入8個(gè)重組質(zhì)粒(每種質(zhì)粒200 ng)和5 μL Lipofectamine3000和62.5 μL opti-MEM培養(yǎng)基。將A和B管混合后室溫靜置孵育15 min。用預(yù)熱的opti-MEM培養(yǎng)基清洗細(xì)胞2～3次，將AB混合液加入至細(xì)胞中，于37 ℃、5% CO的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，加入1 mL opti-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24～36 h。收集細(xì)胞和上清液，反復(fù)凍融3次后離心，將上清接種于密度為90%的MDCK細(xì)胞中，培養(yǎng)6 h后加入終濃度為2 μg·mL的TPCK-Trypsin，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收集細(xì)胞和上清液連續(xù)盲傳3代后，收集細(xì)胞上清進(jìn)行血凝試驗(yàn)和RT-PCR檢測(cè)。拯救成功的病毒分別命名為rCQYU-H9N2與rCQYU-H9N2。

1.8 病毒的基因組測(cè)序

將拯救的CQY-H9N2毒株進(jìn)行基因組序列測(cè)定，以確定病毒在拯救過(guò)程中是否發(fā)生突變。具體操作方法參考1.5節(jié)進(jìn)行。

1.9 EID50、TCID50和MOI的測(cè)定

rCQY-H9N2毒株與親本毒株的TCID和EID的測(cè)定參照Reed-Muench法進(jìn)行。

1.10 生長(zhǎng)曲線的比較

將 MDCK 細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞形成單層后用預(yù)熱的opti-MEM培養(yǎng)基清洗3次，將病毒以10TCID的劑量接種于6孔板中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中吸附1 h，用 PBS 清洗3次后加入2 μg·mLTPCK-Trypsin opti-MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。以10EID的病毒劑量接種10日齡SPF雞胚，在37 ℃下孵育。分別在接種MDCK和雞胚后2 、4 、6 、12 、24 、36 、48 、72 h 收取細(xì)胞上清或絨毛尿囊液，進(jìn)行熒光定量測(cè)定其核酸拷貝數(shù)，然后繪制病毒的生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果

提取病毒的總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得病毒的cDNA，然后通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增目的基因片段。結(jié)果顯示，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增出的2、1、、、、、、目的片段的大小與目標(biāo)序列是相同的(圖1)。

M1， DL2000 DNA Marker； M2， DL5000 DNA Marker； NS～PB2，引物NS～PB2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。M1， DL2000 DNA Marker； M2， DL5000 DNA Marker； NS-PB2，PCR products of primer NS-PB2.圖1 A/Chicken/China/Sichuan/CQY/2014(H9N2) 毒株全基因RT-PCR結(jié)果Fig.1 A/Chicken/China/Sichuan/CQY/2014(H9N2) strain whole-genome RT-PCR result

2.2 構(gòu)建重組質(zhì)粒及拯救病毒

將純化的目的片段與pHW2000載體同源重組后，轉(zhuǎn)化至TOP10感受態(tài)細(xì)胞中。提取質(zhì)粒并測(cè)序，通過(guò)序列比對(duì)可知，本研究構(gòu)建的8個(gè)質(zhì)粒核苷酸序列均無(wú)突變。通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將這8個(gè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后并在MDCK上盲傳3代，細(xì)胞出現(xiàn)變圓、脫落，形成空斑病變(圖2)，成功獲得拯救病毒rCQYU-H9N2與rCQYU-H9N2。

A，正常 MDCK 細(xì)胞；B，接種500 μL 的rCQYU5-H9N2在48 h MDCK 細(xì)胞 CPE；C，接種500 μL 的rCQYU6-H9N2在48 h MDCK 細(xì)胞 CPE；D，接種500 μL 的CQY-H9N2 在48 h MDCK細(xì)胞CPE。A， Normal MDCK cells； B， MDCK cells were inoculated with 500 μL rCQYU5-H9N2 influenza virus CPE at 48 h； C， MDCK cells were inoculated with 500 μL rCQYU6-H9N2 influenza virus CPE at 48 h；D， MDCK cells were inoculated with 500 μL CQY-H9N2 influenza virus CPE at 48 h.圖2 rCQY-H9N2在 MDCK 細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)胞病變Fig.2 Cytopathy of rCQY-H9N2 in MDCK cell culture

2.3 rCQY-H9N2 毒株的鑒定和其與親本毒株血凝效價(jià) 、EID50和TCID50 的測(cè)定

rCQYU-H9N2毒株的血凝效價(jià)、EID和TCID滴度與親本毒株無(wú)明顯差異，但高于rCQYU-H9N2株(表2)。

表2 病毒生物學(xué)特性

2.4 rCQY-H9N2 毒株與親本病毒在MDCK和雞胚上生長(zhǎng)曲線比較

rCQY-H9N2 (rCQYU-H9N2和rCQYU-H9N2)與親本毒株在雞胚和MDCK上均可高效復(fù)制，其生長(zhǎng)曲線無(wú)顯著性差異，結(jié)果見(jiàn)圖3。

A， 病毒在MDCK細(xì)胞中的生長(zhǎng)曲線；B，病毒在雞胚中的生長(zhǎng)曲線。拷貝數(shù)以單位體積(1 μL)核酸拷貝數(shù)量的指數(shù)對(duì)數(shù)值表示。A，Growth curves of virus on MDCK cells； B， Growth curves of virus on chicken embryo. Copy number was expressed as the logarithm of the number of nucleic acid copies per unit volume (1 μL).圖3 病毒在雞胚和MDCK細(xì)胞中的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curves of virus on chicken embryo and MDCK cells

3 討論

在克隆過(guò)程中，由于流感病毒為分段RNA病毒，經(jīng)典方法采用B Ⅰ雙酶切線性化質(zhì)粒與目的片段。但是由于B Ⅰ酶切效率較低且該質(zhì)粒需要進(jìn)行雙酶切，因此盡管延長(zhǎng)酶切時(shí)間，增大酶量，仍然會(huì)有環(huán)狀質(zhì)粒存在，且酶切后由于黏性末端的存在，線性質(zhì)粒易產(chǎn)生自連，這使得克隆過(guò)程中假陽(yáng)性率高，嚴(yán)重干擾試驗(yàn)結(jié)果。此外，由于多數(shù)流感病毒基因組含有II型酶切位點(diǎn)B Ⅰ和Ⅰ，因此，較多研究采用沉默突變方法改變基因組序列，耗時(shí)耗力。本試驗(yàn)采用PCR擴(kuò)增線性化質(zhì)粒和同源重組克隆，在一定程度上減少了質(zhì)粒自連以及酶切效率低的問(wèn)題，陽(yáng)性克隆效率為50%～90%。轉(zhuǎn)染細(xì)胞選擇方面，大多文獻(xiàn)使用293T細(xì)胞與MDCK細(xì)胞混合培養(yǎng)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，二者混合培養(yǎng)，MDCK細(xì)胞對(duì)293T細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，293T細(xì)胞活性差，從而無(wú)法達(dá)到轉(zhuǎn)染條件。因此，本試驗(yàn)僅采用293T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，且在293T細(xì)胞培養(yǎng)期間不添加經(jīng)典方法中的TPCK-Trypsin，以確保293T細(xì)胞的活性。

我們成功構(gòu)建出A/Chicken/China/Sichuan/CQY/2014反向遺傳操作平臺(tái)，并利用該平臺(tái)初步探究了基因5′末端多聚腺苷酸化信號(hào)位置連續(xù)的U與U對(duì)病毒生物學(xué)特性的影響。研究結(jié)果表明，H9N2 AIV基因5′末端多聚腺苷酸化信號(hào)連續(xù)的U或U對(duì)病毒的轉(zhuǎn)染沒(méi)有影響，這與Li等的研究結(jié)果相同。而HA、EID與TCID結(jié)果顯示的rCQYU-H9N2滴度低于rCQYU-H9N2與親本毒株，與Li等的研究結(jié)果略有差異。

流感病毒的vRNA是轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA和復(fù)制產(chǎn)生cRNA并最終合成子代病毒vRNA的模板。從vRNA模板5′端開(kāi)始到多聚腺苷酸化信號(hào)位點(diǎn)有16個(gè)堿基(16 nt)，與3′末端互補(bǔ)配對(duì)形成柄狀結(jié)構(gòu)，研究表明這16個(gè)堿基至關(guān)重要，寡核苷酸(U)群僅向5′端遷移一位(16 nt → 15 nt)可顯著降低多聚腺苷酸化水平。在準(zhǔn)確合成cRNA的過(guò)程中，流感病毒RNA聚合酶必須在復(fù)制時(shí)選擇忽略多聚腺苷酸化信號(hào)。在Li等的研究中，vRNA 5′端多聚腺苷酸化信號(hào)位點(diǎn)U轉(zhuǎn)錄生成的mRNA比U多出13%，因此，我們推測(cè)，流感病毒的vRNA模板5′端多聚腺苷酸化信號(hào)位點(diǎn)U的個(gè)數(shù)越多，復(fù)制時(shí)RNA聚合酶反復(fù)拷貝vRNA的U段錯(cuò)誤合成poly(A)的幾率越大。在某些情況下，病毒RNA聚合酶在合成cRNA時(shí)可能做出了錯(cuò)誤的選擇，從而導(dǎo)致在U段停止復(fù)制。這種情況可能發(fā)生的比較頻繁，在大多數(shù)情況下，RNA聚合酶的錯(cuò)誤合成poly(A)將形成無(wú)功能的cRNA模板，而這種cRNA模板無(wú)法合成子代病毒的vRNA，從而導(dǎo)致病毒滴度降低。