儲寶華，曹富國，卞寧寧，錢謙，李中興，李雪薇，劉澤遠(yuǎn)，馬鋒旺，管清美

西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100

0 引言

【研究意義】中國是世界上蘋果的生產(chǎn)和出口大國。自2007年以來，中國每年的蘋果總產(chǎn)量均占世界總產(chǎn)量的45%以上，2019年中國的蘋果產(chǎn)量甚至達(dá)到4 100萬t，占世界蘋果總產(chǎn)量的54.07%（數(shù)據(jù)來源于蘋果產(chǎn)業(yè)大數(shù)據(jù)分析平臺（agdata.cn））。早期落葉病是威脅中國蘋果生產(chǎn)的主要病害之一，包括褐斑病、斑點(diǎn)落葉病、灰斑病、圓斑病、輪斑病等多種病害，其中斑點(diǎn)落葉病和褐斑病的危害最為嚴(yán)重。斑點(diǎn)落葉病主要通過危害葉片影響樹體生長，進(jìn)而影響蘋果的產(chǎn)量和品質(zhì)。感染斑點(diǎn)落葉病后，蘋果葉片表面產(chǎn)生褐色斑點(diǎn)，隨后黃化脫落，造成樹勢早衰；此外，斑點(diǎn)落葉病也會感染幼果從而引發(fā)果實(shí)腐爛。斑點(diǎn)落葉病嚴(yán)重的果園中葉片感染率能夠達(dá)到90%左右，落葉率達(dá)到80%，給蘋果產(chǎn)業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損害。目前關(guān)于蘋果栽培品種對早期落葉病的抗性研究多集中于褐斑病、腐爛病、枝干輪紋病方面，關(guān)于斑點(diǎn)落葉病在蘋果生產(chǎn)中的研究則集中于農(nóng)業(yè)防治方面，且關(guān)于不同栽培品種對斑點(diǎn)落葉病抗性系統(tǒng)評價(jià)的相關(guān)研究還較少。目前鑒定到的高抗性蘋果栽培品種數(shù)量稀少，因此急需挖掘具有高抗病性的蘋果栽培品種以滿足市場的栽培需求。通過比較國內(nèi)外蘋果栽培品種對斑點(diǎn)落葉病的抗性，從而全面系統(tǒng)地認(rèn)識不同栽培品種的抗病能力，篩選出穩(wěn)定的抗性品種，是解決蘋果園受斑點(diǎn)病侵害的有效途徑?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】全基因組關(guān)聯(lián)性狀分析（genome-wide association study，GWAS）是一種用于開展連鎖標(biāo)記開發(fā)和關(guān)鍵調(diào)控基因挖掘的有效方法，目前在各類糧食作物如水稻、小麥、玉米上廣泛應(yīng)用。PAULINO 等通過GWAS分析發(fā)現(xiàn)抗枯萎病相關(guān)的關(guān)鍵 SNP位點(diǎn)和關(guān)鍵基因；YANG等整合多種分析方法，如Meta-QTL、GWAS和同源性分析，揭示了一個(gè)新的調(diào)控小麥粒徑大小的關(guān)鍵基因—。目前GWAS在蘋果上的應(yīng)用還很少，且現(xiàn)有的研究主要集中在果實(shí)品質(zhì)方面。如FARNETI等將基因組與蘋果揮發(fā)性物質(zhì)相關(guān)聯(lián)，鑒定到9 142個(gè)SNP和兩個(gè)與芳香性物質(zhì)緊密相關(guān)的候選基因和；LIAO等也利用 GWAS發(fā)現(xiàn)與蘋果果實(shí)酸度緊密關(guān)聯(lián)的基因和。【本研究切入點(diǎn)】利用全基因組關(guān)聯(lián)分析挖掘蘋果抗斑點(diǎn)落葉病的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（SNP）及關(guān)鍵候選基因。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究材料的選擇基于課題組現(xiàn)有的蘋果栽培品種 84份，通過離體葉片接種病原菌的試驗(yàn)評價(jià)斑點(diǎn)落葉病抗性，綜合多次試驗(yàn)結(jié)果分析病斑面積、病斑面積增長率，結(jié)合聚類分析的手段，篩選出蘋果栽培品種中穩(wěn)定的抗性品種。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料栽植于蘋果資源圃。蘋果栽培品種共84種，2018年4月將84個(gè)栽培品種采用嵌芽接的方式嫁接于砧木‘平邑甜茶’，每個(gè)品種均有5個(gè)生物學(xué)重復(fù)。試驗(yàn)分別于2019和2020年進(jìn)行，于8月中旬采集植物離體葉片，每個(gè)品種5個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)中采取植株中部健康完整的成熟葉片3—5片。

1.2 接種方法

試驗(yàn)所用的蘋果斑點(diǎn)落葉病病菌（f. sp.）來源于西北農(nóng)林科技大學(xué)孫麗英教授實(shí)驗(yàn)室，菌種保存，擴(kuò)繁的方式參考ZHANG等。具體接種方法如下：病菌活化培養(yǎng)4 d后，切取菌塊放置在PDA平板中央，黑布遮光，25℃培養(yǎng)4 d，待菌落直徑長到2 cm時(shí)，用5 mm打孔器取菌落周圍新長出的白色菌絲用于葉片接種。接種時(shí)將葉片清洗干凈，葉柄用濕棉花包裹以防葉片失水，用手術(shù)刀刀尖在葉片正面的葉脈左右兩側(cè)中部刺傷，于傷口處放置菌塊。接完種的葉片放于托盤中，覆蓋保鮮膜，黑布遮光培養(yǎng)，于25℃培養(yǎng)4 d和8 d后分別拍照，統(tǒng)計(jì)葉背面病斑面積。

1.3 抗性評價(jià)的方法

統(tǒng)計(jì)接種后4 d和8 d葉背面的病斑面積大小，病斑面積越大，說明植物的抗病能力越弱。此外，通過4—8 d病斑面積增長率，來判斷品種抗擴(kuò)展能力。病斑增長率計(jì)算公式：

1.4 全基因組關(guān)聯(lián)分析

使用高效混合模型關(guān)聯(lián)程序EMMAX進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，截止點(diǎn)=0.0000001（-LgP=7），進(jìn)行關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的檢測。本研究利用全基因組深度測序獲得的1 243 071個(gè)高質(zhì)量SNP位點(diǎn)，用EMMAX-Kinship程序計(jì)算，從所有的SNP中得到親緣關(guān)系矩陣。基于以上SNP信息，用GCTA（1.01版）程序?qū)μO果84個(gè)栽培品種進(jìn)行主成分分析并獲得前 10個(gè)主成分矩陣。最后，將84份蘋果栽培種接種后葉片的病斑面積數(shù)據(jù)作為表型，全基因組深度重測序獲得的1 243 071個(gè)高質(zhì)量SNP位點(diǎn)為遺傳標(biāo)記，結(jié)合親緣關(guān)系矩陣和主成分分析結(jié)果，采用EMMAX方法進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)性狀分析。

1.5 候選基因注釋

用ANNOVAR軟件，結(jié)合蘋果參考基因組GDDH13（https://iris.angers.inra.fr/gddh13/）對全基因組關(guān)聯(lián)分析得到的SNP進(jìn)行注釋，獲得每個(gè)SNP上下游約50 kb的突變位點(diǎn)和SNP位點(diǎn)相鄰基因的MD號。使用NCBI-Blast-2.9.0+中 Blastp和擬南芥蛋白組 Tair10（https://www.arabidopsis.org/）進(jìn)行親緣關(guān)系比對。用Python3.7版對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，獲得SNP相鄰候選基因的注釋列表。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

病斑面積用 Image J軟件統(tǒng)計(jì)分析，使用 Excel計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，用SPSS分別對2020年和2021年的病斑面積和病斑面積增長率進(jìn)行聚類分析，聚類分析方法采用瓦爾德法，聚類距離采用平方歐式距離。

1.7 基因表達(dá)分析

根據(jù)GDR網(wǎng)站上、、、、、、的mRNA 序列（https://www.rosaceae.org/），在 NCBI網(wǎng)頁上設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物（表1），將接種后的GL-3組培苗葉片樣品在液氮中充分研磨，用Wolact?Plant RNA Isolation Kit（Hong Kong，China）試劑盒進(jìn)行 RNA 提取, 使用HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，定量試劑用ChamQ SYBR Qpcr Master Mix（Q311-02/ 03），反應(yīng)體系參考試劑使用說明。使用Bio-RadCFX96TM（Bio-Rad）熒光定量 PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，以接種 0、12、24和 48 h的葉片樣品為模板進(jìn)行基因的相對表達(dá)量分析，用作內(nèi)參基因，使用2計(jì)算基因的相對表達(dá)水平。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.8 蘋果葉片的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化

將的基因編碼區(qū)（CDS區(qū)）進(jìn)行克隆后構(gòu)建到入門載體pDONR222，通過LR反應(yīng)構(gòu)建至表達(dá)載體 PK7-203，引物設(shè)計(jì)見表1，構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌C58C1中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘋果葉片瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)。試驗(yàn)方法參考ZHANG等，具體步驟如下：將 100 μL 濃度為 100 μmol·L的乙酰丁香酮加入100 mL LB中，加入100 μL的載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，在28℃培養(yǎng)箱，130 r/min振蕩培養(yǎng)12—16 h，直至OD=1，5 000 r/min離心10 min。將農(nóng)桿菌懸浮于100 mL液體培養(yǎng)基（10 mmol·LMES-KOH（pH 5.2）、10 mmol·LMgCl和 180 μmol·L乙酰丁香酮）中，使用前培養(yǎng)2 h。利用4周大的組培苗進(jìn)行抽真空，真空壓力為0.06—0.08 Mpa，抽真空時(shí)間約4—5 h，直至整個(gè)葉片出現(xiàn)水漬狀，之后將組培苗放回MS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)（25±1℃，白天/黑夜16 h/8 h）。在農(nóng)桿菌侵染4 d后進(jìn)行離體葉片接種試驗(yàn)，接種3 d后進(jìn)行病斑面積統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

不同類型的蘋果屬栽培品種在接種斑點(diǎn)落葉病原菌后，其葉面受侵染的嚴(yán)重度表現(xiàn)出顯著多樣性。為了系統(tǒng)評價(jià)不同栽培品種對斑點(diǎn)落葉病的抗性差異，本研究將葉片壞死的病斑面積作為評價(jià)不同蘋果屬栽培品種對斑點(diǎn)落葉病抗性的標(biāo)準(zhǔn)，病斑面積越大，則植物的抗病能力越差；反之，病斑面積越小，則植物的抗病能力越強(qiáng)。由于單次試驗(yàn)結(jié)果具有片面性，本研究連續(xù)2年統(tǒng)計(jì)了4次試驗(yàn)結(jié)果（2次8 d結(jié)果，2次4 d結(jié)果），最終選擇4次數(shù)據(jù)評價(jià)穩(wěn)定的品種確定為抗性或感病品種。因此，本結(jié)果能夠更客觀地系統(tǒng)評價(jià) 84個(gè)蘋果栽培品種的抗病能力。此外，利用全基因組關(guān)聯(lián)性狀分析的手段鑒定抗病性相關(guān)的關(guān)鍵 SNP位點(diǎn)，并篩選關(guān)鍵的潛在調(diào)控基因。

2.1 84個(gè)蘋果栽培品種的抗病性差異比較（2020年）

84個(gè)蘋果栽培品種的離體葉片在接種斑點(diǎn)落葉病菌株后均有不同程度的發(fā)?。ū?），目前未發(fā)現(xiàn)完全免疫的品種。2020年接種8 d后的病斑面積數(shù)據(jù)顯示，病斑面積的分布范圍在 0.76—6.02 cm，‘凱密歐’的病斑面積最小，僅為（0.76±0.14）cm；而‘Chanterler’的病斑面積最大，達(dá)到（6.02±0.23）cm。另外，為了進(jìn)一步衡量品種抗擴(kuò)展能力，進(jìn)行了4—8 d內(nèi)的病斑面積增長率的分析。數(shù)據(jù)顯示，‘凱密歐’病斑面積增長率最低，僅為15.00%；而病斑面積增長率最高的‘埃德爾博斯多夫’達(dá) 128.25%。綜合病斑面積和病斑增長率兩類指標(biāo)，進(jìn)行聚類分析（圖1-a）。84個(gè)栽培品種中，‘凱密歐’‘Kiku’‘JA’‘皇家嘎啦’‘秋光’‘蜜脆’‘藍(lán)皮爾曼’‘福拉瑞娜’‘Roho3615’‘艾達(dá)紅’‘威廉姆斯女士’‘弘前富士’‘Fujiko’‘紅蓋露’‘Gloster69’‘長富2號’‘早紅1號’聚為一類，為抗病品種；‘Chanterler’‘埃德爾博斯多夫’‘比蒂格海姆’‘信濃紅’‘赫拉森’‘阿麗亞娜’‘2001富士’聚為一類，為易感品種。

表2 84個(gè)蘋果屬栽培品種離體葉片接種病斑大小及病斑面積增長率（2020年）Table 2 Lesion area and its growth rate of 84 apple cultivars inoculated with Alternaria alternata f. sp. Mali

圖1 2020年（a）和2021年（b）84個(gè)栽培品種對斑點(diǎn)落葉病抗性的聚類分析Fig. 1 Cluster analysis of resistance of 84 cultivars to Alternaria alternate f. sp. mali in 2020 (a) and 2021 (b)

2.2 不同類型的栽培品種的抗病性差異比較（2021年）

為了進(jìn)一步證明試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，于2021年進(jìn)行了重復(fù)試驗(yàn)（表3）。2021年接種8 d后的病斑面積數(shù)據(jù)顯示，病斑面積的分布范圍在0.3—2.83 cm。病斑面積最小的是‘藍(lán)皮爾曼’，僅為（0.3±0.11）cm。而接種8 d后病斑面積最大的是‘茜’，達(dá)到（2.83±0.47）cm。4—8 d內(nèi)的病斑面積增長率分析結(jié)果顯示，‘藍(lán)皮爾曼’的病斑面積增長率最低，僅為 4.75%。而病斑面積增長率最高的品種是‘茜’，其病斑面積增長率高達(dá) 56.25%。綜合病斑面積和病斑面積增長率，可以看出病斑面積和病斑面積增長率基本保持一致。2021年聚類分析結(jié)果顯示（圖1），84個(gè)栽培品種中，‘藍(lán)皮爾曼’‘平成’‘艾達(dá)紅’‘Yellow Transparent’‘Ce1’‘NJ-90’‘無銹金冠’‘秦冠’‘皇家嘎啦’‘皮諾娃’‘玫瑰光芒’‘夕陽’‘Northfield Beauty’‘信濃甜’‘寶羅紅’‘Kiku’‘Gloster69’‘阿萊特’‘蜜脆’‘Challenger’‘凱密歐’‘秦陽’‘美味’‘Ce2’‘Su’聚為一類，說明他們是抗性較強(qiáng)的品種；而‘茜’單獨(dú)聚為一類，是極其不抗的品種；此外，‘Fujiko’‘埃德爾博斯多夫’‘千秋’‘斯派克’‘K296’‘昂林’‘早紅霞’‘甘紅’‘王林’‘Redcord’‘富紅早嘎’‘長富2號’‘Chanterler’‘新喬納金’‘荷斯坦’‘Ruby Mac’聚為一類，是低抗性品種。

表3 84個(gè)蘋果屬栽培品種離體葉片接種病斑大小及病斑面積增長率（2021年）Table 3 Lesion area and its growth rate of 84 apple cultivars inoculated with Alternaria alternata f. sp. mali

綜合兩年的聚類分析數(shù)據(jù)，‘凱密歐’‘Kiku’‘皇家嘎啦’‘蜜脆’‘藍(lán)皮爾曼’‘艾達(dá)紅’‘Gloster69’在兩年的抗性分析中均為抗性品種；而‘埃德爾博斯多夫’‘Chanterler’均為低抗性品種。

2.3 蘋果早期斑點(diǎn)落葉病抗病性與 SNP的全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）

為了進(jìn)一步探索蘋果抗早期斑點(diǎn)落葉病的遺傳基礎(chǔ)，對 84份蘋果栽培品種在接種蘋果斑點(diǎn)落葉病8 d后的病斑面積數(shù)據(jù)進(jìn)行GWAS分析。因?yàn)?020年8 d接種的病斑面積分布更符合正態(tài)分布的趨勢，因而選其數(shù)據(jù)作為表型進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。供試群體的病斑面積最小0.3 cm，最大為2.14 cm。病斑面積的峰度和偏度分別為-0.74和0.34，二者的絕對值都小于1，說明蘋果早期斑點(diǎn)落葉病抗病性具有正態(tài)分布特征，呈現(xiàn)數(shù)量性狀遺傳特征（圖2）。

圖2 接種斑點(diǎn)落葉病8 d后的葉片病斑面積表型分布圖Fig. 2 Phenotypic distribution of lesion area after inoculated with Alternaria alternata f. sp. mali for eight days

從 GWAS結(jié)果的分位數(shù)-分位數(shù)圖（quantilequantile plot—Q-Q plot）中看出，Q-Q圖左下角觀察到的值與預(yù)期值一致（圖3）。因此，當(dāng)前統(tǒng)計(jì)模型得到的值符合期望值，證明該統(tǒng)計(jì)模型的合理性。同時(shí)，Q-Q圖的右上角為顯著性較高的SNP位點(diǎn)，這些候選位點(diǎn)可能與蘋果抗斑點(diǎn)落葉病相關(guān)聯(lián)。

圖3 斑點(diǎn)落葉病抗性相關(guān)性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析曼哈頓圖和分位數(shù)-分位數(shù)圖（QQ圖）Fig. 3 Manhattan plots and Quantile-Quantile Plot (QQ plot) of genome wide association analysis of resistance to Alternaria alternata f. sp. mali in apple cultivars

如圖3所示，本研究共檢測到6個(gè)與蘋果早期斑點(diǎn)落葉病抗病性顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)（＜0.0000001，-Lg≥7）（表4），集中分布在蘋果的5號染色體（3個(gè)）和0號染色體（3個(gè)）上。其中位于5號染色體9 336 893 bp位置上的SNP為最顯著的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。該位點(diǎn)位于基因和基因之間的基因間區(qū)。其中和擬南芥的為同源基因，屬于整合素連接蛋白激酶家族中的成員。前人報(bào)道該基因通過調(diào)控蛋白質(zhì)氨基酸的磷酸化在植物的先天性免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮作用。和擬南芥的同源，編碼FMN連鎖氧化還原酶。此外，其他5個(gè)SNP也關(guān)聯(lián)到7個(gè)候選基因（表4、表5），其中基因被 3個(gè) SNP位點(diǎn)關(guān)聯(lián)到，被2個(gè)SNP位點(diǎn)關(guān)聯(lián)到，表明二者參與蘋果調(diào)控斑點(diǎn)落葉病抗性的潛在可能性。其他5個(gè)候選基因分別為核糖體結(jié)合因子A家族蛋白、B-box型鋅指家族蛋白、多蛋白/逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子、植物特異性GATA型轉(zhuǎn)錄因子的一個(gè)新家族成員、堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白。

表4 與抗病性狀相關(guān)的顯著關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)Table 4 SNPs identified to be associated with Alternaria alternata f. sp. mali resistance (P＜0.0000001)

表5 蘋果抗斑點(diǎn)落葉病的候選基因功能注釋Table 5 Functional annotation of candidate genes

2.4 候選基因抗斑點(diǎn)落葉病的生物學(xué)功能驗(yàn)證

為了進(jìn)一步確認(rèn)7個(gè)關(guān)鍵候選基因、、、、、、在抗斑點(diǎn)落葉病中發(fā)揮的生物學(xué)功能，首先對 7個(gè)關(guān)鍵候選基因在接種斑點(diǎn)落葉病菌 0、12、24和48 h后的基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測，試驗(yàn)結(jié)果顯示7個(gè)關(guān)鍵候選基因在接種12和24 h后，基因的表達(dá)量均顯著提高（圖4），預(yù)示7個(gè)關(guān)鍵候選基因均在抗病功能當(dāng)中發(fā)揮著重要作用。其中，在接種12和24 h后的基因上調(diào)水平達(dá)到 7倍左右，相比于其他 6個(gè)候選基因，表達(dá)水平響應(yīng)最為強(qiáng)烈。于是將構(gòu)建到超表達(dá)載體上，對 GL-3（‘嘎啦’蘋果實(shí)生后代）組培苗蘋果葉片進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。隨后對瞬時(shí)超表達(dá)的蘋果葉片在第4天和第7天進(jìn)行表達(dá)水平的檢測，發(fā)現(xiàn)在第7天時(shí)仍能過表達(dá)2倍。同時(shí)對瞬時(shí)超表達(dá)的蘋果葉片在第4天進(jìn)行斑點(diǎn)落葉病接種試驗(yàn)，結(jié)果顯示，接種 3 d后在超表達(dá)的葉片中的病斑面積明顯小于非轉(zhuǎn)基因葉片對照中的（圖5）。

圖4 關(guān)鍵候選基因在接種斑點(diǎn)落葉病后的表達(dá)水平分析Fig. 4 Expression level of key candidate genes after inoculation with Alternaria alternata f. sp. mali

圖5 超表達(dá) MD05G1054300 的葉片抗病性Fig. 5 Disease symptoms of GL-3 leaves transiently expressing MD05G1054300

3 討論

3.1 蘋果栽培品種對斑點(diǎn)落葉病的抗性評價(jià)

蘋果早期落葉病嚴(yán)重威脅蘋果園的生產(chǎn)。早期落葉病爆發(fā)時(shí)，一片葉子上就能產(chǎn)生數(shù)十至上百個(gè)病斑，嚴(yán)重時(shí)病斑甚至連成一片，造成果園早期大面積落葉；同時(shí)感染病菌的果實(shí)極易因受二次寄生而發(fā)生腐爛現(xiàn)象，最終造成蘋果園產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)的急劇下滑，因此，有效防治蘋果早期落葉病一直是國內(nèi)外特別關(guān)注的領(lǐng)域。研究學(xué)者通過探究斑點(diǎn)落葉病的發(fā)生規(guī)律，進(jìn)行抗早期落葉病的基因定位分析，尋找有效的抗病基因，進(jìn)行分子育種，以期達(dá)到蘋果樹高抗病性的目的。近年來，隨著離體葉片的室內(nèi)接種評價(jià)體系的完善，這種評價(jià)方式被廣泛應(yīng)用于蘋果斑點(diǎn)落葉病、褐斑病等葉片病害的抗性評價(jià)研究。這種離體方法可以避免由外界環(huán)境因素的多樣性和多變性對試驗(yàn)結(jié)果造成的干擾，也可以避免由于病原菌的數(shù)量、活力不同而造成的差異影響，評價(jià)結(jié)果具有穩(wěn)定可重復(fù)性的優(yōu)勢。本研究對84個(gè)蘋果屬栽培品種進(jìn)行斑點(diǎn)落葉病的抗性評價(jià)，從中鑒定出7個(gè)穩(wěn)定抗性品種，如‘凱密歐’‘Kiku’‘皇家嘎啦’等。說明蘋果屬栽培品種中包含豐富的抗性資源，可為生產(chǎn)中引種、培育抗性品種和果園中品種的合理布局提供指導(dǎo)。中國的很多自育品種具有優(yōu)良的性狀特征，如：‘秦冠’具有豐產(chǎn)和抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)；‘秦陽’具有早熟和易結(jié)果的特性；‘寒富’具有果實(shí)品質(zhì)優(yōu)良，抗寒性極強(qiáng)的特征。本研究中，‘秦冠’‘秦陽’和‘寒富’均表現(xiàn)出對斑點(diǎn)落葉病的中等抗性。其中‘秦冠’的抗斑點(diǎn)落葉病能力最強(qiáng)，但相較于本研究中篩選出的7份抗性品種，‘秦冠’的抗病性還略有欠缺。目前，中國大面積栽培‘富士’蘋果，但該品種的斑點(diǎn)落葉病抗性極差，因此，亟待進(jìn)行品種改良以促進(jìn)蘋果產(chǎn)業(yè)健康均衡發(fā)展。本研究鑒定到7份抗病性的蘋果品種，這些栽培種在果實(shí)品質(zhì)和果樹長勢等方面均有相關(guān)報(bào)道，如路新創(chuàng)等研究發(fā)現(xiàn)美洲蘋果‘蜜脆’對斑點(diǎn)落葉病的抗病能力強(qiáng)，這與本研究的結(jié)果一致。

3.2 蘋果斑點(diǎn)落葉病抗性研究機(jī)制

通過比較蘋果栽培品種對斑點(diǎn)落葉病的抗性，篩選高抗品種，進(jìn)而通過品種改良使蘋果園免受斑點(diǎn)病侵害。但是由于傳統(tǒng)的蘋果育種周期長，且雜交育種的不定性較強(qiáng)，近年來通過分子育種手段選育高抗病性蘋果種質(zhì)的研究越來越多。本研究中，通過GWAS關(guān)聯(lián)到顯著性候選基因中（附表），多次關(guān)聯(lián)到參與細(xì)胞凋亡及防衛(wèi)反應(yīng)的含有NB-ARC結(jié)構(gòu)域的抗病相關(guān)蛋白基因（NB-ARC domain-containing disease resistance protein）和，其在病害脅迫中發(fā)揮著重要作用。目前關(guān)于蘋果抗斑點(diǎn)落葉病的抗菌機(jī)制主要集中在抗菌蛋白與病原菌幾丁質(zhì)的結(jié)合、誘導(dǎo)植物木質(zhì)素的沉積、激素響應(yīng)、增強(qiáng)植物氧化還原能力等方面。蘋果由真菌幾丁質(zhì)誘導(dǎo)，其蛋白可以與幾丁質(zhì)結(jié)合，還能通過加強(qiáng)HO積累和胼胝質(zhì)沉積增加蘋果對病原真菌的防御反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)能夠增厚細(xì)胞壁，誘導(dǎo)茉莉酸響應(yīng)途徑，增強(qiáng)抗氧化相關(guān)酶活性從而提高植物的抗病性。ZHANG等研究發(fā)現(xiàn)兩種含有卷曲螺旋、核苷酸結(jié)合和富含亮氨酸重復(fù)（CCR-NB-LRR）結(jié)構(gòu)域的抗性（R）蛋白MdRNL2和 MdRNL6相互作用形成一種 MdRNL2-MdRNL6復(fù)合物，與新型發(fā)病機(jī)制相關(guān)（PR）蛋白MdPR10-1相互作用以抑制真菌生長；在其 2018年的研究中發(fā)現(xiàn)‘金冠’（）和‘寒富’（）的啟動子區(qū)域中鑒定出單核苷酸多態(tài)性（SNP），即-1 186 bp的motif b（G-T）。當(dāng)突變感病品種中啟動子 motif b的G為T時(shí)，啟動子活性喪失，表明中的 SNP與斑點(diǎn)落葉病抗性相關(guān)。因此，該 SNP可作為區(qū)分對斑點(diǎn)落葉病具有抗性或易感性的蘋果品種的標(biāo)記。ASR（ABA/water stress/ripening-induced）基因家族在植物應(yīng)對斑點(diǎn)落葉病過程中存在不同的基因表達(dá)模式，暗示 Md-ASR基因家族在病害脅迫中發(fā)揮著重要作用。有研究者通過對新疆野蘋果的抗斑點(diǎn)落葉病轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)，其響應(yīng)斑點(diǎn)落葉病的主要方式為茉莉酸信號途徑、乙烯信號途徑和水楊酸信號途徑。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)為蘋果抗斑點(diǎn)落葉病的主基因之一，該基因能夠增強(qiáng)蘋果氧化還原酶的能力，降低活性氧含量，從而使蘋果更抗斑點(diǎn)落葉病。上述研究結(jié)果表明，植物的抗病機(jī)制和氧化還原能力相關(guān)，而本研究定位到的關(guān)鍵候選基因（FMN，連鎖氧化還原酶類超家族蛋白），參與植物以氧化還原為特征的各類生理反應(yīng)。

目前，GWAS分析是一種有效的復(fù)雜性狀功能定位的正向遺傳學(xué)分析策略，可利用群體內(nèi)所有個(gè)體全基因組水平上的等位遺傳變異和表型變異進(jìn)行相關(guān)性分析，從而鑒定出與目標(biāo)性狀顯著連鎖的等位變異位點(diǎn)，最后分析等位基因型對表型的遺傳效應(yīng)，在植物數(shù)量性狀遺傳結(jié)構(gòu)解析中取得了豐碩成果。GWAS分析現(xiàn)已被廣泛用于農(nóng)作物定位，如小麥籽粒品質(zhì)性狀和小麥抗倒伏性狀的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)和候選基因的預(yù)測。但是由于參考基因組雜合度高，性狀統(tǒng)計(jì)較難等原因，GWAS分析在蘋果中的研究還很少。本研究以前期獲得的高質(zhì)量 SNP數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，結(jié)合84份蘋果栽培品種在接種斑點(diǎn)落葉病8 d后的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行GWAS分析，最終得到6個(gè)顯著SNP位點(diǎn)，并隨后關(guān)聯(lián)到7個(gè)關(guān)鍵候選基因。其中（FMN，連鎖氧化還原酶類超家族蛋白）被關(guān)聯(lián)到3次，（ILK1，整合素連接蛋白激酶）被關(guān)聯(lián)到2次，且這兩個(gè)基因在蘋果‘金冠’基因組的5號染色體上緊密相連。前人研究證明核黃素可以直接參與植物以氧化還原為特征的各類生理反應(yīng)，從而誘導(dǎo)植物對多種病害的防治，而FMN是核黃素在體內(nèi)具有生物活性的主要形式，說明蘋果FMN在參與抗斑點(diǎn)落葉病的潛在可能性。此外，在擬南芥中整合素連接蛋白激酶（ILK1）已被報(bào)道有助于提高植物對病原體的防御，本研究在蘋果中超表達(dá)能提高蘋果斑點(diǎn)落葉病抗性，表明其具有和類似的功能。本研究預(yù)測的關(guān)鍵候選基因中有 3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，包括堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）轉(zhuǎn)錄因子（）、植物特異性GATA型轉(zhuǎn)錄因子（）和B-box（BBX）家族轉(zhuǎn)錄因子（）。這三者均被證明對植物的抗逆和生長發(fā)育起關(guān)鍵調(diào)控作用。如大米的屬于bZIP家族蛋白，具有能夠直接結(jié)合下游抗病基因啟動子的能力，進(jìn)而調(diào)控抗病相關(guān)基因的表達(dá)，也有研究報(bào)道辣椒中過表達(dá)能夠增強(qiáng)植物的抗病性；小麥中過表達(dá)GATA型轉(zhuǎn)錄因子—TaGATA1則能夠顯著增強(qiáng)小麥對紋枯病的抗性；甘薯的B-box轉(zhuǎn)錄因子—IbBBX24可以通過調(diào)控茉莉酸（JA）通路來響應(yīng)枯萎病的侵害。盡管本研究中鑒定到的候選基因（、和）在蘋果的抗病研究中還未見報(bào)道，但是根據(jù)同源基因的功能預(yù)測，推測這些基因可能與蘋果抗病性緊密相關(guān)。后續(xù)研究可將本文鑒定到的這些候選基因作為重點(diǎn)，深入探究其在蘋果抗斑點(diǎn)落葉病中的生物學(xué)功能及分子機(jī)制。

4 結(jié)論

在 84份蘋果屬栽培品種中鑒定到斑點(diǎn)落葉病的抗性品種7份、易感品種2份。此外，鑒定到6個(gè)與蘋果斑點(diǎn)落葉病抗病性顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，并關(guān)聯(lián)到7個(gè)關(guān)鍵候選基因，其中位于5號染色體9 336 893 bp位置上的SNP為最顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，且這個(gè)位點(diǎn)上下游的兩個(gè)基因 FMN連鎖氧化還原酶類超家族蛋白（）和整合素連接蛋白激酶（）為關(guān)鍵的候選基因，其中超表達(dá)可顯著提高蘋果斑點(diǎn)落葉病抗性。