賈旭爽，陳宇楊，鮑慧瑋，張亞杰

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)·吉林 長(zhǎng)春·130117)

黃芪-甘草藥對(duì)始載于《太平惠民和劑局方·卷五治諸虛》，由黃芪-甘草兩味藥組成[1]。黃芪和甘草相須為用，可以作為黃芪甘草湯單獨(dú)應(yīng)用，也可以應(yīng)用于復(fù)方之中，用于治療消化系統(tǒng)疾病、糖尿病等。本課題以甘草、黃芪為研究對(duì)象，采用Cocktail探針?lè)?，以探針?biāo)幬锏拇x消除百分率為指指標(biāo)，考查甘草、黃芪藥對(duì)及單藥對(duì)對(duì)5種肝藥酶（CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP2C9）活性的影響，以此為甘草、黃芪藥對(duì)的臨床合理聯(lián)合用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品與試劑

甘草與黃芪兩種飲片均購(gòu)自吉林省宏檢大藥房有限公司；茶堿原料藥（批號(hào)20190417)、雙氯芬酸鈉原料藥（批號(hào)F20180226)、奧美拉唑原料藥（批號(hào)J1805A，)、右美沙芬原料藥（批號(hào)F180606),氯唑沙宗原料藥（批號(hào)20190120)、普萘洛爾原料藥（批號(hào)J1115A)、還原型輔酶II均購(gòu)自上海源葉生物有限公司，原料藥純度大于等于98%；BCA蛋白試劑盒(批號(hào):03415，上海天根生化科技)。

1.2 儀器設(shè)備

臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(上海飛鴿儀器廠);LC-l0A型高效液相色譜儀、UV檢測(cè)器、N-2000工作站(日本島津公司);酶標(biāo)儀(伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供雄性Wistar大鼠，180～220g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(吉)2020-0002。大鼠喂飼標(biāo)準(zhǔn)飼料和水，飼養(yǎng)于長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心、12h日夜節(jié)律。

2 方法

2.1 藥物的制備與配制

2.1.1 供試品的制備

按《醫(yī)林改錯(cuò)》中載黃芪和甘草的規(guī)定的劑量黃芪10g、甘草2.5g進(jìn)行換算，取甘草、黃芪，浸泡1小時(shí)，8倍水文火煎煮30min，過(guò)濾后濾渣6倍水再煎煮30min，兩次濾液經(jīng)70℃濃縮，最終得黃芪-甘草組濃度為0.14g/mL生藥。甘草、黃芪單煎液的濃度為0.14g/mL生藥、0.028g/mL生藥。

2.1.2 探針底物及內(nèi)標(biāo)溶液的配制

稱取適量茶堿、雙氯芬酸鈉、奧美拉唑、右美沙芬和氯唑沙宗5中探針底物，加入甲醇溶液中搖勻備用,最終溶液中含有茶堿(10μmol/L)、雙氯芬酸鈉（25μmol/L）、奧美拉唑（25μmol/L）、右美沙芬（5μmol/L）、氯唑沙宗(50 μmol/L)[2]。

稱取適量?jī)?nèi)標(biāo)物普萘洛爾加入甲醇∶乙腈（1∶1）的混合溶液中，終濃度為100 μg/mL。

2.2 肝微粒體制備

2.2.1 取肝組織

處死后的大鼠在冰浴的托盤中剖開腹部，暴露肝臟，結(jié)扎肝門靜脈，同時(shí)剪斷下腔靜脈，中肝動(dòng)脈插硅膠管并灌注冰生理鹽水進(jìn)行沖洗，去除肝臟中殘留的血液，反復(fù)沖洗到肝臟表面呈土黃色。

2.2.2 制備線粒體上清液

在冰浴的環(huán)境下，取一塊土黃色的肝臟，用剪刀剪碎，加入4倍肝重的0.25 mol/L的冰蔗糖溶液，倒入玻璃勻漿管中，手動(dòng)研磨至勻漿狀，使微粒體均勻分散。研磨后的組織勻漿液放入冷凍離心機(jī)，9000 g離心15 min，用移液器取上清液備用，丟棄下層組織;將上清液再放入冷凍離心機(jī)，12500 g離心20 min，再用移液器取上清液備用，丟棄下層組織，所得上清液即為去線粒體上清液。

2.2.3 制備肝微粒體混懸液

88 mmol/L的CaCL2溶液0.1 mL中需加入1 mL上清液，按這個(gè)比例在上清液中加入CaCL2溶液(CaCL2的終濃度為8 mmol/L),充分混合，放在冰浴的環(huán)境中5 min，在冰浴適當(dāng)進(jìn)行振搖，最后放入冷凍離心機(jī)，27 000 g離心15 min，輕輕取出上清液，離心管中的沉淀就是肝微粒體。

2.3 肝微粒體蛋白含量測(cè)定

按試劑盒的說(shuō)明完成樣本蛋白含量測(cè)定。

2.4 肝微粒體孵育

用移液器在EP管中加入5種探針的混合液20μL，自然揮干后，EP管中加入肝微粒體，37℃恒溫水浴，預(yù)孵育5min后，用移液槍加入NADPH啟動(dòng)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)。EP管中孵育體系總體積為200μL，其中肝微粒體總蛋白濃度為0.5mg/mL、NADPH終濃度為1mmol/L,CYP特異性探針?biāo)幬锏慕K濃度依次為茶堿(10μmol/L)、雙氯芬酸鈉（25μmol/L）、奧美拉唑（25μmol/L）、右美沙芬（5μmol/L）、氯唑沙宗(50 μmol/L)，體積不足用K2HP04/KH2P04緩沖液(0.05mol/L,pH=7.4)補(bǔ)充。

孵育反應(yīng)30min時(shí)移液槍注入冰冷的甲醇∶乙腈（1∶1）的混合溶液200 μL，其中含有內(nèi)標(biāo)鹽酸普奈洛爾(100 μg/mL)，終止肝藥酶對(duì)底物的代謝作用，孵育溶液渦旋混勻后，13000g,4℃冷凍離心機(jī)離心10 min，取上清液冷藏備用。按照預(yù)先測(cè)定的HPLC條件，取上清液測(cè)反應(yīng)后各探針?biāo)幬锏氖Ｓ嗔?，并按下式?jì)算各探針底物的代謝消除百分率。

2.5 色譜條件

2.5.1 5種探針底物的HPLC條件

色譜柱Agilent TC-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～8 min，10% A；8～10 min，10%→25% A；10～24 min，25%A；24～34 min，25%→70% A；34～37 min，70%→100%A；37～40 min，100% A）[3]；流速1.0 mL/min；柱溫35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。結(jié)果顯示5種探針?biāo)幬锱c內(nèi)標(biāo)物峰形良好，分離完全，無(wú)雜質(zhì)峰干擾，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)對(duì)其他待測(cè)峰無(wú)干擾，專屬性強(qiáng)[4]，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1: 大鼠肝微粒體中5種探針?biāo)幬锛捌浯x產(chǎn)物的的HPLC色譜圖（A:5種混合探針底物及內(nèi)標(biāo)物對(duì)照品溶液；B:5種混合探針底物對(duì)照品溶液；1.茶堿；2.奧美拉唑；3.普萘洛爾；4.右美沙芬；5.氯唑沙宗；6.雙氯芬酸鈉）

2.5.2 線性關(guān)系考察

精密量取各濃度的探針底物溶液于EP管中，氮吹，每個(gè)濃度設(shè)3份，建立工作曲線[5]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以各探針底物和內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值（y）對(duì)各探針底物的濃度（x）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程[6]。

2.5.3 精密度與準(zhǔn)確度

選擇相同濃度，用空白組大鼠肝藥酶配制質(zhì)量控制樣品，制備6份樣品[5]，按照樣品處理方法處理分析，分別計(jì)算各探針底物的精密度和準(zhǔn)確度。

2.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 甘草-黃芪及單藥體內(nèi)誘導(dǎo)對(duì)大鼠肝微粒體CYP450酶活性的影響

各給藥組對(duì)茶堿、奧美拉唑、右美沙芬、氯唑沙宗、雙氯芬酸鈉5種探針底物的代謝消除百分率測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

與空白對(duì)照組比，甘草、甘草-黃芪可使茶堿代謝百分率增加(P＜0.0 5），甘草、甘草-黃芪對(duì)CYP1A2酶活性具有誘導(dǎo)作用；甘草-黃芪組可使氯唑沙宗代謝百分率增加(P＜0.0 5），對(duì)肝微粒體CYP2E1酶活性具有誘導(dǎo)作用；甘草、甘草-黃芪可使雙氯芬酸鈉代謝百分率具有顯著降低(P＜0.01），因此對(duì)甘草、黃芪、甘草-黃芪對(duì)CYP2C9酶活性具有抑制作用。

表1 甘草-黃芪及單藥對(duì)5種底物的消除百分率（%）（±s，n=5）Table 1 Licorice,astragalus membranaceus and single medicine eliminating percentage of 5 kinds of substrates（%）(±s、n=5)

表1 甘草-黃芪及單藥對(duì)5種底物的消除百分率（%）（±s，n=5）Table 1 Licorice,astragalus membranaceus and single medicine eliminating percentage of 5 kinds of substrates（%）(±s、n=5)

注：與空白對(duì)照組比*P＜0.05,**P＜0.01

組別 茶堿 奧美拉唑 右美沙芬 氯唑沙宗 雙氯芬酸鈉空白對(duì)照組 16.46±1.56 8.33±1.10 51.80±7.25 27.01±1.69 18.09±1.39甘草組 19.27±0.86* 9.15±1.95 53.99±10.07 29.00±6.35 6.61±1.16**黃芪組 17.53±1.69 10.7±1.21 49.21±3.48 28.77±9.83 8.13±1.83**甘草-黃芪組 20.42±1.59* 8.11±0.74 45.61±7.24 30.27±8.65* 6.80±1.16**

4 討論

藥對(duì)指兩味藥的配伍使用，具有藥味精簡(jiǎn)、結(jié)構(gòu)固定、臨床實(shí)用的特點(diǎn)，是方劑的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，又是方與方之間的銜接。藥對(duì)的運(yùn)用在方劑中得以體現(xiàn)，藥對(duì)又促成了方劑的化裁、革新[8]。甘草和黃芪藥對(duì)是臨床常用藥對(duì)，既可以單獨(dú)成方“黃芪甘草湯”，也可以和其他藥物配成復(fù)方，不同藥物配伍使用的過(guò)程中會(huì)發(fā)生相互作用，其中一種可能是對(duì)肝藥酶產(chǎn)生誘導(dǎo)或抑制作用，從而使藥物的療效和損害作用產(chǎn)生影響，研究藥物對(duì)肝藥酶的影響可以為臨床高效低毒用藥提供參考。

本研究從對(duì)肝藥酶活性的層面來(lái)闡述甘草、黃芪配伍對(duì)CYP450酶的影響。結(jié)果顯示，甘草、黃芪、甘草-黃芪組對(duì)CYP2C19酶活性沒(méi)有影響；甘草、黃芪、甘草-黃芪組對(duì)CYP2D6酶活性沒(méi)影響；甘草、甘草-黃芪對(duì)對(duì)CYP1A2酶具有誘導(dǎo)作用；甘草-黃芪對(duì)CYP2E1酶具有誘導(dǎo)作用，甘草、黃芪、甘草-黃芪對(duì)CYP2C9酶具有抑制作用，因此，甘草-黃芪能誘導(dǎo)CYP1A2和CYP2E1酶，抑制CYP2C9酶。

CYP1A2約占肝臟總氧化酶含量的13%，在藥物代謝、前致癌物代謝及活化的過(guò)程中起著重要的作用，并參與咖啡因、茶堿、丙咪嗪、三環(huán)類抗抑郁藥、氯氮平、褪黑素、普萘洛爾、激素和類固醇等藥物的代謝[9]，甘草、甘草-黃芪與這些藥物合用要減少用藥劑量；CYP2E1參與多種一前毒物和前致癌物等化合物的代謝，促其生成毒性代謝物，如乙醇、酮、鹵族溶劑、二烷基亞硝胺等[10]，甘草-黃芪和這些物質(zhì)合用時(shí)主要?jiǎng)┝亢褪褂脮r(shí)間；CYP2C9參與甲苯磺丁脲、華法林、苯妥英鈉、非甾體類抗炎藥如喜康、羅芬等、吩噻嗪類、磺胺類抗菌藥磺胺甲基異惡唑、鎮(zhèn)靜催眠藥烯苯巴比妥、抗精神病藥四氫大麻酚、抗腫瘤藥環(huán)磷酰胺、性激素孕酮、睪丸酮等[10]，甘草、黃芪、甘草-黃芪與這些藥物合用時(shí)注意觀察不良反應(yīng)。