梁潤芳， 李志勇， 武自念， 賀有權(quán)， 郝 龍， 孔令琪(.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 0000；.豐鎮(zhèn)市農(nóng)牧和科技局， 內(nèi)蒙古 烏蘭察布 099)

羊草(Leymuschinensis)又名堿草，是禾本科賴草屬多年生優(yōu)質(zhì)牧草，在我國北方廣泛分布。羊草不僅產(chǎn)量高、品質(zhì)好、適口性好、再生力強(qiáng)，而且具有抗寒、抗旱[1]、耐鹽堿[2]等優(yōu)良特性，是一種優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的牧草資源。羊草對我國發(fā)展人工草地建設(shè)、退化草地修復(fù)和荒漠治理等方面具有重要作用[3]。羊草在自然生境中無性繁殖占絕對優(yōu)勢，而有性繁殖能力較弱[4]，主要表現(xiàn)為嚴(yán)重的“三低”現(xiàn)象：發(fā)芽率低(20%～30%)、抽穗率低(20%～40%)、結(jié)實(shí)率低(30%～50%)[5]。近年來，畜牧業(yè)飛速發(fā)展，改良天然草地，建立優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的人工草地等都需要大量的羊草種子[6]，而種子發(fā)芽率低嚴(yán)重影響了羊草的生產(chǎn)應(yīng)用。過氧化氫(Hydrogen peroxide，H2O2)是細(xì)胞有氧代謝的產(chǎn)物，是活性氧的一種[8]。馬悅等[9]研究表明，適量濃度的H2O2可以打破種子休眠，促進(jìn)種子萌發(fā)，如今已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。甲基紫精(Methylviologen，MV)是過氧化氫的合成前體，MV在植物體內(nèi)可作為電子受體將光系統(tǒng)反應(yīng)Ⅰ(PSⅠ)的電子傳遞給氧氣，在光下分解產(chǎn)生H2O2，從而促進(jìn)種子萌發(fā)[10]。脫落酸(Abscisic Acid，ABA)是植物體內(nèi)源激素，有研究指出，ABA是引起種子休眠的主要因素[4]。N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)屬于抗氧化劑的一種，具有清除植物體內(nèi)過多活性氧的作用。本試驗(yàn)以4種外源添加劑(H2O2、MV、ABA、NAC)對羊草種子進(jìn)行處理，分析發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、根長、苗長及根長/苗長參數(shù)，研究外源添加劑對羊草種子萌發(fā)的影響，為促進(jìn)羊草種子萌發(fā)，提高羊草種子產(chǎn)量及品質(zhì)提供新的理論方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

本試驗(yàn)所用羊草種子于2018年收獲于內(nèi)蒙古錫林郭勒盟西烏珠穆沁旗，室溫貯藏，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

挑選籽粒大小相當(dāng)且飽滿的羊草種子，分別以不同濃度的H2O2、MV、ABA、NAC對羊草種子進(jìn)行處理，蒸餾水為對照(ck)。其中H2O2的濃度分別為1 mmol/L、25 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L；MV的濃度分別為0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L；ABA濃度分別為10 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L；NAC的濃度分別為1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L。將種子放入鋪有雙層潤濕濾紙(不見明顯水層)的培養(yǎng)皿(90 mm×90 mm)中。設(shè)置4個重復(fù)，每個重復(fù)50粒種子。使用人工氣候培養(yǎng)箱，在20 ℃、12 h黑暗，30 ℃、12 h光照條件下進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。以50 μmol/L ABA和5 mmol/L的NAC分別與1 mmol/L、25 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L H2O2及0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L MV進(jìn)行交互作用。試驗(yàn)方法同上。

1.3 指標(biāo)測定

每天定時觀察發(fā)芽情況，適當(dāng)補(bǔ)充蒸餾水和相應(yīng)的外源添加劑處理液，以胚根伸出種皮1～2 mm作為種子發(fā)芽標(biāo)志，記錄發(fā)芽數(shù)[11]。計算種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、根長、苗長和根長/苗長。

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽終期正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%;

發(fā)芽勢(%)=(發(fā)芽第7天發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%;

發(fā)芽指數(shù)=∑Gt/Dt，式中：Gt為第t日的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽日數(shù)；

活力指數(shù)=S×GI，式中：S為平均幼苗的長度，GI為種子發(fā)芽指數(shù)。

根長和苗長測定：種子萌發(fā)第20天結(jié)束時，在每個處理的4個重復(fù)中，每皿隨機(jī)選取10株苗，測定每株的根長及苗長(外源添加劑處理的羊草種子時，每個處理培養(yǎng)皿未生長10株幼苗的，取全部幼苗測定其根長及苗長)，計算其平均值。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行方差分析，采用Microsoft Excel 2010軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度H2O2對羊草種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

1 mmol/L、25 mmol/L和50 mmol/L的H2O2處理對羊草種子萌發(fā)均有促進(jìn)作用，可顯著提高羊草種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)及發(fā)芽速率(p<0.05)；1 mmol/L、25 mmol/L和50 mmol/L的H2O2處理下，發(fā)芽率相較ck分別提高44%、44%和42%；100 mmol/L的H2O2處理的羊草種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均為0；隨著H2O2濃度增加，羊草種子的根長逐漸降低，苗長無顯著影響，不同濃度H2O2的根長/苗長逐漸降低，由此可知，高濃度的H2O2抑制了根長生長，從而降低了根長/苗長(表1)。

表1 不同濃度的 H2O2 對羊草種子發(fā)芽的影響Table 1 The effect of different concentrations of H2O2 on the germination of Leymus chinensis seeds

2.2 不同濃度MV對羊草種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

由表2可見，0.1 μmol/L與1 μmol/L的MV處理可顯著促進(jìn)羊草種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)；與ck相比，0.1 μmol/L與1 μmol/L的MV處理使羊草種子的發(fā)芽率提高了44%和47%，但10 μmol/L的MV處理下顯著抑制了羊草種子萌發(fā)(p<0.05)，說明低濃度的MV促進(jìn)羊草種子萌發(fā)，而高濃度的MV抑制了種子萌發(fā)；0.1 μmol/L MV處理的根長與ck無顯著差異，均顯著高于1 μmol/L與10 μmol/L MV處理；0.1 μmol/L與1 μmol/L MV處理下，苗長顯著高于ck；ck的根長/苗長顯著高于不同濃度的MV處理。

表2 不同濃度的MV對羊草種子發(fā)芽的影響Table 2 The effect of different concentrations of MV on the germination of Leymus chinensis seeds

2.3 不同濃度的NAC對羊草種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

由表3可見，1 mmol/L的NAC處理顯著促進(jìn)羊草種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)與發(fā)芽速率；與ck相比，1 mmol/L的NAC處理使發(fā)芽率提高34%，發(fā)芽勢提高39%，發(fā)芽指數(shù)提高約3.8倍，活力指數(shù)提高約3.2倍，發(fā)芽速率提高約1.2倍，說明低濃度的NAC處理可促進(jìn)羊草種子萌發(fā)；ck顯著高于5 mmol/L與10 mmol/L NAC處理的發(fā)芽情況，說明5 mmol/L與10 mmol/L的NAC處理明顯抑制了羊草種子的萌發(fā)；隨著NAC濃度增加，根長逐漸降低，ck顯著高于1 mmol/L與5 mmol/L的NAC處理下羊草種子的苗長；ck的根長/苗長值最大，顯著高于1 mmol/L、5 mmol/L與10 mmol/L NAC處理。

表3 不同濃度的 NAC 對羊草種子發(fā)芽的影響Table 3 The effect of different concentrations of NAC on the germination of Leymus chinensis seeds

2.4 不同濃度ABA對羊草種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

由表4可知，10 μmol/L的ABA處理羊草種子，發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)均與ck無顯著差異；10 μmol/L的ABA處理與ck相比，活力指數(shù)降低；50 μmol/L與100 μmol/L的ABA處理下的羊草種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)均顯著低于ck，說明高濃度的ABA抑制了羊草種子的萌發(fā)；隨著ABA濃度增加，根長、苗長及根長/苗長均顯著降低。

表4 不同濃度的ABA對羊草種子發(fā)芽的影響Table 4 The effect of different concentrations of ABA on the germination of Leymus chinensis seeds

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取50 μmol/L ABA以及5 mmol/L NAC進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.5 50 μmol/L ABA與不同濃度H2O2交互作用對羊草種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

由表4，表5可見，羊草種子在50 μmol/L ABA處理的發(fā)芽率僅為3%，加入不同濃度H2O2可顯著提高ABA處理下的羊草種子發(fā)芽率(p<0.05)，隨著H2O2濃度升高，發(fā)芽率呈先升后降的趨勢，在1 mmol/L H2O2處理時羊草種子發(fā)芽率最高達(dá)到76%。羊草種子在50 μmol/L ABA處理的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)僅為2.00%和2.71，加入不同濃度H2O2可顯著提高ABA處理下的羊草種子發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)(p<0.05)，隨著H2O2濃度升高呈先升后降趨勢，發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)在1 mmol/L和25 mmol/L H2O2處理時差異不顯著(p>0.05)。加入不同濃度H2O2可顯著提高ABA處理下的羊草種子活力指數(shù)和苗長(p<0.05)，在1 mmol/L H2O2處理時羊草種子活力指數(shù)和苗長最高，而根長僅在1 mmol/L H2O2處理時顯著提高(p<0.05)，其余H2O2處理顯著低于未添加(p<0.05)。

表5 50 μmol/L ABA與不同濃度H2O2交互作用對羊草種子發(fā)芽參數(shù)的影響Table 5 The effect of interaction between 50 μmol/L ABA and different concentrations of H2O2 on the germination parameters of Leymus chinensis seeds

2.6 50 μmol/L ABA與不同濃度MV交互作用對羊草種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

由表6可知，羊草種子在50 μmol/L ABA處理的發(fā)芽率僅為3%，加入不同濃度MV可顯著提高羊草種子發(fā)芽率(p<0.05)，隨著MV濃度升高發(fā)芽率逐漸下降，在0.1 mmol/L MV處理時羊草種子發(fā)芽率最高達(dá)到72%。羊草種子在50 μmol/L ABA處理的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)僅為2.00%和2.71，加入不同濃度MV可顯著提高ABA處理下的羊草種子發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)(p<0.05)，隨著MV濃度升高呈先升后降趨勢，發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)在0.1 μmol/L和1 μmol/L MV處理時差異不顯著(p>0.05)。加入不同濃度MV可顯著提高ABA處理下的羊草種子活力指數(shù)和苗長(p<0.05)，在1 μmol/L MV處理時羊草種子活力指數(shù)和苗長最高，而根長僅在0.1 μmol/L MV處理時顯著提高(p<0.05)，其余MV處理顯著低于未添加(p<0.05)。

表6 50 μmol/L ABA與不同濃度MV交互作用對羊草種子發(fā)芽參數(shù)的影響Table 6 The effect of interaction between 50 μmol/L ABA and different concentrations of MV on the germination parameters of Leymus chinensis seeds

2.7 5 mmol/L NAC與不同濃度H2O2交互作用對羊草種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

由表7可知，羊草種子在5 mmol/L NAC處理的發(fā)芽率僅為2%，加入不同濃度H2O2可顯著提高NAC處理下的羊草種子發(fā)芽率(p<0.05)，各濃度H2O2處理間差異不顯著(p>0.05)。羊草種子在5 mmol/L NAC處理的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)僅為2%和1.54，加入不同濃度H2O2可顯著提高NAC處理下的羊草種子發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)(p<0.05)，且各處理間差異不顯著(p>0.05)。加入不同濃度H2O2可顯著提高NAC處理下的羊草種子活力指數(shù)和根長(p<0.05)，在1 mmol/L H2O2處理時羊草種子活力指數(shù)和根長最高，而苗長僅在1 mmol/L H2O2處理時顯著提高(p<0.05)，其余H2O2處理與未添加差異不顯著(p>0.05)。

表7 5 mmol/L NAC與不同濃度H2O2交互作用對羊草種子發(fā)芽參數(shù)的影響Table 7 The effect of interaction between 5 mmol/L NAC and different concentrations of H2O2 on the germination parameters of Leymus chinensis seeds

2.8 NAC與MV交互作用對羊草種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

由表8可知，羊草種子在5 mmol/L NAC處理的發(fā)芽率僅為2%，加入不同濃度MV可顯著提高NAC處理下的羊草種子發(fā)芽率(p<0.05)，0.1 μmol/L MV處理顯著高于其余濃度處理(p<0.05)。羊草種子在5 mmol/L NAC處理的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)僅為2%、1.54和5.15，加入不同濃度MV可顯著提高NAC處理下的羊草種子發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)(p<0.05)，且各處理間差異不顯著(p>0.05)。加入不同濃度MV可顯著提高NAC處理下的羊草種子根長(p<0.05)，在0.1 μmol/L MV處理時羊草種子根長最長，而苗長未添加差異不顯著(p>0.05)。

表8 5 mmol/L NAC 與不同濃度 MV 交互作用對羊草種子發(fā)芽參數(shù)的影響Table 8 The effect of interaction between 5 mmol/L NAC and different concentrations of MV on the germination parameters of Leymus chinensis seeds

3 討 論

3.1 不同濃度H2O2及MV對羊草種子萌發(fā)的影響

本研究中，1 mmol/L、25 mmol/L和50 mmol/L H2O2處理均有利于羊草種子萌發(fā)，但隨著H2O2濃度的升高羊草種子根長的生長逐漸受到抑制，100 mmol/L時抑制了羊草種子萌發(fā)，1 mmol/L H2O2處理作用最顯著。有研究表明，使用0.3%的H2O2可顯著提高狗尾草種子的萌發(fā)率[8]。5%的H2O2可以解除種子休眠，顯著促進(jìn)甜菜種子萌發(fā)[9]；本研究結(jié)果與趙東興等[12]使用H2O2處理檳榔種子的結(jié)果相似，隨著H2O2濃度的升高萌發(fā)率逐漸升高，但根長生長逐漸減弱，其中4 mg/L的H2O2作用最顯著。有研究表明，H2O2解除種子休眠可能與胚乳物質(zhì)代謝途徑——磷酸戊糖途徑有關(guān)[9]；本研究結(jié)果可能是因?yàn)镠2O2具有一定的腐蝕性，較小程度腐蝕了羊草種子的表皮通透性，為種子萌發(fā)提供了充足的氧氣，從而促進(jìn)羊草種子萌發(fā)；或者在磷酸戊糖途徑中提高了某些酶的活性，促進(jìn)羊草種子胚生長。

MV是H2O2的合成前體，本研究中，0.1 μmol/L與1 μmol/L的MV顯著促進(jìn)羊草種子萌發(fā)，但隨著MV濃度升高，根長生長減弱，但苗長顯著高于ck，10 μmol/L MV完全抑制了羊草種子的生長。Oracz等[13]研究發(fā)現(xiàn)，0.1 mmol/L的MV可解除向日葵種子休眠，加快種子萌發(fā)；林桂珠等[10]研究發(fā)現(xiàn)，5～10 μmol/L的MV處理未吸漲或已萌動的雜交水稻種子1 d后，種子發(fā)芽率與ck差異不太，但活力指數(shù)和胚根的生長受抑制最明顯。本試驗(yàn)結(jié)果可能是低濃度的MV促進(jìn)了羊草種子分解H2O2，從而促進(jìn)萌發(fā)，而10 μmol/L MV可能分解產(chǎn)生的H2O2過多，抑制了羊草種子的活性；或者是由于高濃度的MV使羊草種子胚乳中物質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)或新生芽與根的合成能力的某一環(huán)節(jié)上出現(xiàn)了障礙而使其難以繼續(xù)生長存活。

3.2 不同濃度NAC及ABA對羊草種子萌發(fā)的影響

NAC具有抗氧化作用，并對植物體內(nèi)已有的自由基有清理作用[14]。Yushi等[15]在大豆種子研究中發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑NAC則隨著濃度增加對種子萌發(fā)起抑制作用。Su等[16]對細(xì)枝巖黃芪研究表明，隨著NAC濃度增加，發(fā)芽率逐漸降低，其中50 mmol/L NAC即可顯著抑制冷層積細(xì)枝巖黃芪種子的萌發(fā)；本研究中，1 mmol/L的NAC可顯著促進(jìn)羊草種子萌發(fā)，但5 mmol/L與10 mmol/L NAC顯著抑制了羊草種子萌發(fā)，原因可能是低濃度的NAC促進(jìn)了羊草種子萌發(fā)時體內(nèi)某些酶的活性從而促進(jìn)羊草種子萌發(fā)，而高濃度NAC抑制了胚軸尖端H2O2的產(chǎn)生，阻礙羊草種子萌發(fā)，NAC對種子萌發(fā)的作用機(jī)理研究較少，還有待進(jìn)一步研究。

在許多物種中，ABA是參與種子休眠和萌發(fā)的關(guān)鍵激素。崔雪蓮，夏超[17]研究表明，外源噴施2.0 mg/L的ABA對醉馬草種子的發(fā)芽率有顯著促進(jìn)作用，而當(dāng)濃度增加到4.0 mg/L時表現(xiàn)為明顯的抑制作用；張翔等[18]研究表明，低濃度的ABA(10 mg/L)處理水稻種子對其萌發(fā)有促進(jìn)作用，并能有效促進(jìn)根和芽的伸長生長，高濃度ABA(50～90 mg/L)對種子萌發(fā)和根、芽的伸長生長具有明顯的抑制作用；本研究中，10 μmol/L ABA未能促進(jìn)羊草種子萌發(fā)，但50 μmol/L ABA即可明顯對羊草種子起抑制作用。種子萌發(fā)是一個非常復(fù)雜的生理過程，種子體內(nèi)的多種激素互作會引起萌發(fā)過程中一系列的生理生化反應(yīng)，有研究表明，種子萌發(fā)過程中，ABA阻止糊粉層中mRNA的合成，抑制赤霉素(GA)所促進(jìn)的α-淀粉酶的積累，從而抑制β-淀粉酶的活力[19]，抑制了種子萌發(fā)；另外，ABA會抑制參與種子萌發(fā)的水解酶的活性，例如異檸檬酸裂解酶和內(nèi)甘露聚糖等。本研究結(jié)果可能是羊草種子體內(nèi)ABA含量升高，降低了GA的含量，也可能是由于高濃度的ABA抑制了某些水解酶的活性，阻礙了種子萌發(fā)過程中一些重要代謝途徑，從而抑制羊草種子萌發(fā)。

3.3 H2O2和MV與NAC和ABA的交互作用對羊草種子萌發(fā)的影響

不同濃度的H2O2和MV均可緩解5 mmol/L NAC的抑制作用，1 mmol/L H2O2和0.1 μmol/L MV效果最顯著。有研究表明，NAC是通過抑制種子胚軸尖端H2O2的產(chǎn)生而抑制發(fā)芽的[17]，因此，推測本研究結(jié)果可能是H2O2和MV補(bǔ)充了由NAC抑制的胚軸尖端H2O2，進(jìn)而緩解了由其引起的羊草種子低萌發(fā)率。

50 μmol/L ABA與不同濃度H2O2和MV的交互作用表明，各濃度H2O2和MV均可緩解其抑制作用，1 mmol/L H2O2和0.1 μmol/L MV效果最佳。有研究表明，外源H2O2處理可促進(jìn)內(nèi)源NO的產(chǎn)生,從而促進(jìn)ABA分解代謝,使ABA含量減少,打破ABA和GA的平衡,從而導(dǎo)致休眠解除,促進(jìn)發(fā)芽[20]。本研究結(jié)果可能是外源H2O2和MV減少ABA含量，從而促進(jìn)萌發(fā)。對于ABA抑制種子萌發(fā)的研究較多，但外源添加H2O2和MV對ABA的緩解作用較少，而且不同的物種，同一物種的不同基因型，外界環(huán)境因素等都存在一定的影響，本研究結(jié)果具體原因有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

1 mmol/L、25 mmol/L和50 mmol/L H2O2處理促進(jìn)羊草種子萌發(fā)，100 mmol/L時抑制了羊草種子萌發(fā)；0.1 μmol/L與1 μmol/L MV可顯著促進(jìn)羊草種子萌發(fā)，10 μmol/L MV抑制其萌發(fā)；1 mmol/L NAC促進(jìn)羊草種子萌發(fā)，5 mmol/L和10 mmol/L NAC抑制羊草種子萌發(fā)；10 μmol/L ABA對羊草種子萌發(fā)無影響，但隨著ABA濃度升高，抑制了羊草種子萌發(fā)。外源添加不同濃度H2O2和MV均可緩解50 μmol/L ABA及5 mmol/L NAC所引起的發(fā)芽率降低問題，1 mmol/L H2O2和0.1 μmol/L MV效果最佳。