王 慧，邵 青，張 燕，楊苗苗，胡婕雯，龔陽(yáng)澤

西安市精神衛(wèi)生中心，西安 710061

尼古丁[1-3]又名煙堿，是脂溶性物質(zhì)，很容易通過人體的皮膚、黏膜組織吸收，適用于透皮給藥系統(tǒng)(transdermal delivery systems, TDS)。但其見光、遇熱易分解易揮發(fā)等性質(zhì)在一定程度制約了其外用制劑的開發(fā)與應(yīng)用[4]。

二元醇脂質(zhì)體[5]是在乙醇的的基礎(chǔ)上加入無(wú)色黏稠的丙二醇，增加乙醇脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，并改善乙醇易揮發(fā)及皮膚刺激性大的缺點(diǎn)。但二元醇脂質(zhì)體為液態(tài)，經(jīng)皮給藥不方便。溫敏凝膠[6]是受溫度影響而發(fā)生相變化的智能凝膠，膠凝溫度最接近人體皮膚溫度(32 ℃)，能較好地黏附于皮膚表面，延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間。因此，本試驗(yàn)制備尼古丁二元醇脂質(zhì)體溫敏凝膠，并對(duì)其進(jìn)行體外釋放評(píng)價(jià)，使藥物更易透皮吸收。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀系統(tǒng)(日本島津公司)；激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)徠卡有限公司)；藥物溶出儀(天津市精拓儀器科技有限公司)；高速離心機(jī)(湖南郝西儀器設(shè)備有限公司)；透皮擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)儀(上海羅中科技發(fā)展有限公司)。

1.2 試藥

尼古丁(博騰藥業(yè)有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>96%)；卵磷脂(PC上海愛康精細(xì)化工有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)90%)；羅丹明B、泊洛沙姆407(P407)和泊洛沙姆188(P188)均購(gòu)自西格瑪奧德里奇有限公司；透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量為8 000～12 000，北京鵬成生物所分裝)；甲醇(色譜純，深圳立業(yè)實(shí)業(yè)有限公司)。

1.3 動(dòng)物

昆明種小鼠(許可證號(hào)SCXK(甘)14-006，合格證：醫(yī)動(dòng)字第14-006號(hào)，蘭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)。

2 方法

2.1 含量測(cè)定

2.1.1色譜條件 Kromasil C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動(dòng)相：三乙胺-甲醇-0.02 mol·L-1醋酸銨(0.1∶30∶60)，過濾(0.45 μm微孔濾膜)、脫氣；流速：1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為365 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 精密稱取一定量尼古丁對(duì)照品，加甲醇溶液并定容，得對(duì)照品溶液。精密量取該對(duì)照品溶液，用甲醇將其稀釋成不同質(zhì)量濃度的溶液(0.62、1.25、2.50、5.00、7.50、10.00、20.00 μg·L-1)。按2.1.1項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣分析，以峰面積(A)對(duì)質(zhì)量濃度(C)進(jìn)行回歸，線性回歸方程A=87 345C+35 671，r=0.999 8，表明尼古丁在20～0.62 μg·L-1內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3精密度 精密量取尼古丁對(duì)照品溶液，用甲醇將其稀釋成高、中、低(20、10、5 μg·L-1)的質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，測(cè)日內(nèi)精密度(5次)；測(cè)日間精密度(連續(xù)3 d)。結(jié)果，日內(nèi)及日間RSD分別為2.11%、2.08%，表明該方法精密度良好。

2.1.4回收率 在5 mL量瓶中放入空白二元醇脂質(zhì)體，加入用乙醇稀釋的0.62、5.00、20.00 μg·L-1尼古丁溶液，振蕩，離心5 min，進(jìn)樣測(cè)定。計(jì)算樣品溶液的平均回收率為(99.70%±3.12%)，RSD為0.91%，表明該方法回收率良好。

2.2 制備尼古丁二元醇脂質(zhì)體溫敏凝膠

2.2.1制備尼古丁二元醇脂質(zhì)體 以包封率、透皮量及穩(wěn)定性為考察因素[7]，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)乙醇∶丙二醇為5∶5時(shí)，包封率最高，穩(wěn)定性最好，透皮量最大。精密稱取處方量的尼古丁、磷脂PC和羅丹明B溶于4.5 mL上述醇溶液中(乙醇-丙二醇為1∶1)，將PBS(pH 6.5)5.5 mL 緩慢注入，整個(gè)過程在密閉恒溫容器中以700 r·min-1的轉(zhuǎn)速不斷攪拌20 min，制備過程中保持體系在(30±1) ℃，室溫冷卻30 min，過濾，得二元醇脂質(zhì)體[8]。

2.2.2二元醇脂質(zhì)體形態(tài)的測(cè)定 將制得的尼古丁二元醇脂質(zhì)體樣品用共聚焦激光掃描電鏡觀察其形態(tài)[7]，顯示尼古丁二元醇脂質(zhì)體均呈類球形或球形的囊泡。結(jié)果見圖1。

圖1 尼古丁二元醇脂質(zhì)體熒光素共聚焦激光掃描圖

2.2.3尼古丁二元醇脂質(zhì)體溫敏凝膠制備 冷溶法[9]制備溫敏凝膠。西林瓶中放入處方量的P188、P407，加入蒸餾水2.0 mL，放置24 h，使凝膠完全潤(rùn)濕，得到無(wú)團(tuán)塊的空白凝膠。冰水浴中放入P188/P407空白凝膠西林瓶，邊加熱邊攪拌，在攪拌中緩慢加入尼古丁二元醇脂質(zhì)體3.0 mL，15 min后，制得P188/P407尼古丁二元醇脂質(zhì)體溫敏凝膠。

2.3 膠凝溫度的測(cè)定

攪拌子法[10]測(cè)膠凝溫度。在塞西林瓶中放入磁攪拌子并加入適量尼古丁二元醇脂質(zhì)體溫敏凝膠，水銀球浸沒在凝膠中，以500 r·min-1進(jìn)行攪拌，緩慢升溫，當(dāng)攪拌子完全靜止的溫度為膠凝溫度，連續(xù)測(cè)定3次。

2.4 尼古丁二元醇脂質(zhì)體溫敏凝膠處方篩選

本實(shí)驗(yàn)選用最接近人體皮膚溫度(32 ℃)為衡量凝膠的最重要指標(biāo)。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)膠凝溫度影響較大的因素分別為藥物量、P188及P407的配比。

2.4.1藥物量對(duì)膠凝溫度的影響 實(shí)驗(yàn)固定P188為凝膠量3.0%，P407為凝膠量30%，分別加入1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL 的二元醇脂質(zhì)體，研究藥物量對(duì)膠凝溫度的影響。結(jié)果見表1。

表1 不同含量藥物對(duì)膠凝溫度的影響

2.4.2P188對(duì)膠凝溫度的影響 實(shí)驗(yàn)固定P407為凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)的 30%，尼古丁二元醇3 mL，分別加入凝膠量2.6%、2.8%、3.0%、3.2%、3.4%的P188，制備溫敏凝膠并測(cè)定膠凝溫度。結(jié)果見表2。

表2 不同含量P188對(duì)膠凝溫度的影響

2.4.3P407對(duì)膠凝溫度的影響 實(shí)驗(yàn)固定P188為凝膠量的 3.0%，尼古丁二元醇3 mL，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)26%、28%、30%、32%、34%的P407，制備溫敏凝膠并測(cè)定膠凝溫度。結(jié)果見表3。

表3 不同含量P407對(duì)膠凝溫度的影響

單因素結(jié)果顯示，當(dāng)P188及P407含量一定時(shí)，膠凝溫度隨著尼古丁二元醇脂質(zhì)體量的增加而升高，當(dāng)尼古丁二元醇為3 mL時(shí)，此時(shí)的溫敏凝膠溫度為(32±0.70) ℃。當(dāng)P407及藥物含量一定時(shí)，膠凝溫度隨著P188含量的升高而升高，當(dāng)P188為3.0%時(shí)，此時(shí)的溫敏凝膠溫度為(32±0.50) ℃。當(dāng)P188及藥物含量一定時(shí)，膠凝溫度隨著P407含量的升高而逐漸降低，當(dāng)P407質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%時(shí)，此時(shí)的溫敏凝膠溫度為(32±0.90) ℃。三者都最接近人體溫度。

由表1至表3可見，溫敏凝膠的最優(yōu)處方為尼古丁二元醇脂質(zhì)體 3 mL、含3.0% P188及30% P407。按最優(yōu)處方制備尼古丁二元醇脂質(zhì)體溫敏凝膠，并測(cè)定其膠凝溫度(n=3)，結(jié)果平均凝膠溫度為(32±0.30) ℃。

2.5 尼古丁二元醇脂質(zhì)體溫敏凝膠體外釋放評(píng)價(jià)

分別取含相同劑量尼古丁的體積分?jǐn)?shù)為45%的乙醇溶液、二元醇脂質(zhì)體及P188/P407二元醇脂質(zhì)體溫敏凝膠，放入透析袋中，扎緊袋口，固定于槳上[11]，體積分?jǐn)?shù)為45%的乙醇溶液作為接收液，在溫度為(32±1) ℃、轉(zhuǎn)速為100 r·min-1的釋放條件下，分別在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)(1、2、4、6、8、10、12、24 h)取1 mL接收液，及時(shí)補(bǔ)充同溫度同體積的接收液，樣品1 mL過濾，進(jìn)樣10 μL，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得規(guī)定時(shí)間點(diǎn)的累計(jì)釋放百分比。結(jié)果見表4。

表4 尼古丁不同制劑體外累積釋放百分比

結(jié)果表明 ，尼古丁不同制劑在24 h內(nèi)的藥物釋放情況，尼古丁二元醇脂質(zhì)體在前3 h內(nèi)藥物已經(jīng)釋放接近100%，可見透析袋對(duì)游離藥物基本無(wú)阻礙作用。同樣的釋放條件下，尼古丁二元醇脂質(zhì)體凝膠的藥物釋放比尼古丁二元醇脂質(zhì)體有顯著的延緩作用，這可能是二元醇脂質(zhì)體溫敏凝膠的藥物一部分包裹在囊泡中，一部分分散于凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，包裹于囊泡中的尼古丁先從囊泡中釋放到凝膠中，再?gòu)哪z中緩慢釋放到介質(zhì)中，減緩了藥物的釋放速度[12]，結(jié)果顯示二元醇脂質(zhì)體溫敏凝膠有更好的緩釋作用。

2.6 小鼠皮膚二元醇脂質(zhì)體及其溫敏凝膠分布

2.6.1給藥方法 羅丹明B與尼古丁均為脂溶性，故以羅丹明B代之。制備含有10 g·L-1羅丹明B的二元醇脂質(zhì)體及二元醇脂質(zhì)體溫敏凝膠，均勻涂抹于去毛的小鼠皮膚，12 h后，處死小鼠，剝離小鼠皮膚，放于載玻片，備用[12-13]。

2.6.2共聚焦激光掃描顯微鏡觀測(cè) 共聚焦激光掃描顯微鏡對(duì)載玻片上的備用皮膚進(jìn)行斷層掃描 。結(jié)果見圖2。

由圖2可知，二元醇脂質(zhì)體(A)及二元醇脂質(zhì)體溫敏凝膠(B)均可攜帶藥物進(jìn)入皮膚，圖A透皮深度比圖B強(qiáng)，但圖B皮內(nèi)滯留量比圖A多，這可能是由于二元醇脂質(zhì)體溫敏凝膠有更好的緩釋作用，在12 h體外釋放量?jī)H為(35.3%±0.26%)，而二元醇脂質(zhì)體此時(shí)釋放量(58.40%±0.25%)明顯高于二元醇脂質(zhì)體溫敏凝膠。

圖2 含羅丹明B二元醇脂質(zhì)體(A)和二元醇脂質(zhì)體溫敏凝膠(B)的共聚焦激光掃描圖

2.7 二元醇脂質(zhì)體溫敏凝膠穩(wěn)定性及皮膚刺激性

2.7.1二元醇脂質(zhì)體溫敏凝膠穩(wěn)定性考察 將制備的二元醇脂質(zhì)體溫敏凝膠分別置于冰箱(4 ℃)及室溫下，每月測(cè)定其膠凝溫度及尼古丁含量，不間斷測(cè)定3 個(gè)月[14-16]，在2 種貯存條件下，其膠凝溫度及尼古丁含量未發(fā)生明顯改變，表明二元醇脂質(zhì)體溫敏凝膠穩(wěn)定性良好[14-15]。結(jié)果見表5。

表5 3個(gè)月穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7.2二元醇脂質(zhì)體溫敏凝膠皮膚刺激性考察 30只家兔，剪去背部皮膚，10只為對(duì)照組，另20只為實(shí)驗(yàn)組[17-19]。實(shí)驗(yàn)組兔脫毛的皮膚上涂抹固定劑量的二元醇脂質(zhì)體溫敏凝膠。對(duì)照組當(dāng)日處死，取背部皮膚，甲醛溶液(100 g·L-1)固定，脫水，HE染色，制成組織切片，顯微鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)組給藥后24、48 h，處死，取背部皮膚，同上處理后制成切片[20]，顯微鏡下觀察，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組皮膚角質(zhì)層無(wú)明顯增厚，基底層細(xì)胞并未液化變性，表明尼古丁二元醇脂質(zhì)體溫敏凝膠對(duì)皮膚無(wú)刺激性，是安全可靠的經(jīng)皮給藥制劑。結(jié)果見圖3。

注：A 對(duì)照組；B 涂抹凝膠后24 h實(shí)驗(yàn)組；C 涂抹凝膠后48 h實(shí)驗(yàn)組。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以接近人體溫度(32 ℃)為考察指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)處方進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，尼古丁二元醇脂質(zhì)體加入量、P188及P407比例分別為3 mL、3.0%及30%時(shí)，制備的尼古丁二元醇脂質(zhì)體溫敏凝膠室溫下為液體，在體溫下為凝膠，易于給藥。體外累積釋放實(shí)驗(yàn)及共聚焦激光掃描圖表明，制備的尼古丁二元醇脂質(zhì)體凝膠具有明顯的緩釋作用，使藥物的作用時(shí)間明顯延長(zhǎng)，大大增加了藥物的生物利用度。