郝麗英， 林愷豐， 鄭賽男， 魏 強(qiáng)

（1.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041；2.成都大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，成都 610106）

0 引言

近年來，納米醫(yī)藥在癌癥治療中取得了較大的進(jìn)展。納米藥物一般是由納米載體和藥物組成，藥物起治療作用，納米載體起靶向輸送或者治療的作用［1］。迄今為止，許多種類的納米載體由于其穩(wěn)定性，組分、大小、形狀、表面性質(zhì)的可控性，已備受科學(xué)家的關(guān)注和研究。但是，單獨(dú)的納米材料在某種程度上也有一定的限制，如水分散性和生物相容性差、負(fù)載效率和容量低、無法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等。為了滿足納米顆粒在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，研究者使用一些親水性聚合物，如聚乙烯二醇（PEG）［2］、殼聚糖［3］等修飾納米顆粒來增強(qiáng)它們的水分散性、生物相容性。因此，高負(fù)載量、生物相容性良好的納米載體的研究受到了研究者的密切關(guān)注。盡管已有很多納米材料作為藥物載體，但是都存在一些弊端：如聚合物［4］、基于石墨烯的材料［5］、磁性材料［6］、二氧化硅材料［7］、脂質(zhì)體［8］等，本身不能滿足成像要求而缺少實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的能力，而外接熒光分子必然會(huì)帶來負(fù)面作用；量子點(diǎn)的出現(xiàn)克服了上述的缺點(diǎn)，目前應(yīng)用最多的是重金屬量子點(diǎn)［9］（CdTe，SnS，ZnS等），但考慮到它們?cè)诖x時(shí)分解為單個(gè)的組成成分，重金屬富集在體內(nèi)，對(duì)機(jī)體造成了極大的危害，限制了后期的抗癌應(yīng)用。

作為類石墨烯的二維材料——石墨相氮化碳（g-C3N4）材料，由于其優(yōu)異的光敏性、光致發(fā)光性和光催化活性等優(yōu)點(diǎn)，已被應(yīng)用于催化化學(xué)發(fā)光傳感器［10］、光催化降解［11-12］、催化劑［13］等。然而，氮化碳本身具有較大的尺寸和差的水溶性，導(dǎo)致其比表面積低，影響負(fù)載效果，從而限制其作為載體和在抗癌領(lǐng)域中的應(yīng)用。

本文聚焦新型納米藥物的構(gòu)建，針對(duì)藥物載體尺寸大、水分散性差、示蹤性差的三大主要問題，重點(diǎn)開展藥物載體的改性和載藥和釋藥行為探索，以期尋求納米藥物構(gòu)建的最優(yōu)條件，獲得良好的納米藥物。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

試劑：鹽酸胍（CH6ClN3）、均苯三甲酸（C9H6O6）、濃硝酸（HNO3）、氫氧化鈉（NaOH）等均為分析純?cè)噭?，?gòu)自成都科龍?jiān)噭┕?；磷酸緩沖溶液（pH 7.40）購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；鹽酸阿霉素（DOX）購(gòu)自上海生物工程股份有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

儀器：管事馬弗爐、陶瓷方舟、高溫反應(yīng)釜、烘箱、超聲清洗機(jī)、細(xì)胞超聲粉碎機(jī)、離心機(jī)、pH計(jì)、分子熒光儀（RF-5301PC）、透析袋（3500 Da）。

1.2 三嗪結(jié)構(gòu)的g-C3N4制備與改性

三嗪結(jié)構(gòu)的g-C3N4依照熱縮聚法獲得［14］：鹽酸胍和均苯三甲酸以質(zhì)量比5∶1的比例置于陶瓷方舟中，然后放于管事馬弗爐的石英管中央，以5℃/min的速度加熱至350℃，并在空氣環(huán)境下反應(yīng)3.5 h，獲得蓬松的三嗪結(jié)構(gòu)的g-C3N4，記為tri-C3N4。改性分為三步：①將1 g tri-C3N4用80 mL濃硝酸在80℃下回流72 h，得到多孔tri-C3N4，離心洗滌至中性，烘干；②將100 mg的多孔tri-C3N4分散于30 mL蒸餾水并置于高溫反應(yīng)釜中，180℃下反應(yīng)8 h，制得tri-HC3N4納米載體；③使用細(xì)胞超聲粉碎機(jī)在1 kW下超聲30 min，然后5000 r/min離心10 min，取上清液備用。

1.3 tri-HC3N4-DOX納米藥物的構(gòu)建及條件探索

分別研究pH、作用時(shí)間和DOX濃度對(duì)tri-HC3N4納米載體負(fù)載DOX效率（E，%）及容量（Q，mg/g）的影響。取1 mL tri-HC3N4納米載體與1 mL DOX溶液混勻，反應(yīng)一段時(shí)間后，10000 r/mim離心10 min后用蒸餾水反復(fù)洗滌。優(yōu)化pH時(shí)，調(diào)節(jié)溶液的pH為2.0，4.0，7.4，9.0，11.0，反應(yīng)24 h；優(yōu)化時(shí)間時(shí)，選取最佳pH，在不同時(shí)間下反應(yīng)（10，20，30 min；2，5，10，24，36，48 h）；優(yōu)化DOX濃度時(shí)，時(shí)間和pH選取最佳，對(duì)不同濃度的DOX（5，10，25，50，100，150，200，300和400 mg/L）進(jìn)行負(fù)載，最后收集上清液使用分子熒光儀（485 nm激發(fā)）讀取吸光度，根據(jù)下式分別計(jì)算負(fù)載效率（E，%）和負(fù)載容量（Q，mg/g）。

式中：W0和W1（mg）分別代表初始DOX的質(zhì)量和離心后上清液剩余的累計(jì)DOX質(zhì)量；WM（mg）代表加入tri-HC3N4納米載體質(zhì)量。

最后，1 mL tri-HC3N4納米載體和1 mL DOX在最佳條件下混合，獲得基于氮化碳的納米藥物，記為tri-HC3N4-DOX。

1.4 tri-HC3N4-DOX納米藥物的表征

采用美國(guó)FEI公司的場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（FE-SEM，Inspect F）和日本島津公司的原子力顯微鏡（AFM，SPM-9700）對(duì)材料和納米藥物的微觀形貌進(jìn)行表征，所有材料和納米藥物在測(cè)試之前均需要在50℃的真空干燥箱中烘干15～30 min；采用美國(guó)Thermo公司的傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR，Nicolet IS10）對(duì)DOX負(fù)載前后官能團(tuán)的變化進(jìn)行表征，將待測(cè)催化劑與經(jīng)干燥后的KBr進(jìn)行壓片后測(cè)試，其中DOX與KBr的質(zhì)量比約為1∶100，壓力約為10 MPa。掃描范圍為500～4000 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.5 tri-HC3N4-DOX納米藥物中DOX的體外釋放

取4 mL tri-HC3N4-DOX納米藥物置于透析袋（3500 Da）中，分別浸泡于4 mL不同pH（7.4，6.8，5.0）的PBS溶液中，每隔一定時(shí)間，取出2 mL溶液待測(cè)，再添加2 mL新鮮PBS溶液，直至規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)。最后用熒光光度計(jì)測(cè)定每次取得上清液的吸光度。根據(jù)藥物累計(jì)釋放計(jì)算在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，tri-HC3N4-DOX納米藥物DOX的釋放效率，

式中：Cn（mg/mL）為第n次取出上清液的濃度；V0（mL）為釋放介質(zhì)的體積；V（mL）為每次取樣的體積；Wloaded（mg）為釋放前負(fù)載在材料上的DOX的量。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH值對(duì)tri-HC3N4納米載體負(fù)載DOX的影響

反應(yīng)環(huán)境的酸堿度對(duì)納米藥物的負(fù)載起關(guān)鍵作用，因此本文研究了不同pH下tri-HC3N4納米載體對(duì)DOX的負(fù)載效率及容量。如圖1所示，隨著溶液酸堿度逐漸從強(qiáng)酸pH=2.0增加到強(qiáng)堿pH=11，tri-HC3N4納米載體對(duì)DOX的負(fù)載效率呈先上升后下降的趨勢(shì)：在中性條件pH=7.4時(shí)達(dá)到最高，在強(qiáng)酸pH=2.0時(shí)最低，僅為10.47%。負(fù)載容量也表現(xiàn)出同樣的趨勢(shì)。產(chǎn)生上述結(jié)果的原因可能是：在強(qiáng)酸條件下tri-HC3N4納米載體極易被質(zhì)子化，與同為酸性的DOX·HCl強(qiáng)烈互斥，導(dǎo)致負(fù)載效率和容量降低；當(dāng)反應(yīng)環(huán)境為中性時(shí)，互斥作用減弱或消失，DOX更多更快地負(fù)載到tri-HC3N4納米載體表面；而在堿性環(huán)境下，DOX和體系中的OH-與tri-HC3N4納米載體產(chǎn)生了競(jìng)爭(zhēng)吸附，故而負(fù)載效率和容量再次降低，也間接表明tri-HC3N4納米載體對(duì)DOX的負(fù)載可能是由于兩者之間的靜電吸附作用。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇pH 7.4為最佳負(fù)載條件。

圖1 pH對(duì)tri-HC3N4納米載體負(fù)載DOX的影響

2.2 負(fù)載時(shí)間對(duì)tri-HC3N4納米載體負(fù)載DOX的影響

恰當(dāng)?shù)呢?fù)載時(shí)間可在節(jié)約時(shí)間的同時(shí)保證藥物的充分負(fù)載，從而提高經(jīng)濟(jì)效益。如圖2所示，前10 h內(nèi)tri-HC3N4納米載體對(duì)DOX的負(fù)載效率迅速增加，高達(dá)至92%，后基本平穩(wěn)，表明tri-HC3N4納米載體對(duì)DOX的負(fù)載迅速而高效。上述結(jié)果表明，10 h為最佳負(fù)載時(shí)間。

圖2 負(fù)載時(shí)間對(duì)tri-HC3N4納米載體負(fù)載DOX的影響

2.3 DOX初始濃度對(duì)tri-HC3N4納米載體負(fù)載DOX的影響及吸附等溫線

如圖3所示，tri-HC3N4納米載體對(duì)DOX的負(fù)載效率隨DOX濃度的增加而降低，而負(fù)載容量則隨之增加。在100 mg/L的濃度范圍內(nèi)，DOX的負(fù)載效率迅速增加至88.35%；當(dāng)DOX的濃度繼續(xù)增大時(shí)，過少的tri-HC3N4納米載體致使其對(duì)DOX的負(fù)載效率降低。以上現(xiàn)象可能是由于tri-HC3N4納米載體表面有限的活性位點(diǎn)不能容納過多的DOX，導(dǎo)致tri-HC3N4納米載體對(duì)DOX負(fù)載效率隨濃度的增大而降低。對(duì)吸附容量而言，當(dāng)DOX的濃度低時(shí)，tri-HC3N4納米載體有大量的活性位點(diǎn)未被占據(jù)，到站吸附容量較低，隨著DOX濃度的增大（低于300 mg/L），吸附容量也迅速增大；當(dāng)DOX的濃度繼續(xù)增大（高于300 mg/L）時(shí)，tri-HC3N4納米載體的活性位點(diǎn)幾乎被占據(jù)，吸附容量的增大迅速放緩，幾乎達(dá)到平衡。

圖3 DOX初始濃度對(duì)tri-HC3N4納米載體負(fù)載DOX的影響

本文還從吸附等溫線模型對(duì)負(fù)載行為進(jìn)行探討。常用的等溫線模型包括Langmuir和Freundlich兩種，Langmuir模型表示負(fù)載行為是均勻的單層吸附，各吸附位點(diǎn)有著相同的吸附能力，吸附物和被吸附物間無作用力，其方程式如下［15-16］：

Freundlich模型是一種經(jīng)驗(yàn)公式，表示吸附物和被吸附物之間的吸附過程是多層、不均勻的，其方程式［15-16］：

式中：qe（mg/g）和Ce（mg/L）分別代表DOX在平衡時(shí)的負(fù)載容量和濃度；KL（L/mg）是吸附自由能常數(shù)；qm（mg/g）是最大負(fù)載容量；KF（mg/g）和1/n都是Freundlich常數(shù)，分別代表吸附常數(shù)和吸附強(qiáng)度。tri-HC3N4納米載體對(duì)DOX負(fù)載行為的等溫線擬合圖（見圖4）顯示tri-HC3N4納米載體對(duì)DOX的負(fù)載行為符合上述兩種等溫線模型（R2=1.000），表明tri-HC3N4納米載體對(duì)DOX為單多層混合吸附，這可能是由于tri-HC3N4納米載體具有不均勻的片層結(jié)構(gòu)，使得DOX被負(fù)載于tri-HC3N4納米載體單層、多層的片層結(jié)構(gòu)里。另外，表1列出兩種等溫線的擬合方程及相關(guān)數(shù)據(jù)。根據(jù)Langmuir吸附等溫線的計(jì)算結(jié)果可知，tri-HC3N4納米載體對(duì)DOX的負(fù)載能力優(yōu)越，理論最大吸附容量高達(dá)2.306 g/g。tri-HC3N4納米載體對(duì)DOX良好的負(fù)載能力可能是由于改性后的tri-HC3N4納米載體帶有一定的負(fù)電荷和具有大的比表面積。

圖4 Langmuir和Freundlich兩種吸附等溫線模型

表1 tri-HC3N4納米載體負(fù)載DOX的吸附等溫線計(jì)算結(jié)果

2.4 tri-HC3N4-DOX納米藥物的表征

圖5顯示了純DOX的SEM圖，呈現(xiàn)出規(guī)整的四方體結(jié)構(gòu)，當(dāng)tri-HC3N4負(fù)載DOX后，明顯看出DOX鋪灑在tri-HC3N4納米載體表層，可能是通過物理吸附或是靜電作用吸附在tri-HC3N4納米載體表面。

圖5 DOX（a）和tri-HC3N4-DOX（b）的SEM圖

AFM不僅可以觀察微觀形貌，而且也可以進(jìn)行厚度分析。如圖6（a）所示，tri-HC3N4納米載體呈現(xiàn)粒徑約為50 nm，厚度約為30 nm的片層結(jié)構(gòu)；DOX呈現(xiàn)大小100 nm左右，厚度90 nm左右的規(guī)整結(jié)構(gòu)（圖6（b））；當(dāng)兩者負(fù)載后，顆粒大小較前兩者均有所增大，在130 nm左右，厚度也明顯增加，大約在110 nm（圖6（c）），結(jié)果直觀顯示了負(fù)載后的納米藥物粒徑增大，厚度增加，表明了tri-HC3N4-DOX的成功制備。

圖6 tri-HC3N4納米載體（a），DOX（b）和tri-HC3N4-DOX納米藥物（c）的AFM圖和高度值

FTIR對(duì)DOX負(fù)載前后的官能團(tuán)變化進(jìn)行表征。如圖7所示，tri-HC3N4納米載體負(fù)載DOX后，在1265 cm-1處出現(xiàn)了一個(gè)新峰，表示苯環(huán)外圈的N-H鍵的伸縮振動(dòng)峰，與純DOX中1263 cm-1處的特征峰基本一致［17］，表明tri-HC3N4納米載體成功負(fù)載DOX。

圖7 DOX負(fù)載前后的FTIR圖

2.5 tri-HC3N4-DOX納米藥物中DOX的體外釋放

探究了tri-HC3N4-DOX納米藥物在不同pH環(huán)境中的釋放情況（正常生理?xiàng)l件pH=7.4，癌細(xì)胞微環(huán)境pH=6.8，癌細(xì)胞胞內(nèi)環(huán)境pH=5.0）。如圖8所示，tri-HC3N4-DOX納米藥物呈現(xiàn)pH依賴性釋放，具有一定的持續(xù)性，表明tri-HC3N4-DOX納米藥物具有一定的緩釋作用。在酸性條件下，尤其是pH=5.0時(shí)具有最高的釋放效率，高達(dá)60.23%；在pH=6.8時(shí)，釋放效率為49.96%；而在正常生理?xiàng)l件pH=7.4時(shí)，120 h的釋放效率僅為32.12%，表明tri-HC3N4作為載體負(fù)載藥物后，可以減少藥物在傳輸過程中的浪費(fèi)，降低對(duì)正常機(jī)體帶來的負(fù)面效應(yīng)，使得更多的tri-HC3N4-DOX進(jìn)入癌細(xì)胞中，進(jìn)而達(dá)到增強(qiáng)治療癌癥的效果。綜上所述，tri-HC3N4-DOX納米藥物是一種具有pH響應(yīng)釋放的納米藥物，且tri-HC3N4-DOX納米藥物在pH=5.0下釋放效率更高，在正常生理?xiàng)l件（pH=7.4）下釋放最低，從而使得tri-HC3N4-DOX納米藥物進(jìn)入體內(nèi)后，在血液中更好的循環(huán)而釋放出較少的DOX，降低對(duì)正常機(jī)體的毒性；當(dāng)被內(nèi)吞入癌細(xì)胞時(shí)，在癌細(xì)胞內(nèi)環(huán)境（pH=5.0）下有效地釋放出更多DOX，從而集中發(fā)揮藥效，增強(qiáng)癌癥的治療效果。

圖8 tri-HC3N4-DOX納米藥物在不同pH值下DOX的釋放曲線

3 結(jié)語(yǔ)

本文聚焦納米藥物的構(gòu)建，針對(duì)納米載體出現(xiàn)的粒徑大、負(fù)載低、示蹤差的缺點(diǎn)，綜合考慮載體的制備、性能等方面，選擇具有優(yōu)異性能的三嗪結(jié)構(gòu)的石墨相氮化碳（g-C3N4）材料，通過濃硝酸回流和水熱法開展對(duì)氮化碳材料的改性，探討改性后的氮化碳的載藥行為和釋放情況，并采用多種表征手段驗(yàn)證納米藥物，以期成功構(gòu)建基于氮化碳的納米藥物（tri-HC3N4-DOX）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，tri-HC3N4納米載體對(duì)DOX具有高的負(fù)載效率和負(fù)載容量，最大負(fù)載容量高達(dá)2.306 g/g，是一種優(yōu)良的納米載體；獲得的tri-HC3N4-DOX納米藥物又具有藥物釋放可控的優(yōu)點(diǎn)，在腫瘤微環(huán)境下釋放效率最高，有效降低對(duì)正常機(jī)體的副作用，為后期的癌癥治療和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)奠定研究基礎(chǔ)。