劉曉輝，郎洪彥，譚成成，張鵬舉，王偉霞，樸慶林，李信濤

（吉林省農(nóng)業(yè)科學院動物生物技術(shù)研究所，吉林 公主嶺 136100）

吉林馬是利用引進前蘇聯(lián)重型馬（阿爾登、蘇重挽、弗拉基米爾等）和輕型馬（頓河、蘇高血、卡巴金等）與本地馬雜交改良，經(jīng)過28年的聯(lián)合育種，于1978年成功培育出的挽乘兼用型和重挽型馬的新品種［1］。馬人工授精技術(shù)在中國始于20世紀30年代，具有加速品種改良、提高種馬利用效率、減少疾病傳播和提高經(jīng)濟效益等優(yōu)點［2］。馬產(chǎn)業(yè)發(fā)達的國家利用精液低溫保存和冷凍保存技術(shù)達到高效利用種公馬、跨地區(qū)進行品種改良的目的［3］。近年來，隨著中國馬肉、酸馬奶等特色產(chǎn)業(yè)市場需求增大，馬產(chǎn)業(yè)得到快速發(fā)展［4-6］，但馬產(chǎn)業(yè)發(fā)展過程中存在種公馬新鮮精液保存時間短、冷凍精液受胎率低等問題。目前，仍然主要依靠自然交配及鮮精人工輸精完成配種工作。精液體外保存時間過短，限制了良種公馬種質(zhì)資源的輻射范圍。采用低溫保存新鮮精液不僅可以有效避免種公馬精液的浪費，提高種公馬的使用效率，還可以代替冷凍精液在一定范圍內(nèi)實現(xiàn)跨區(qū)域品種改良［7］。

精液的低溫保存是將稀釋后的精液保存在0? 5℃，可保存數(shù)天而不喪失受精能力。其原理是利用低溫來抑制精子活動，降低精子代謝和運動所需的能量消耗。低溫條件下還可以抑制有害物質(zhì)的生長，延長精子的存活時間。當溫度回升后，精子又逐漸恢復正常代謝機能而不喪失受精能力。低溫保存的新鮮精液可以提高優(yōu)良種公馬的利用率，加速品種改良進程［8］。

本試驗對吉林馬精液在低溫（4℃）保存下精子運動特性變化開展研究，并對人工授精后母馬情期受胎率進行試驗，以期為后續(xù)更深入提高吉林馬種公馬科學合理利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

種公馬來自吉林省松原市欣興牧業(yè)馬場。選擇4匹4?12歲成年種公馬，要求體格健康無疾病，繁殖性能良好為試驗用馬，按《種公馬飼養(yǎng)標準》（DBN654000/T216—2015）要求方法飼養(yǎng)。采精時間為每年4—7月，每匹種公馬每周采精2次。選擇吉林馬母馬150匹，母馬年齡為4?10歲，體格健康無繁殖疾病，發(fā)情周期正常，每天保證充足的飼草、飲水和光照。

1.2 主要試劑及儀器

果糖、Tris、檸檬酸購自生工生物工程（上海）股份有限公司，青霉素和鏈霉素為獸用商店購買，卵黃液為實驗室自備。

離心機（型號為TDL80-2D），購自上海安亭科技儀器廠；鼓風干燥箱（型號為PH-140A），購自上海一恒科學儀器有限公司；邁朗全自動精子分析儀（型號為ML-210JZ），購自南寧松景天倫生物科技有限公司；一次性輸精管（廣西蔣氏動物用品有限公司）、一次性子宮角輸精管（上海卡蘇生物科技有限公司）。

1.3 精液制備

1.3.1 馬精液稀釋液的配制準確稱取Tris 3.028g、檸檬酸1.692 g、果糖1.25 g，加入去離子水充分溶解，煮沸室溫冷卻后，4℃保存。酒精棉球擦拭蛋殼表面消毒，去除蛋清，刺破卵黃膜，收集卵黃液體?；A液40 mL+卵黃液10 mL+雙抗配制成馬精液稀釋液，置于37℃水浴鍋中備用。

1.3.2 精液的采集和處理采精時，用溫水清洗種公馬陰莖，挑選性情溫順的發(fā)情母馬作臺馬或使用假臺馬。采精人員安裝好假陰道，固定好集精杯，通過注水口灌注40℃左右的溫水，檢查密閉性，采精時保證水溫為38?40℃。待公馬爬跨時，采精人員迅速站到臺馬右后側(cè)，將陰莖導入假陰道內(nèi)完成采精。采精后，將集精杯緩緩向下傾斜，打開放氣閥門，取下集精杯，迅速送至精液處理室，用滅菌紗布過濾精液并統(tǒng)計采精量。原精顏色為不透明乳白色，無異常氣味，精子活力達到0.6以上，密度在1.0×109個/mL左右的精液才能使用。

1.3.3 精液的稀釋和保存將采集的新鮮精液用稀釋液進行1∶1稀釋，室溫條件下2 000 r/min離心10min棄去上清液，添加38℃的稀釋液，輕輕搖勻，分裝于15 mL離心管中。留當天用于人工授精的精液，其余精液用脫脂棉或紗布纏裹置于低溫（4℃）下保存，每隔12 h輕輕混勻精液1次。

1.4 精子運動參數(shù)檢測

在24、48、72、96、120 h時將保存的精液于38℃水浴中復蘇3 min，然后用全自動精子分析儀檢測精子總活力、直線前進活力、平均運動速率。在檢測腔室中隨機選取3個不同視野，每個視野精子數(shù)量不少于300個精子，每次重復檢驗3次，試驗重復5次。

1.5 人工授精

通過直腸檢查法檢測母馬發(fā)情狀況，每天進行1次發(fā)情排卵鑒定。由熟練掌握輸精技術(shù)人員進行人工輸精，所有人工授精試驗中使用的精液體積為10 mL。母馬每次人工授精使用的精液來自單匹種公馬，不得使用混合精液，記錄每次輸精時間、母馬及對應的種公馬編號等信息。

1.6 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，均用“平均值±標準差”（Mean±SD）表示，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫（4℃）下不同保存時間對吉林馬精子活力的影響

由圖1可知，4℃保存的吉林馬運動精子活力分別為從0 h的88.7%下降到120 h的40.3%；前向運動精子活力從0 h的78.3%下降到120 h的31.8%；保存24、48和72 h的精子平均路徑速度及快速運動精子活力與0 h相比差異不顯著（P＞0.05），而保存96 h和120 h的精子平均路徑速度及快速運動精子活力與0 h相比差異顯著（P＜0.05）。

圖1 低溫（4℃）保存不同時間吉林馬精子運動特性統(tǒng)計結(jié)果

2.2 低溫（4℃）下不同保存時間對吉林馬人工授精情期受胎率的影響

由表1可知，4℃下保存0、24、48、72、96、120 h的吉林馬精子，人工授精后母馬情期受胎率分別為43.33%、44.00%、44.45%、43.48%、20.00%和10.00%。精子4℃下保存24、48和72 h時母馬情期受胎率與0 h差異不顯著（P＞0.05），但保存96 h和120 h母馬情期受胎率與0、24、48、72 h差異顯著（P＜0.05）。

表1 吉林馬母馬人工授精情期受胎率

3 討論

隨著低溫保存時間的增加，精子形態(tài)發(fā)生改變［9，10］，畸形率會顯著增加［11］。溫度變化引起的畸形休克可能導致精子膜損傷，活力、DNA完整性、活性氧類產(chǎn)生和頂體的變化，從而降低精子的存活率和受精能力。關于精子低溫保存過程中運動能力的下降在牛［12］、羊［13］、豬［14］、驢［15］、雞［16］等動物的相關研究已有報道。在低溫保存前將精液進行稀釋可以減少精子受到損傷從而延長精子存活時間。理想的稀釋液是保障低溫保存效果和人工授精技術(shù)順利實施的關鍵。精液稀釋液含有糖類、緩沖物質(zhì)、抗冷凍劑等物質(zhì)，糖類可為精子存活和維持運動能力提供能量，維持精子質(zhì)膜穩(wěn)定性。緩沖物質(zhì)可防止精液pH發(fā)生巨變，維持酸堿平衡，穩(wěn)定精子的生存環(huán)境，防止精子因酸性過強而死亡。結(jié)果表明，使用檸檬酸-果糖-Tris-甘油-卵黃為稀釋液，低溫保存24、48和72 h，吉林馬精子活力和情期受胎率差異不顯著（P＞0.05），該稀釋液可以用于馬精液的低溫保存，在生產(chǎn)中可以推廣應用。

人工授精技術(shù)是影響馬情期受胎率的重要因素。準確掌握母馬發(fā)情排卵時間，做到適時輸精，是提高受胎率的重要環(huán)節(jié)。此外，輸精方式及一次輸精輸入的有效精子數(shù)量也是影響母馬受胎率的重要因素。精子和卵子結(jié)合完成授精的部位是輸卵管的壺腹部，輸入子宮的精子需要一定的時間才能到達輸卵管壺腹部。研究表明，驢人工授精輸入精液體積10?15 mL，有效精子數(shù)量6億?8億個的情期受胎率顯著高于2億個。同時，Oliveria等［17，18］研究了冷凍精液不同輸精方式對母驢情期受胎率的影響，子宮體輸精方式情期受胎率為0%，而子宮角輸精方式情期受胎率為28.26%。楊莉等［19］研究了新鮮精液不同輸精方式對母驢情期受胎率的影響，子宮體輸精方式情期受胎率為33.33%，而子宮角輸精方式情期受胎率為45.16%。付靜濤等［20］研究了常規(guī)輸精和深部輸精對馬情期受胎率的影響，子宮角深部輸精情期受胎率為65.72%，而子宮體常規(guī)輸精情期受胎率為56.13%。說明子宮角深部輸精能顯著提高母馬情期受胎率，可能是由于精子到達輸卵管壺腹部需要消耗大量的能量，子宮角深部輸精縮短了精子的運動距離，降低了能量消耗，從而能夠提高母馬的受胎率。本研究表明精子低溫保存時間越長，其平均運動速率下降，人工授精后母馬的情期受胎率顯著下降。人工授精輸精方式及一次輸精的有效精子數(shù)量對母馬的情期受胎率有很大影響，但關于低溫保存的精子與不同輸精方式及有效精子數(shù)量對情期受胎率的影響還需要進一步研究。

4 結(jié)論

吉林馬精液低溫（4℃）保存會降低精子的運動性能，隨著時間的延長吉林馬精子的活力會逐漸降低，進而導致受胎率的下降。在實際生產(chǎn)中，吉林馬精液低溫（4℃）保存不超過72 h，人工授精后對母馬情期受胎率影響較小，對吉林馬乃至整個馬業(yè)生產(chǎn)具有重大意義。