田 秀，黃路婷，謝元貴,3，劉濟明，吳婷婷

(1.貴州大學(xué)林學(xué)院，貴陽 550025;2.遵義市紅花崗區(qū)林業(yè)局林業(yè)服務(wù)中心,貴州 遵義 563000;3.貴州科學(xué)院，貴陽 550001)

【研究意義】米槁(CinnamomummigaoH. W. Li)系樟科(Lauraceae)樟屬常綠喬木，主要分布于中國的西南地區(qū)，其干燥成熟的果實是貴州省著名道地藥材大果木姜子[1],在治療胃腸道疾病、心腦血管疾病和風(fēng)濕關(guān)節(jié)疼痛方面療效顯著[2]，具有重要的藥用價值。根際微生物對植株的生長發(fā)育起重要作用[3-4]，研究米槁果實不同發(fā)育時期根際可培養(yǎng)真菌，有利于探索其多樣性、有益真菌的篩選及有害微生物的防治。【前人研究進展】植物根際是根—土壤—微生物相互作用的熱區(qū)，也是三者之間進行物質(zhì)循環(huán)、能量交換和信號傳遞等相互作用的場所[5-6]。根際微生物不僅對植物的養(yǎng)分吸收至關(guān)重要，對藥用植物有效成分的積累也有一定促進作用[7-9]。童炳麗等[10]利用高通量測序技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，部分米槁根際真菌類群與藥用活性成分呈正相關(guān)關(guān)系。此外，大量的研究表明，根際微生物的變化與植物的年齡和發(fā)育階段密切相關(guān)[11-13]。梔子(GardeniajasminoidesEllis)根際微生物在不同的生育期優(yōu)勢屬明顯不同，且膨大期微生物多樣性最豐富[14]。Luk?a等[15]研究表明，沙棘(Hippophaerhamnoides)果實成熟期的真菌多樣性明顯高于未成熟階段。【本研究切入點】盡管根際微生物與植物不同發(fā)育階段間相互聯(lián)系的研究已取得一定進展，但大多數(shù)的研究都是基于高通量技術(shù)進行，常常忽略傳統(tǒng)的純培養(yǎng)，這嚴重阻礙了相關(guān)功能菌株的開發(fā)與利用，難以利用微生物技術(shù)實現(xiàn)米槁藥材產(chǎn)量和質(zhì)量提升。目前對米槁研究主要集中于果實化學(xué)成分鑒定[16-17]、藥理學(xué)[18]、化感效應(yīng)[19]和生理生態(tài)[20-21]等方面，而對影響米槁果實發(fā)育因素的研究卻鮮有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以米槁果實幼果期、膨大期、成熟期的根際土壤為研究對象，采用稀釋平板法分離純化米槁根際真菌，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定其真菌種類，探究米槁根際可培養(yǎng)真菌群落組成在果實不同生長發(fā)育周期內(nèi)的動態(tài)變化規(guī)律，為利用其根際有益真菌提高種植藥材的品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 米槁根際土壤樣品的采集

米槁根際土壤于2019年采自貴州省羅甸縣的納慶村( 26°15′N，106°31′E，海拔790 m)、望謨縣的祥樂村(25°10′N，106°5′E，海拔570 m)和壩碰村(25°7′N,106°3′E海拔670 m)。分別于米槁果實發(fā)育的幼果期(6月)、膨大期(8月)和成熟期(11月)，每個采樣地隨機選擇5株長勢一致且健康的米槁掛果植株，除去地表凋落物和石塊等雜物，挖出土表0～20 cm處植株的側(cè)根，用抖落法收集米槁根際土，5棵樹的根際土樣等量混合后裝入滅菌塑封袋，做好標記(時間、地點、編號)，放入冰盒保存帶回實驗室后立即分離培養(yǎng)。

1.2 真菌的分離、純化及保存

根際土壤真菌分離采用孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基,培養(yǎng)基中加入適量青霉素和慶大霉素抑制細菌的生長，減少干擾。菌種純化采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，菌種采用30%甘油凍存液進行保存。采用稀釋平板涂抹法進行土壤真菌的分離，稱取10 g新鮮土樣，加入至盛有90 mL無菌水的500 mL已滅菌三角燒瓶中，在200 r/min下旋渦振蕩30 min充分混勻，稀釋為10-3、10-4、10-5濃度梯度接種于孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基平板上進行涂布培養(yǎng)，每份土樣3次重復(fù)，于28 ℃暗培養(yǎng)5 d，然后進行分離純化、計數(shù)，隨后用無菌牙簽將真菌挑出接種到PDA培養(yǎng)基中純化培養(yǎng)。

1.3 分離菌株DNA的提取、擴增及測序

1.3.1 DNA的提取 刮取PDA上純化培養(yǎng)14 d的真菌菌絲于無菌離心管中，采用石英砂進行研磨后，按照離心柱型真菌基因組DNA提取試劑盒(百泰克生物技術(shù)有限公司)的流程進行提取。

1.3.2 PCR擴增及測序 所用引物為真菌通用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′(天根生化科技北京有限公司)，進行PCR的擴增并將合格產(chǎn)物送至北京天根生化科技有限公司進行測序。PCR反應(yīng)體系為50 μL，其中，Master Max(Dye)為25 μL，DNA模板為5 μL，引物ITS1、ITS4均為2 μL，dd H2O為 16 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性2 min，變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進行30個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后于72 ℃延伸2 min，4 ℃保存，并用1%的瓊脂凝膠跑膠檢測是否擴增成功。

1.4 菌株鑒定

用透明膠帶于近菌落邊沿部分粘貼制片、顯微鏡下觀察產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，參考《真菌鑒定手冊》[22]對純化后的真菌進行初步形態(tài)學(xué)鑒定。隨后用測得到的ITS序列導(dǎo)入NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)進行BLAST比對分析[23]，從結(jié)果中挑選與待測菌株序列同源性最高(98%～100%)且已知分類地位的真菌菌株，定義序列相似性≥98%的菌株為相同分類單元(Operational taxonomic unit，OTU)，根據(jù)待測菌株的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果和序列分析鑒定待測菌株的種屬。

1.5 多樣性分析

1.5.1 真菌數(shù)量 每毫升樣品中菌落形成單位(CFU)=同一稀釋度3次重復(fù)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。

1.5.2 相對多度 分離到的某一真菌的菌株數(shù)占分離總的真菌菌株數(shù)的百分率，用來判定不同根際土壤樣品中可培養(yǎng)真菌的優(yōu)勢類群。真菌分離株數(shù)為每1 g干土中真菌的菌落數(shù)。

每1 g干土中真菌菌落數(shù)=同一稀釋度3次重復(fù)平板菌落數(shù)的平均數(shù)×稀釋倍數(shù)/接種量(mL)×(樣品含水量)

1.5.3 多樣性指數(shù) Shannom-Wiener 指數(shù)(H)：H=-∑(Pi)·(lnPi);

Simpson 優(yōu)勢度指數(shù)(D)：D=1-∑(Pi)2;

Pielou指數(shù)(J)：J=H/lnS;

Margalef 豐富度指數(shù)(R)：R=(S-1)/lnN

式中，Pi為第i種的多度比例，可表示為Pi=Ni/N，Ni為屬i的單菌落數(shù)量，N為根際土樣的所有菌株數(shù)之和；S為分類單元，為屬(種)i所在根際土壤中屬(種)的數(shù)目；N是總個體數(shù)，S代表每個樣品的物種總數(shù)。

1.5.4 Jaccard(Cj)相似性系數(shù) 用于比較米槁果實不同發(fā)育期之間根際土壤可培養(yǎng)真菌類群組成的相似程度，判定真菌分布差異程度。

式中，a和b分別為米槁果實不同發(fā)育期的土壤根際可培養(yǎng)真菌的物種數(shù)或?qū)贁?shù),j為兩個時期間共有的真菌種數(shù)或?qū)贁?shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 米槁果實發(fā)育不同時期根際的真菌數(shù)量

從圖1看出，分離出的真菌數(shù)量從高到低依次是膨大期﹥幼果期﹥成熟期，膨大期真菌為幼果期、成熟期的2倍。米槁幼果期根際土壤中真菌數(shù)量在納慶村、壩碰村和祥樂村分別為 1.0×105CFU/g、1.5×105CFU/g和 1.87×105CFU/g，以祥樂村中可培養(yǎng)真菌數(shù)量最多；在膨大期，各地可培養(yǎng)真菌數(shù)量達到峰值，在納慶村、壩碰村和祥樂村的根際土壤中真菌數(shù)量分別為 2.27×105CFU/g、3.27×105CFU/g和 2.6×105CFU/g，壩碰村中可培養(yǎng)真菌含量遠超過祥樂村和納慶村；成熟期納慶村、壩碰村和祥樂村的根際土壤中真菌數(shù)量分別為 7.67×104CFU/g、1.53×105CFU/g和 8.00×104CFU/g，納慶村和祥樂村土壤中的真菌數(shù)量相差不大，均低于壩碰村。

2.2 米槁果實根際可培養(yǎng)真菌群落組成

從米槁3個發(fā)育時期根際土壤中共分離529株真菌，根據(jù)菌落生長形態(tài)、孢子及菌絲的顯微結(jié)構(gòu)進行初步的鑒定，結(jié)合內(nèi)生真菌rDNA-ITS 測序，經(jīng)BLAST序列比對，鑒定為3門35科57屬111種(表1)。在門的水平上，米槁果實根際可培養(yǎng)真菌隸屬于子囊菌門(Ascomycota)、接合菌門(Zygomycota)及擔(dān)子菌門(Basidiomycota)。其中子囊菌門有100種，占真菌總種數(shù)的90.09%，為優(yōu)勢菌門；在科的水平上，優(yōu)勢菌科為肉座菌科(Hypocreaceae)和發(fā)菌科(Trichocomaceae)。

2.3 米槁果實發(fā)育不同時期根際可培養(yǎng)真菌組成差異

米槁果實發(fā)育3個時期中，幼果期分離真菌分屬31屬53種(圖2)，優(yōu)勢屬為叢赤殼屬(Nectria，11.90%)、螺旋聚孢霉屬(Clonostachys，9.52%)和木霉屬(Trichoderma，9.52%)；膨大期共分離真菌36屬64種，優(yōu)勢菌屬為木霉屬(16.99%)、青霉屬(Penicillium，16.34%)和叢赤殼屬(10.46%)；成熟期分離真菌16屬31種，種類明顯少于果實幼果期和膨大期，木霉屬(41.90%)為絕對的優(yōu)勢屬，其次是擬青霉屬(16.19%)和螺旋聚孢霉屬(8.57%)。隨著米槁果實不斷成熟，木霉屬的相對豐度越來越大，而鐮孢屬(Fusarium)呈相反的變化趨勢。

表1 米槁果實可培養(yǎng)真菌群落組成

續(xù)表1 Continued table 1

從圖3看出，米槁果實發(fā)育不同時期分離的真菌中，幼果期、膨大期和成熟期共有屬為8個，分別為叢赤殼屬、多胞菌屬(Pleosporales)、鐮孢屬、青霉屬、木霉屬、螺旋聚孢霉屬、曲霉屬(Aspergillus) 和擬青霉屬；幼果期與膨大期共有2屬，與成熟期共有3屬，膨大期與成熟期共有4屬。米槁果實發(fā)育不同時期的特有種中，成熟期21屬，幼果期18屬，膨大期2屬。說明不同果期間米槁根際真菌在物種組成上雖有較大差異，但在主要類群組成上又表現(xiàn)出一定的穩(wěn)定性。

2.4 米槁根際可培養(yǎng)真菌在果實不同發(fā)育時期的多樣性

從表2看出，3個不同時期根際可培養(yǎng)真菌群落OTU數(shù)、多樣性指數(shù)(H)、優(yōu)勢度指數(shù)(D)、豐富度指數(shù)(R)和均勻度指數(shù)(J)均表現(xiàn)為膨大期﹥幼果期﹥成熟期。果實膨大期各指數(shù)均為最大，幼果期的優(yōu)勢度指數(shù)(D)和均勻度指數(shù)(J)數(shù)值與膨大期相近，成熟期各指數(shù)在數(shù)值上遠小于膨大期與幼果期，說明根際土壤真菌群落組成多樣性隨著果實發(fā)育進程的遞進逐漸發(fā)生變化，成熟期根際真菌群落多樣性最低，物種組成較幼果期、膨大期單一。根據(jù)Jaccard相似性原理： 當Cj為0.00～0.25 時為極不相似，Cj為0.25～0.50時為中等不相似，Cj為0.50～0.75時為中等相似，當Cj為0.75～1.00時為極相似。從表3可知，米槁果實發(fā)育的3個不同時期，根際真菌群落相似性系數(shù)在0.2500～0.5000，幼果期和膨大期為0.2885，幼果期和成熟期為0.3429，膨大期和成熟期為0.3333，說明3個果期間真菌群落組成中等不相似，群落分布存在明顯差異。

表2 米槁果實發(fā)育不同時期根際可培養(yǎng)真菌群落組成多樣性指數(shù)

表3 米槁果實發(fā)育不同時期根際可培養(yǎng)真菌的相似性系數(shù)

3 討 論

真菌在生態(tài)系統(tǒng)中起著重要的作用，能與大多數(shù)植物形成共生體，提高植物體對養(yǎng)分的吸收[24]，促進植物的生長[25]。同時，部分病原菌的存在會導(dǎo)致植株感病，降低植物產(chǎn)量，危及植物生存[26]。本研究從米槁根際土壤中共分離出529株真菌，經(jīng)形態(tài)特征和分子鑒定隸屬于3門35科57屬111種。其中，幼果期真菌數(shù)為4.37×105CFU/g，膨大期為8.14×105CFU/g，成熟期為3.10×105CFU/g，表明米槁根際蘊含豐富的可培養(yǎng)真菌，物種多樣性較高且菌株數(shù)量豐富。子囊菌門(Ascomycota)為優(yōu)勢菌門，這與董林林等[27]對人參根際真菌的研究結(jié)果一致。隨著米槁果實的發(fā)育，根際可培養(yǎng)真菌群落數(shù)量及組成存在一定的差異，在幼果期共分離出31屬53種，膨大期為36屬64種，成熟期為16屬31種，優(yōu)勢屬及其相對多度明顯不同。米槁果實發(fā)育初期至成熟的整個階段，根際可培養(yǎng)真菌數(shù)量表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢，真菌群落多樣性指數(shù)(H)、優(yōu)勢度指數(shù)(D)、豐富度指數(shù)(R)和均勻度指數(shù)(J)均表現(xiàn)為膨大期﹥幼果期﹥成熟期。膨大期分離得到的真菌數(shù)量最多，明顯高于幼果期和成熟期，與杜宣延等[28-29]對不同生長期烤煙、大豆根際土中真菌數(shù)量動態(tài)變化的研究結(jié)論一致，這可能與米槁在幼果期和成熟期階段(6—9月)受病害的嚴重程度有著緊密的聯(lián)系[16]。前人研究[30]表明，鐮孢屬真菌(Fusarium)是導(dǎo)致米槁根腐病和新葉黑腐病的病原真菌。本研究中，鐮孢屬真菌在幼果期、膨大期遠高于成熟期，該病原真菌在這兩階段的大量繁殖可能是導(dǎo)致成熟期真菌數(shù)量下降的主要原因之一。其次，從幼果期到成熟期，土壤中營養(yǎng)物質(zhì)含量逐漸降低，土壤真菌養(yǎng)分供應(yīng)相對減少，真菌生長繁殖及代謝活性受到一定的限制[31]，成熟期土壤中可培養(yǎng)真菌數(shù)量也明顯下降。而病原拮抗菌木霉屬在成熟期卻快速繁殖，為成熟期的絕對優(yōu)勢菌屬。

成熟期各多樣性指數(shù)均低于膨大期與幼果期，可能還與幼果期、膨大期果實自身發(fā)育較快地代謝速率有關(guān)。8月是米槁生長發(fā)育旺盛期[16]，此期溫度的上升、降雨量增多更利于真菌孢子萌發(fā)與植物根系殘體分解。根系分泌物的增加豐富了真菌生長繁殖所需要的營養(yǎng)物質(zhì)來源，因而膨大期根際真菌種類增加，群落組成較復(fù)雜。幼果期、膨大期也是果實的藥用成分迅速累積階段，需根際多種真菌共同參與調(diào)節(jié)[32]。微生物生存環(huán)境的差異影響其群落構(gòu)成[33]，根據(jù)Jaccard 相似性系數(shù)結(jié)果顯示，米槁生長發(fā)育不同期間真菌群落組成中等不相似，群落分布存在明顯差異。同時研究還發(fā)現(xiàn)，在米槁果實各個發(fā)育期，根際土壤真菌的優(yōu)勢菌群有所差異，推測這是由于某一類群真菌與土壤某些養(yǎng)分相互偏好性選擇的結(jié)果[34]。土壤中各養(yǎng)分含量隨著果實的成熟發(fā)生波動，吸引不同類群的真菌附集于根際周圍，誘導(dǎo)優(yōu)勢菌群發(fā)生改變。

4 結(jié) 論

米槁根際土壤中蘊含著豐富的可培養(yǎng)真菌。分離出來的529株真菌中，包含3門35科57屬111種。其中，子囊菌門(Ascomycota，90.09%)為優(yōu)勢菌門，優(yōu)勢菌科為肉座菌科(Hypocreaceae，11.71%)和發(fā)菌科(Trichocomaceae，20.72%)，優(yōu)勢菌屬為肉座菌科(Hypocreaceae)中的木霉屬(Trichoderma，10.81%)和青霉屬(10.81%)。在米槁果實不同發(fā)育時期，其真菌群落組成存在一定差異，幼果期、膨大期的真菌多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)、均勻度指數(shù)都明顯高于成熟期。相關(guān)性分析表明，不同果期的可培養(yǎng)真菌存在差異，為中等不相似。從米槁根際土壤中分離培養(yǎng)的111種真菌中，木霉屬可拮抗植物病原菌，適應(yīng)性廣、抗菌機制多樣且抗菌譜廣，是米槁果實不同發(fā)育時期的共有屬和優(yōu)勢屬，在成熟期其相對豐度可達41.90%，較大程度地抑制了病原菌鐮孢屬(Fusarium)的進一步繁殖，在利用其作為米槁生防菌以實現(xiàn)藥材產(chǎn)量和質(zhì)量提升上具有廣闊的應(yīng)用前景。