劉曉慶，魏凌峰，賈繼來，周嬌嬌，程水源，蔡 杰,

（1.武漢輕工大學硒科學與工程現代產業(yè)學院/國家富硒農產品加工技術研發(fā)專業(yè)中心，湖北武漢 430023；2.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北武漢 430023）

硒（Se，Selenium）最早于1817年由瑞典化學家Jons Jacob Berzelius在硫酸廠鉛室壁上的紅色沉積物中制得，并選用希臘神話中月亮女神之名將其命名為“硒”。之后的幾十年里研究者們發(fā)現硒是維持機體重要功能所必需的微量元素之一，是體內多種含硒酶的重要組成成分，具有重要的生物活性。同時，硒元素還有“抗癌之王”的稱號，對多種癌細胞具有抑制作用。人攝取硒的主要來源是食物，土壤硒含量是決定食物硒含量的一個重要因素，而自然界中的硒以多種價態(tài)的化合物形式存在，在堿性土壤中，以硒酸鹽為存在形式的六價態(tài)硒容易被植物吸收，亞硒酸鹽等四價態(tài)硒一般需要被氧化為六價態(tài)的硒酸鹽后才能被吸收利用，而零價態(tài)的硒單質由于其水溶性差而難以被利用。無論是哪一種價態(tài)的硒源，有效劑量和毒性劑量之間的極窄范圍極大限制了它的實際應用。納米技術的出現改變了硒元素開發(fā)的窘境，具有納米尺寸的單質硒顯示出更大的細胞攝取量和活性，為人們開發(fā)硒元素提供了新思路。

納米硒（Selenium nanoparticles，SeNPs）是一種紅色單質硒，可利用亞硒酸鈉與抗壞血酸通過氧化還原反應制得。納米硒表面能量高，在沒有穩(wěn)定劑對其進行分散的情況下，裸露的納米硒不穩(wěn)定，易聚集，導致其粒徑增大至微米級，從而致使其生物利用度下降。當穩(wěn)定劑存在時，納米硒的生成會受到穩(wěn)定劑的調控，其粒徑穩(wěn)定在納米級別，用于穩(wěn)定納米硒的分散劑一般為生物大分子，無機材料作為分散劑也有報道。經分散劑調控后的納米硒粒徑更小且生物活性更高，因此，選用綠色、環(huán)境友好型方法制備納米硒成為目前硒科學研究的重點之一。為了提高納米硒的生物活性以及生物利用率，學者們先后篩選出了蛋白質、多酚、多肽和多糖等模板穩(wěn)定來納米硒。但蛋白質、多酚、多肽等物質具有易降解、易聚集及熱不穩(wěn)定等特性，限制了其在納米硒制備中的應用。相比于其他物質，多糖類物質在納米硒的制備中較為穩(wěn)定，且結構上有很多活性羥基，生物相容性高，可降解，因此多糖更適于作為納米硒的穩(wěn)定劑。同時，多糖類物質還具有抗炎、抗病毒以及抗癌等功效，有文獻報道了多糖和納米硒之間具有強大的協同效應，基于此，多糖類物質一直以來是首選的模板物質，有著其他分散劑不可比擬的優(yōu)勢。此外，針對腫瘤細胞新陳代謝旺盛、生長速度快、葡萄糖特異性受體高表達等特點，以多糖作為配體修飾的納米粒子具有腫瘤細胞主動靶向性作用，這也為納米硒主動靶向癌細胞提供了一種可行的途徑，進一步拓寬了納米硒在抑制腫瘤方面的應用。

本文闡述了近幾年來多糖載體構建納米硒的相關研究內容，從多糖與納米硒的結合作用、多糖種類對納米硒體系特性的影響以及不同反應條件對多糖-納米硒結合的影響等三個角度論述了多糖-納米硒的構建機理，總結了納米硒以及多糖-納米硒的抗腫瘤機制，并對其后期抗腫瘤的相關應用做出展望，旨在為后續(xù)研究提供理論基礎。

1 多糖載體構建納米硒的研究

納米硒可以通過物理、化學以及生物方法合成。其中，化學還原法是制備納米硒最常見的方法。應用納米技術制備的納米硒體系大部分為分散于水或高分子物質的紅色透明膠體溶液，主要以“元素硒-分散劑”形成表面覆蓋（分散劑覆蓋在納米硒表面）或相互嵌套的形式存在。利用化學法制備納米硒時，常常采用硒酸鹽、亞硒酸鹽、二氧化硒等含硒的氧酸鹽或者氧化物作為硒源，并引入穩(wěn)定劑或分散劑控制粒徑，還原劑則主要是抗壞血酸、谷胱甘肽、亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉等具有還原性的物質。下面筆者將從多糖類物質穩(wěn)定納米硒的機理、不同合成條件對多糖-納米硒體系的影響等方面介紹多糖載體構建納米硒的機制。

1.1 多糖與納米硒結合機理

天然多糖以及改性多糖含有-OH、-COOH、-NH、-C=O等官能團，這些官能團能與納米硒結合，沿聚合物鏈形成分子間和分子內氫鍵，從而增強納米硒的穩(wěn)定性（圖1）。Xiao 等研究發(fā)現冬蟲夏草胞外多糖的-OH基團與納米硒之間形成了新的C-OSe鍵，使納米硒具有良好的分散性和穩(wěn)定性。穆靜靜等研究發(fā)現不同品種的茶葉中提取的粗多糖都能起到穩(wěn)定納米硒的作用，主要通過-OH、C=O、NH等基團與納米硒結合。此外，對于殼寡糖-納米硒體系，SeO可以通過靜電相互作用與殼寡糖分子中的-NH結合，由于空間位阻或引力作用使納米硒粒子穩(wěn)定分散在溶液中。有學者研究發(fā)現，多糖與納米硒之間還可以通過其他方式連接。Cai等比較了犀牛木素多糖-納米硒（LRP-SeNPs）和純犀牛木素多糖（LRP）的FT-IR紅外光譜圖之間的相似性以及硒的形態(tài)和分布，發(fā)現相對于純LRP，C-O-H帶對應的峰強度略有變化，但并未明顯向更高或更低的波數移動。這一結果表明，LRP-SeNPs中硒和-OH之間的相互作用較弱，多糖分子可能通過簡單的物理吸附與納米硒結合，進一步擴大了多糖類模板穩(wěn)定納米硒的應用。基于多糖與納米硒之間多樣化的連接方式，多糖類物質是一種優(yōu)良的模板。

圖1 多糖-納米硒的形成、分散和穩(wěn)定示意圖[22]Fig.1 Schematic diagram of formation, dispersion and stabilization of polysaccharide-nano-selenium[22]

1.2 不同多糖對多糖共軛納米硒體系性質的影響

多糖的結構和性質是影響多糖共軛納米硒體系的關鍵因素，同時也決定了納米硒的理化性質。王紅艷以葡聚糖、殼寡糖、殼聚糖、阿拉伯膠、羧甲基纖維素鈉等多糖分子作為軟模板，在不同合成條件下制備了形態(tài)多樣的納米硒，結果表明不同結構的多糖分子均可穩(wěn)定分散納米硒，且在多糖分子模板的引導作用下可以制備不同形貌的納米硒。阿拉伯膠分子結構為支鏈型，制備的納米硒形貌為球形；羧甲基纖維素鈉分子結構為線型，引導硒納米粒子在一定方向上生長；葡聚糖屬于非離子型多羥基大分子，通過氫鍵與硒納米粒子結合，最終獲得蝌蚪形態(tài)的納米硒粒子；殼寡糖和殼聚糖結構分子中的羥基和氨基都可與Se結合，能夠引導納米硒粒子沿著聚合物鏈生長，最終得到棒狀的納米硒復合物。Bai等研究了不同糖類（葡萄糖、蔗糖、殼聚糖）對納米硒的修飾作用，研究發(fā)現在沒有模板的納米硒溶液中，硒納米顆粒的形態(tài)為橢圓形和球形，尺寸在100～500 nm；在硒-葡萄糖溶膠中，納米硒的形態(tài)為橢圓形和球形，尺寸在50～350 nm；在硒-1%蔗糖溶膠中，硒納米顆粒的形態(tài)為樹枝狀和球形，其尺寸分別在20～100 nm和10～20 nm；在硒-1%殼聚糖溶膠中，納米硒顆粒的形貌為橢圓形和棒狀，尺寸在10～20 nm范圍內。證明了不同糖類的分子結構對納米硒的組裝具有調節(jié)和修飾作用，且隨著糖類分子量的增加，納米硒-多糖溶液的氫鍵作用也隨之增強，從而增強了對納米硒顆粒形貌的調節(jié)作用。

1.3 反應條件對多糖共軛納米硒體系的性質的影響

納米硒的合成條件會影響其形貌和尺寸。多糖類模板被確定后，硒源和模板的比例、還原劑和硒源的比例、反應時間、反應溫度、是否超聲輔助制備都能影響納米硒的形貌和粒徑。表1總結了不同種類多糖和不同反應條件對多糖-納米硒的形貌和粒徑的影響。

表1 不同反應條件下的多糖-納米硒體系Table 1 Polysaccharide-nano-selenium system under different reaction conditions

Qiu 等以果膠（Pectin，PEC）為穩(wěn)定劑和分散劑制備納米硒體系，探討了硒源和模板的不同比例對納米硒制備的影響，研究發(fā)現較小尺寸和較高硒含量的PEC-SeNPs具有較高的抗氧化活性。當Se/PEC比率從1:40增加到1:2時，PEC-SeNPs的粒徑從358.3 nm逐漸減小到242.5 nm；當Se/PEC比率從1:2變?yōu)?4:3時，PEC-SeNPs的粒徑從 242.5 nm逐漸增大到330.3 nm。Cai等研究了四種不同質量比（Se/LRP=1/20、1/15、1/10和 1/5）對犀牛多糖-納米硒（LRP-SeNPs）粒徑的影響，研究發(fā)現當Se/LRP比值從0增加到1/10時，LRP-SeNPs粒徑逐漸減?。◤?670±20 nm 到 345±10 nm），當 Se/LRP比進一步增加到1/5，粒徑反而增大（從345±10 nm到430±40 nm）。這是因為多糖濃度過低時，體系中沒有足夠的模板分散納米硒，被還原的納米硒會團聚形成沉淀；隨著多糖比例的逐漸增加，多糖上的羥基可以與納米硒結合，從而阻礙納米硒粒子的生長和聚集，達到分散和控制其粒徑的效果；但是當多糖濃度進一步增大時，多糖分子之間會相互聚集，活性羥基數量減少，多糖對納米硒的吸附作用減弱，復合物粒徑增大且達不到分散效果。

在以抗壞血酸作為還原劑的體系中大多數抗壞血酸和硒源的摩爾比在1:1～5:1范圍內，理論上抗壞血酸和HSeO（硒源）以2:1的計量關系發(fā)生氧化還原反應，過量的抗壞血酸能提供還原性的介質，穩(wěn)定納米硒。鄭曉鳳等以桔梗多糖為模板制備了納米硒，結果表明，在一定范圍內，隨著抗壞血酸和NaSeO比值的增加，納米硒的穩(wěn)定性逐漸提高，當兩者的比值為2:1時，紫外吸光度比值達到最大并趨于穩(wěn)定，說明該比值下桔梗多糖-納米硒復合物的粒徑較小且分散性較好。

反應時間和溫度也會影響納米硒的粒徑大小。王紅艷研究發(fā)現在一定范圍內，隨著反應時間的增加，吸光度增大。在4 h之后，吸光度最大且趨于平穩(wěn)，說明此時形成的納米硒溶液均勻且穩(wěn)定。陳琬雯利用殼聚糖作為穩(wěn)定劑合成納米硒，發(fā)現當反應溫度由 90 ℃增加到 120 ℃時，粒徑由 118 nm增加至170 nm，反應溫度升高至150 ℃時，合成的納米硒粒徑峰增加到219 nm。說明納米硒的平均粒徑與反應溫度可能存在正相關性，但其抗氧化活性隨著粒徑的增大而降低。通常，多糖-納米硒的合成在相對較低的溫度（25 ℃或37 ℃）下進行。此外，超聲處理可減小多糖的尺寸并增加比表面積，提供足夠的活性位點，從而提高納米硒穩(wěn)定性和生物活性?？筛鶕煌男枨筮x擇合適的多糖以及合成條件構建兼有納米硒和多糖的生理功效的復合物，在防病治病和營養(yǎng)保健等方面將有廣闊的應用前景。在特殊實驗條件下可以制備球形、螺旋管狀、棒狀、網狀等不同形貌的納米硒，可作為特殊材料在半導體、光電材料等領域發(fā)揮重要的應用價值。

2 多糖載體構建納米硒在抗腫瘤中的研究

癌癥是除心臟病及感染性疾病以外死亡率最高的疾病，每年因癌癥死亡的人數占所有疾病致死人數的四分之一，對公眾健康構成巨大威脅?；熓前┌Y的主要治療方法之一，雖然有效，但它受到抗腫瘤藥物的副作用和癌細胞產生的耐藥性限制。為了進一步治療癌癥，仍然需要新型高效低毒藥物。迄今為止，已有大量關于硒化物抗腫瘤的報道，硒補充劑被認為是潛在的癌癥預防劑。納米硒具有比其他硒化合物更高的抗癌功效。筆者根據現有文獻，對納米硒抗腫瘤機制以及應用現狀進行了總結，希望能對后續(xù)研究方向提供新思路。

2.1 多糖載體構建納米硒抗腫瘤機理

多糖和納米硒組合展現出很高的抗腫瘤活性，硒元素通常在抗腫瘤中發(fā)揮主要作用。納米硒的抗癌機制主要包括誘導細胞凋亡和細胞周期停滯，增強免疫力等以顯示其抗腫瘤活性?，F有研究表明納米硒的抗腫瘤作用主要通過提高癌細胞胞內活性氧（Reactive oxygen species，ROS）水平，導致線粒體膜電位下降，進而使線粒體損傷誘導癌細胞凋亡。多糖-納米硒結合物通過癌細胞的內吞作用進入胞內，然后觸發(fā)凋亡信號通路誘導細胞凋亡，圖2為多糖修飾的納米硒誘導腫瘤細胞凋亡的可能機制。楊聰聰通過流式細胞術、免疫熒光實驗與Western blot實驗表明黃芪多糖-納米硒（AP-SeNPs）可以通過激活線粒體介導的內源性通路誘導乳腺癌細胞凋亡，同時還可以誘導細胞的不完全自噬，增強APSeNPs對乳腺癌細胞的抑制作用。竹蓀多糖-納米硒復合物（DP1-SeNPs）能夠很好的抑制人體多種腫瘤細胞的增殖，其抗增殖活性與細胞核濃縮、染色體團聚、DNA斷裂和S期細胞阻滯等典型的細胞凋亡現象有關。DP1-SeNPs誘導腫瘤細胞凋亡的機制是促進死亡結構域蛋白的表達，激活Caspase-3、-8和-9，促進ROS過度產生，導致線粒體功能障礙。此工作的結論與本課題組前期對多糖-納米硒抗腫瘤機理相關研究一致，葡聚糖-納米硒（Glucan-SeNPs）和葡聚糖-迷迭香酸-葡聚糖（Glucan-RA-SeNPs）均通過激活Caspase-3和Caspase-9誘導HepG2細胞凋亡，且Glucan-RA-SeNPs有著更強的誘導能力，這項工作為改善基于多糖載體穩(wěn)定納米硒的結構提出了可行的策略。除了直接誘導腫瘤細胞凋亡外，硒和多糖的組合可以增強免疫力以顯示抗腫瘤活性。Mao等發(fā)現灰樹花多糖和納米硒的結合物（Se-GP11）在體外對HepG-2細胞無毒性作用，但在體內可顯著抑制HepG2腫瘤的生長。它增加了相對胸腺和脾臟指數、血清腫瘤壞死因子和白細胞介素2水平。此外，與對照組相比，Se-GP11促進了RAW264.7的吞噬作用和一氧化氮的產生。結果表明，Se-GP11可能通過提高荷瘤小鼠的免疫功能而顯示其抗腫瘤活性。這些結果表明，多糖-納米硒可能是作為人類癌癥化學預防劑的候選物，使用多糖作為表面裝飾劑的策略可能是提高納米材料細胞吸收和抗癌功效的高效方法。

圖2 多糖修飾的納米硒誘導腫瘤細胞凋亡的信號通路Fig.2 Signal pathway of polysaccharide-modified nano-selenium inducing tumor cell apoptosis

2.2 多糖載體構建納米硒在抗腫瘤中的應用

基于多糖的硒納米粒子由于其優(yōu)異的理化性能和生物活性，在食品、醫(yī)藥、和農業(yè)等眾多領域得到了廣泛的應用。多糖-納米硒在醫(yī)藥方面的應用主要體現在靶向給藥和協同抗腫瘤藥物的抑制腫瘤細胞方面。

2.2.1 多糖-納米硒復合物靶向抗腫瘤 近年來，一些活性多糖被用來制作癌癥輔助治療劑，以期改善治療效果。納米材料具有尺寸效應和表面效應并且對癌細胞和正常細胞具有較強的選擇性，這種高選擇性主要通過實體瘤的高通透和滯留效應（Enhanced permeability and retention effect，EPR）來實現的。Ping等利用具有高抗腫瘤活性的高度支化的-（1→3）-D-葡聚糖（AF1）為模板，通過 Se-O 鍵將平均粒徑為46 nm的球形硒納米粒子包埋在AF1中空納米纖維的空腔中，形成了高度穩(wěn)定和分散性良好的硒納米粒子。體外和體內試驗結果表明，AF1-Se納米復合材料顯著增強了癌細胞對硒納米粒子的攝取，增強了納米硒對癌細胞的殺傷能力，且對正常細胞的損傷較小。隨著Se含量的增加，AF1-Se對MCF-7細胞的抑制率從25%增加到75%，遠高于單獨使用AF1處理時的抑制率。Jiang等采用龍須菜多糖修飾納米硒（GLP-SeNPs），發(fā)現其在正常細胞和癌細胞之間表現出高度的選擇性。GLP對膠質母細胞瘤的細胞毒性顯著增強。因為GLP可以識別并結合U87細胞膜中過度表達的整合素受體，GLP-SeNPs對U87細胞的生物選擇性高于C6細胞。內化GLPSeNPs通過激活p53和MAPK的細胞信號通路，觸發(fā)細胞內ROS下調，從而加速細胞凋亡。由GLP修飾的SeNPS的腫瘤靶向性設計可能為有效的抗母細胞瘤藥物遞送提供可行的解決方案。

然而上述靶向多為被動靶向，在靶向腫瘤細胞的同時還可能有少部分進入到正常組織，從而對正常組織造成一定的損傷。因此為進一步提高納米硒的靶向性，通過高分子聚合物以及生物大分子等對納米材料表面修飾?；谂潴w受體識別系統，通過表面修飾配體、多糖等聚合物等提高納米硒的靶向性，使其以主動靶向的方式進入癌細胞，納米硒對癌細胞具有較高的選擇性，可以優(yōu)先在癌細胞中聚集并發(fā)揮抗腫瘤作用，進而增強納米硒的抗癌效果。如透明質酸（Hyaluronic acid，HA）受體 CD44大量存在于各種癌細胞中，如HepG2細胞、HeLa細胞、A549細胞等。為了提高納米硒對腫瘤細胞的靶向性，Yu等將HA修飾到納米硒顆粒（SeNPs）上，隨后負載阿霉素（Doxorubicin，DOX），利用HA和CD44之間的特異性識別作用制備了具有腫瘤靶向功能的硒納米顆粒（HA-Se@DOX）。研究發(fā)現HA-Se@DOX在使用劑量下不會對主要器官造成損害，且HA-Se@DOX在體外和體內抗腫瘤活性強于游離DOX和Se@DOX，說明該策略顯著增強了納米硒對癌細胞中的靶向性，為癌癥治療提供了一種新的治療策略。

2.2.2 多糖納米硒載體負載抗腫瘤藥物協同抗腫瘤多糖-納米硒不但能夠單獨發(fā)揮抗腫瘤作用，還可以作為載體，與抗腫瘤藥物發(fā)揮協同抗腫瘤作用。這些材料的納米尺寸可以被各種類型的細胞有效吸收，并在靶點處累積藥物，減弱單獨使用抗腫瘤藥物時的毒副作用。例如，順鉑治療的臨床療效在很大程度上受到順鉑耐藥性的限制，而順鉑耐藥性與缺氧誘導因子1的激活有關，但納米硒可以減弱由順鉑誘導的ROS應激反應，并在順鉑發(fā)揮治療作用的同時阻止缺氧誘導因子1的激活，以此來降低順鉑耐藥中的副作用，并發(fā)揮協同抗腫瘤作用。Zhang等利用分子間的靜電相互作用，制備了負載著順鉑藥物的殼聚糖-納米硒復合物，經表征后發(fā)現殼聚糖-納米硒復合物是殼核結構，殼聚糖作為外殼包覆著順鉑-納米硒。此外，他們還發(fā)現殼聚糖-納米硒對順鉑的抗腫瘤作用具有協同作用，能增強順鉑藥物的藥效并降低其副作用。Yu等的研究也發(fā)現了相類似的結論，他們利用半乳糖（Galactose，GA）和去唾液酸糖蛋白受體（ASGR）之間的特異性識別作用，用半乳糖作為腫瘤靶向部分對納米硒進行修飾以制備半乳糖-納米硒載體（GA-SeNPs），然后將阿霉素（Doxorubicin，DOX）負載到GA-SeNPs表面以提高阿霉素對腫瘤細胞的抑制作用。與游離DOX和Se@DOX相比，GA-Se@DOX在抑制HepG2細胞增殖和誘導HepG2細胞凋亡方面表現更優(yōu)異。Wu等制備了果膠穩(wěn)定的硒納米粒子并負載黃素（果膠-納米硒-姜黃素），與游離姜黃素和果膠-納米硒相比，果膠-納米硒-姜黃素表現出更好的水溶性、分散性和儲存穩(wěn)定性，而且還展現出更高的自由基清除能力和抗氧化能力；體外抗腫瘤活性試驗表明，果膠-納米硒-姜黃素復合物能抑制HepG2細胞的生長，且抑制效果在一定范圍內隨著果膠-納米硒-姜黃素復合物的濃度提升而升高，呈現出濃度依賴性。由此來看，多糖-納米硒載體是一種優(yōu)良的活性物質負載平臺，無論是作為藥物載體還是具抗腫瘤作用的活性物質，均能提高它們的水溶性、穩(wěn)定性和生物活性，為腫瘤治療提供了一種新方案，相關研究成果為癌癥群體帶來了新希望，對人類抗腫瘤事業(yè)的發(fā)展具有積極意義。

3 總結與展望

綜上所述，納米硒作為一種高效低毒的制劑，在抗癌方面展現出了良好的應用前景。相比于其他模板，多糖類物質以其穩(wěn)定、生物相容性高等特點顯示出巨大的潛力。筆者所在課題組就基于多糖微/納載體合成了多種類型的納米硒，其在體外抗氧化以及抗腫瘤方面顯現出較高的活性。近期許多學者提出了抗腫瘤的新靶點：多糖靶點，并進行了相關實驗，研究結果表明，多糖物質有望成為腫瘤細胞靶向的潛在物質。因此，以多糖為模板制備納米硒，可以提高納米硒對腫瘤細胞的識別能力，同時還可以保留多糖類物質所具有的特殊功效。此外，多糖-納米硒既可以作為單獨的抗腫瘤藥物，還可以作為抗腫瘤藥物的載體與抗腫瘤藥物聯用，發(fā)揮協同抗腫瘤作用。選擇合適的多糖以及合成條件可以構建理想的納米顆粒，這拓寬了其作為納米營養(yǎng)素或藥物載體在食品、醫(yī)療和制藥領域的應用。但目前，對多糖-納米硒復合物的研究僅僅停留在體系的構建以及生物活性的研究上，對其生物學效應的產生機制和硒化學形式尚未完全了解，相信隨著科學技術的不斷發(fā)展和研究工作的不斷深入，多糖-納米硒材料在抗癌、藥物載體等領域將取得越來越廣闊的應用。