陶 蕾，王廣宇，王明彥，陳彥亮，樊志強(qiáng)，郭 杰，梁 妍，高寶山

（1.蘭州市職業(yè)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；2.三門峽廣宇生物制藥有限公司，河南 三門峽 472400；3.河南省中藥材生產(chǎn)技術(shù)推廣中心，鄭州 450000；4.蘭州大學(xué)，蘭州 730070；5.天津市武清區(qū)農(nóng)村社會事業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，天津 301700）

丹參是中醫(yī)的一味常用中藥，在植物分型中屬于唇形科鼠尾草屬范圍，生長地方較為廣泛，而在我國，盛產(chǎn)丹參的省份主要有河南、山西、河北等地[1]。丹參作為一種活血化瘀類藥物被廣泛應(yīng)用，近年來也得到了國外的認(rèn)可[2]，成功進(jìn)入《美國藥典》[3]。而丹參酮是丹參中提取出來的活性成分，該類成分具有較強(qiáng)的抑制金黃色葡萄球菌功效，如耐藥金黃色葡萄球菌[4]。在奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展期間，奶牛發(fā)乳腺炎的問題是最為常見的問題，奶牛乳腺炎的發(fā)生原因較多，而最為常見的致病因素則為物理因素及各種細(xì)菌、微生物，這些因素會在一定程度上刺激到奶牛的乳腺，進(jìn)而逐步發(fā)展成為炎癥病變，尤其是細(xì)菌、病原微生物感染等，目前，國內(nèi)外應(yīng)用抗生素是奶牛乳腺炎治療的最有效辦法。但隨著抗生素的大量應(yīng)用，耐藥性不斷產(chǎn)生，嚴(yán)重影響了療效，同時(shí)，抗生素的使用會導(dǎo)致牛奶中蓄積藥物，還會對奶牛造成腸道菌群失調(diào)。而通過中藥有效成分能夠克服抗生素治療中的弊端，通過篩選抑菌作用強(qiáng)、對環(huán)境穩(wěn)定的中藥有效成分來防治奶牛乳腺炎，是綠色防控奶牛乳腺炎的一個(gè)重要課題。通過體外抑菌試驗(yàn)篩查各種有效成分，從而確定有效成分，為進(jìn)一步研制新獸藥打下基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 供試藥物

丹參酮提取物（隱丹參酮含量3%，丹參酮ⅡA 11%），三門峽廣宇生物制藥有限公司生產(chǎn)。

1.2 菌株

無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）、乳房鏈球菌（Streptococcus uberis）、從乳腺炎患牛乳汁中分離鑒定的菌株。

枯 草 芽 孢 桿 菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、停乳鏈球菌（Streptococcus dysgalactiae）[ATCC 35666]、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]、變形桿菌（Proteusbacillus vulgaris）[CMCC（B）49027]、化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）[ATCC 19615]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CICC 10419]，其來源為中國工業(yè)微生物菌種保藏與管理中心、中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.3 培養(yǎng)基

①M(fèi)H營養(yǎng)肉湯；②依據(jù)無菌檢查法配制的無菌生理鹽水；③營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；④MH營養(yǎng)瓊脂；⑤營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；⑥麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，以上各種材料均購置于廣東環(huán)凱微生物科技；LB Broth（Lennox，SIGMA）；北京索萊寶（Solarbio）科技提供的無菌脫纖維綿羊血。所用試劑均為分析純。

1.4 儀器與設(shè)備

本次所用儀器設(shè)備包含：①DW-86L338型立式超低溫保存箱；②HPsafe-1200LC型生物安全柜；③麥?zhǔn)媳葷峁?；④GHP-9160型隔水式培養(yǎng)箱；⑤LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌器⑥HZP-250型全溫振蕩培養(yǎng)箱；⑦M(jìn)X-S型漩渦混合；⑧DHG-9240A型電熱鼓風(fēng)干燥箱。

2 方法

2.1 最小抑菌濃度MIC值的測定

最小抑菌濃度MIC值的測定[5-6]：測定方法為常量稀釋法，由經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師開展操作，操作期間按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范對實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行測定，通過管碟法觀察其體外抑菌活性[7-8]。稀釋液為MH肉湯（Mueller-Hinton Broth）。

2.2 接種菌量的準(zhǔn)備

取各菌（細(xì)菌）的肉湯培養(yǎng)物先進(jìn)行稀釋處理，稀釋的標(biāo)準(zhǔn)為10倍，完成以上操作后進(jìn)行MH肉湯稀釋，直至達(dá)到含菌量為1×107cfu/mL范圍為止，并將以上培養(yǎng)物放于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境以備檢測。

2.3 試管二倍稀釋法聯(lián)合瓊脂平板法

在開展這一項(xiàng)試驗(yàn)過程中為了確保更加準(zhǔn)確的成功率和詳細(xì)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，應(yīng)用2組對照的方式進(jìn)行，2組的稀釋方法一樣，選取22支規(guī)格大小為5 mL的無菌離心管平均分為2組，各組留存1#管，其他的離心管分別將2 mL的MH肉湯加入，鏈球菌的方式為添加2%的小牛血清的MH肉湯，在研究組1#管、2#管中分別加入丹參酮提取物配置的原液，添加的劑量為2 mL，之后記錄1#管為抗菌藥物原液，并確保1#管的質(zhì)量濃度為500 mg·mL-1。將2#管中的營養(yǎng)肉湯中加入丹參酮提取物，輕輕搖晃使其均勻后吸取2 ml混合液推注到3#管，按照這種方式持續(xù)對藥液進(jìn)行稀釋，一直到10#管抽吸2 mL，并將其他離心管丟棄，完成以上操作之后，進(jìn)行對照藥液組中的11#管則屬于無藥液管。1#管中的藥物質(zhì)量濃度為500 mg·mL-1、2#管中的藥物質(zhì)量濃度為250 mg·mL-1、3#管中的藥物質(zhì)量濃度為125 mg·mL-1、4#管中的藥物質(zhì)量濃度為62.5 mg·mL-1、5#管中的藥物質(zhì)量濃度為31.25 mg·mL-1、6#管中的藥物質(zhì)量濃度為15.625 mg·mL-1、7#管中的藥物質(zhì)量濃度為7.81 mg·mL-1、8#管中的藥物質(zhì)量濃度為2.91 mg·mL-1、9#管中的藥物質(zhì)量濃度為1.95 mg·mL-1、10#管中的藥物質(zhì)量濃度為0.98 mg·mL-1。

2.4 接種

研究組1#管至11#管中控制加入的稀釋菌液為每次100 μL，而參考組的各離心管則不添加稀釋的菌液。完成稀釋操作之后將菌液放于37℃恒溫的培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育，孵育時(shí)間為21 h左右。并對比分析2組藥物濃度相等的離心管，并作為初步判定結(jié)果，如果離心管內(nèi)的溶液顯示為渾濁狀態(tài)表示存在細(xì)菌生長，如果離心管的溶液表現(xiàn)為清澈透明，則判定為離心管內(nèi)溶液沒有出現(xiàn)生長的細(xì)菌，轉(zhuǎn)種將試驗(yàn)組與對照組各管內(nèi)的中藥與細(xì)菌的培養(yǎng)物，劃線接種至血瓊脂平板，放置在37℃恒溫的培養(yǎng)箱中孵育22 h左右。

2.5 結(jié)果判定

由試驗(yàn)者詳細(xì)地對血瓊脂平板上是否出現(xiàn)細(xì)菌生長進(jìn)行觀察和記錄，本次受試丹參酮提取物對該菌的最低抑菌濃度判定標(biāo)準(zhǔn)為：血瓊脂平板上沒有出現(xiàn)生長細(xì)菌的離心管，并將以上的各菌重復(fù)3次，最終的平均值為最終測定水平。

2.6 管碟法

本次抑菌活性的測定方法為體外抑菌法[9-10]。詳細(xì)的測定方法主要分為以下3個(gè)步驟：（1）準(zhǔn)備好培養(yǎng)基平板，依據(jù)商品操作說明書規(guī)范配置水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基，在121℃的高溫下滅菌15 min，直至溫度下降到55℃左右，將其傾注無菌平皿，從而保持瓊脂厚度4 mm。應(yīng)用5%的脫纖維綿羊血的MH瓊脂平板孵育鏈球菌。水解酪蛋白瓊脂平板使用前應(yīng)置35℃孵育30 min，試驗(yàn)人員應(yīng)對其表面進(jìn)行詳細(xì)檢查，查看是否處于干燥狀態(tài)，避免由于表面潮濕影響試驗(yàn)結(jié)果；

（2）確定最佳涂布濃度：具體的方法是通過用營養(yǎng)肉湯（細(xì)菌）進(jìn)行稀釋處理，稀釋的范圍標(biāo)準(zhǔn)為各活化菌液10-1～10-5的10倍遞增方法，完成稀釋處理以后將其放置在37℃的環(huán)境中培養(yǎng)22 h左右，之后檢測人員詳細(xì)觀察菌苔生長狀況，并由此測得最合適的菌類涂布濃度；

（3）牛津杯加注丹參酮提取物藥液法：檢測人員應(yīng)用生理鹽水稀釋制備的菌液，稀釋的標(biāo)準(zhǔn)為涂布濃度，然后進(jìn)行MH瓊脂平板涂抹和接種操作，平板加蓋置放于超凈工作臺內(nèi)，干燥3 min以上，最長時(shí)間為15 min，并依次完成酒精燈微灼、瓊脂與受試丹參酮提取物藥液原液混合等操作。應(yīng)在此期間將2張滅菌濾紙覆蓋于牛津杯上，將杯蓋合上，水平放置平皿，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育22 h左右，并對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行觀察。如果抑菌環(huán)直徑在10 mm以內(nèi)則判定結(jié)果為沒有抑菌效果，如果超過10 mm而低于15 mm則表示存在較弱的抑菌效果，超過15 mm并低于22 mm則判定為中等的抑菌效果，如果超過22mm則表示抑菌效果強(qiáng)。

3 結(jié)果與分析

丹參酮提取物的最小抑菌濃度（MIC）及抑菌強(qiáng)度結(jié)果觀察，見表1。

表1 丹參酮提取物最低抑菌濃度及抑菌圈直徑結(jié)果

通過以上結(jié)果可以看出，丹參酮提取物對不同細(xì)菌的抑菌效果存在差異，抑菌效果最強(qiáng)的為鏈球菌屬&枯草芽孢桿菌，其次屬于金黃色葡萄球菌，抑菌效果處于中等范圍，抑菌效果相對較差的為腸桿菌。

牛津杯加注丹參酮提取物藥液的體外抑菌法結(jié)果與試管二倍稀釋法結(jié)果相一致，丹參酮提取物（500 mg·mL-1）對各種菌均有較好的抑菌效果，其中對鏈球菌屬和枯草芽孢桿菌具有較強(qiáng)的抑菌效果，抑菌圈直徑介于22.5～25 mm區(qū)間；對腸桿菌的抑菌強(qiáng)度最低，抑菌圈直徑在20.0～22.0 mm之間。抑菌強(qiáng)度大小依次為：鏈球菌屬&枯草芽孢桿菌＞金黃色葡萄球菌＞腸桿菌。

4 討論

中藥具有一定的抑菌效果，藥物成分不同、藥物搭配方式不同也會產(chǎn)生不同的效果[5]，與抗生素等西藥相比，中醫(yī)的毒性更低，且長時(shí)間使用一般也不會產(chǎn)生抗藥性，優(yōu)勢較多。丹參酮提取物是中醫(yī)常用的補(bǔ)血補(bǔ)氣藥物，在奶牛乳腺炎治療中也同樣能夠發(fā)揮良好的活血化瘀、補(bǔ)血補(bǔ)氣功效，進(jìn)而使奶牛乳腺炎病情得以改善、奶牛的機(jī)體免疫力得以提升。本次體外抑菌試驗(yàn)研究中，丹參酮提取物具備很強(qiáng)的抑制鏈球菌屬和枯草芽孢桿菌功效，其檢測所得的最低抑菌質(zhì)量濃度值均在125 mg·mL-1以內(nèi)，同時(shí)還具備一定抑制一般致病性腸桿菌和金黃色葡萄球菌的功效，抑菌效果最強(qiáng)的為鏈球菌屬&枯草芽孢桿菌，其次屬于金黃色葡萄球菌，抑菌效果處于中等范圍，抑菌效果相對較差的為腸桿菌。

本次試驗(yàn)中，丹參酮提取物的抗菌活性與抗生素有一定差距，丹參酮提取物抑菌抗菌作用弱于抗生素的原因可能與本次測試期間的培養(yǎng)基狀態(tài)及所選取的細(xì)菌含量和狀態(tài)等因素有著密切的聯(lián)系，造成本次試驗(yàn)結(jié)果中的抑菌作用效果不明顯。

綜上所述，丹參酮提取物作為一種純中藥制劑，優(yōu)勢眾多，藥物生產(chǎn)流程較為簡單，可降低藥物成本，并減少了使用期間的不良反應(yīng)，對于多種細(xì)菌均可產(chǎn)生良好的抑制效果，具有很大的開發(fā)價(jià)值。該藥物還可以與抗生素搭配使用，從而使藥物之間互相協(xié)同，提高藥物治療效果，宜積極推廣。