汪潤民，張曉東，徐成華，于丹丹，余冉

（1 東南大學(xué)能源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 211189；2 江蘇省地質(zhì)礦產(chǎn)局第一地質(zhì)大隊，江蘇 南京 210041）

隨著石化工業(yè)的發(fā)展，石油對水生和陸地環(huán)境的污染受到廣泛關(guān)注。疏水性的石油烴在水面形成油膜，阻斷大氣與溶解性氣體的交換，破壞水生生態(tài)系統(tǒng)。石油中的重質(zhì)組分，如膠質(zhì)、瀝青質(zhì)等會破壞土壤結(jié)構(gòu)，分散土粒，降低土壤的透水性，改變土壤水分運(yùn)動狀況的同時，降低土壤有效磷、氮的含量。此外，環(huán)境中石油的積累會導(dǎo)致人體嚴(yán)重致癌、致畸和基因突變，并導(dǎo)致多種并發(fā)癥。故石油污染治理一直受到高度關(guān)注。

石油污染場地的修復(fù)方法主要分為物理法、化學(xué)法和生物法。物理法主要包括攔截、吸附和萃取等。物理法具有回收率高的優(yōu)點(diǎn)，但其處理成本過高，對環(huán)境的破壞不容忽視。化學(xué)法通過添加消油劑、凝油劑、表面活性劑等實(shí)現(xiàn)石油的乳化分解并結(jié)合化學(xué)氧化等技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)石油污染物的完全去除。然而處理過程中使用的化學(xué)藥劑會帶來二次污染，對原生環(huán)境造成較嚴(yán)重的破壞。生物法主要是通過向污染區(qū)域添加石油降解菌劑或生物刺激劑，結(jié)合對目標(biāo)場地環(huán)境條件的調(diào)控，利用微生物的代謝活動實(shí)現(xiàn)石油污染物的降解。近年來，生物法以其環(huán)境友好、成本低、高效等特點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。在國內(nèi)，微生物修復(fù)技術(shù)在勝利油田、遼河油田和吉林油田污染場地進(jìn)行的工程應(yīng)用便累計處理超120kt 污染土壤，取得了巨大的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益，故石油污染場地的微生物修復(fù)技術(shù)具有良好的修復(fù)效果及應(yīng)用前景。

石油由飽和烴、芳香烴、膠質(zhì)、瀝青質(zhì)四種組分構(gòu)成。重質(zhì)石油（以下簡稱重油）是相對密度大于0.9 的石油，其中的膠質(zhì)和瀝青質(zhì)含量較高，造成重油黏度大且降解困難。傳統(tǒng)石油污染場地修復(fù)相關(guān)研究中研發(fā)的生物菌劑一般為高效石油降解單菌，或是單菌復(fù)配的混合菌群；目標(biāo)污染物大多為汽油、柴油或芳烴等分子量相對較小的污染物。Lucia 等在墨西哥灣的含油污泥中篩得菌株sp.對原油中的芳烴餾分具有明顯的降解作用。張小梅等從大慶油田的含油污泥中篩選出一株既分泌表面活性物質(zhì)又能降解總石油烴的菌株，可降解油泥中約70%的總石油烴。然而，基于石油成分的復(fù)雜性，單一菌株對污染物質(zhì)生物降解難易程度差別大、生物降解路徑很難明確，并可能產(chǎn)生具有環(huán)境毒性的中間產(chǎn)物；此外不同的細(xì)菌生長的最適溫度、pH、鹽度、對石油的各個組分的毒性耐受性等均存在一定差異。與單一細(xì)菌相比，混合菌群因為其催化酶的多樣性。可對難降解成分實(shí)現(xiàn)協(xié)同降解。此外，混合菌群還可以在不斷變化的環(huán)境中保持高效的生物降解能力。故獲得可廣譜降解所含石油組分及其降解中間產(chǎn)物的高效石油降解混合菌劑尤為重要。目前，已有研究者開展了關(guān)于未經(jīng)純化的混合菌群的效果研究，如Duc 等通過將假單胞菌和葡萄球菌混合培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)對硫丹的厭氧降解，效率從20%提升到34%。Zhao等證實(shí)混合菌群中微生物的協(xié)同作用可以增強(qiáng)混合菌群的穩(wěn)定性和耐受性，提升高pH 污泥脫硫性能。Li等研究發(fā)現(xiàn)，真菌和污染土壤中菌群的協(xié)同代謝可以明顯提高土壤中萘的降解效率。左麗敏等在江漢油田石油污染土壤中馴化出了以石油為唯一碳源的微生物混合菌群，并在35 天內(nèi)降解了30%的石油。但有關(guān)混合菌劑對不同石油組分尤其是重油組分的降解潛力以及降解過程中混合菌劑的優(yōu)勢功能菌組成變化規(guī)律的相關(guān)研究仍相對缺乏。本研究通過構(gòu)建重油降解高效混菌，根據(jù)降解不同時段的菌群結(jié)構(gòu)變化，從而確定降解過程不同階段的主要功能菌屬；同時通過降解前后石油組分內(nèi)結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)的變化，評價混合菌群的降解性能。

1 實(shí)驗試劑及方法

1.1 實(shí)驗樣品及培養(yǎng)基

降解實(shí)驗所用菌種來源于實(shí)驗室前期已馴化完成的石油降解混合菌群SD、GS、JS（實(shí)驗室前期從源于山東東營、江蘇徐州及甘肅重油污染土壤馴化而來的混合菌群）及本次從青島某油井污染土壤中馴化得到的混合菌群QD；實(shí)驗用石油來自江蘇某油田，膠質(zhì)與瀝青質(zhì)總質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為30%，相對密度0.91，屬重油。

試驗用菌群富集培養(yǎng)基（MM1）：MgSO·7HO 0.5g/L、KHPO1.5g/L、KHPO2g/L、NHCl 1.2g/L，石油2%、pH 6.5～7、微量元素液1mL/L ；石油降解試驗培養(yǎng)基：MgSO·7HO 0.5g/L、KHPO1g/L、KHPO2g/L、NHCl 1.2g/L，石油0.5%、pH 7～7.5、微量元素液（組成為CaCl2g/L、FeSO1g/L、CuSO1g/L、 ZnSO0.05g/L、 MnSO0.05g/L）1mL/L。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 QD/QM高效重油降解混菌的馴化培養(yǎng)

稱取20g 污染土壤于30mL 富集培養(yǎng)基，于30℃、150r/min 下混合培養(yǎng)50 天，每隔7～10 天補(bǔ)充20mL 富集培養(yǎng)基。靜置取50mL 上層菌液，在8000r/min 下離心5min，去除上清液，用相同體積的無菌PBS重懸后4℃保存。QM混合菌群由四種混菌菌液（OD=0.6）以體積比為1∶1∶1∶1 混合后，量取5mL 加入100mL 滅菌MM1 培養(yǎng)基中，在30℃、150r/min 條件下進(jìn)行2～3 個周期，每個周期50～60天的恒溫馴化培養(yǎng)。

1.2.2 重油降解試驗搭建

分別向2 組100mL 的滅菌MM1 培養(yǎng)基中加入5%OD=0.6的QD混菌或QM混菌菌液，以無菌培養(yǎng)液為空白組，30℃、150r/min恒溫培養(yǎng)，每隔5～8 天平行取3 個樣品檢測石油降解率。石油降解率測定方法采用GB/T 5750.7—2006《水中石油類物質(zhì)檢測方法——重量法》進(jìn)行檢測。

1.2.3 石油族組分層析分析

石油中包含四類組分：飽和烴（飽和分）、芳香烴（芳香分）、膠質(zhì)和瀝青質(zhì)。將重量法測定后的石油樣品用于族組分層析實(shí)驗，層析實(shí)驗方法參照SY/T 5119—2016《巖石中可溶有機(jī)物及原油族組分分析》。試樣中各族組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)按照式(1)計算。

式中，為稱量瓶+族組分+空白值的質(zhì)量，g；為稱量瓶質(zhì)量，g；為空白值，g；為試樣質(zhì)量，g；X分別表示飽和烴、芳烴、膠質(zhì)和瀝青質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3 紅外光譜分析

使用Nicolet iS10 傅里葉變換紅外光譜儀（美國Thermo fisher）進(jìn)行石油組分紅外光譜分析。通過壓片法制備直徑為13mm、厚度為1mm的固體試樣透明薄片，置于夾持器中；將夾持器放入儀器的試樣吸收池位置，起始透光率＞20%時，即可進(jìn)行測量；通過譜圖中的特征峰及振動變化確定石油中的特征組分及結(jié)構(gòu)的變化。

1.4 菌群分析鑒定

使用E.Z.N.A.soil DNA kit （Omega Bio-tek,Norcross, GA, U.S.） 進(jìn)行樣品總DNA 抽提，使用1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的提取質(zhì)量，使用NanoDrop2000 測定DNA 濃度和純度；使 用 338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和 806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) 對16S rRNA 基因V3-V4 可變區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，每個樣本3 個重復(fù)；利用Illumina 公司的NovaSeq PE250平臺進(jìn)行測序。

使用fastp（version 0.20.0）軟件對原始測序序列進(jìn)行質(zhì)控，使用FLASH（version 1.2.7）軟件進(jìn)行拼接：使用UPARSE軟件（version 7.1），根據(jù)97%的相似度對序列進(jìn)行OTU聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier（version 2.2）對每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對Silva 16S rRNA 數(shù)據(jù)庫（version 138），設(shè)置比對閾值為70%。

2 結(jié)果與討論

2.1 混合菌群的篩選及鑒定

從青島某油井污染土壤中富集獲得菌群QD 并進(jìn)行了長達(dá)半年的以重油為唯一碳源的連續(xù)強(qiáng)化馴化，并將強(qiáng)化后的QD菌群與前期所獲JS、SD、GS標(biāo)準(zhǔn)富集菌液（OD=0.6）以體積比1∶1∶1∶1的比例混合（本文只研究等比例復(fù)配條件下的重油降解，有關(guān)混合比例對重油降解的影響有待后續(xù)研究），得到混合菌群QM。QM混合菌群生長周期約為14 天，培養(yǎng)12～14 天時生物量可達(dá)到最大值，約為4×10CFU/mL，如圖1所示。

圖1 QM菌密度與OD600值線性關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線與其生長曲線

在重油降解過程中，分別在不同階段對QM混合菌群進(jìn)行采樣分析，降解實(shí)驗前期（10天）、中期（30天）及后期（50天）?；旌暇旱亩鄻有灾笖?shù)如表1所示。在重油降解實(shí)驗的整個過程中，混合菌群的多樣性及均一性水平總體穩(wěn)定。隨著降解時間的延長，菌群ace 指數(shù)與chao 指數(shù)逐漸增大，表明隨著降解實(shí)驗的進(jìn)行，混合菌群豐度不斷增大。生物降解各階段優(yōu)勢菌屬如表2所示，優(yōu)勢菌屬相對及絕對豐度差異如圖2(a)、(b)所示。在重油生物降解前期，占主導(dǎo)地位的菌屬為、、等；而隨著反應(yīng)時間的延長，及屬細(xì)菌的豐度逐漸升高。在石油降解及石油污染土壤生物修復(fù)的過程中均被證實(shí)可起到重要作用，尤其在汽柴油污染土壤中其豐度優(yōu)勢明顯；對石油中的重質(zhì)或難降解組分具有長期緩慢的降解效用；具有較強(qiáng)的耐受石油污染的能力，而可產(chǎn)生表面活性劑，有助于石油，尤其是多環(huán)芳烴菲的降解。 綜 合 推 測 ，及屬的細(xì)菌在石油重質(zhì)組分及難降解組分的降解中或起主要作用。

圖2 重油生物降解不同階段QM降解菌群優(yōu)勢菌屬豐度差異（前15種）

表1 QM混合菌群多樣性指數(shù)

表2 重油生物降解各階段優(yōu)勢菌屬（＞5%）

2.2 混合菌群重油降解分析

分別使用連續(xù)強(qiáng)化馴化前后的QD 菌群及QM菌群開展重油降解研究。重油在降解過程初期附著于瓶底；隨著時間的推移，部分石油以油滴的形式分散到菌液中，到40～50天后，菌液逐漸變成淡黃色，菌液中的油滴量明顯逐漸變小。

強(qiáng)化馴化前后的QD 菌群及QM 菌群對重油石油50天的降解效率如圖3所示。三種混菌均對試驗用重油具有降解效果，重油降解率總體隨反應(yīng)時間延長而增加。在50天內(nèi)，強(qiáng)化培養(yǎng)前的QD混合菌群僅能去除25.42%±2.12%的重油，強(qiáng)化后的QD混合菌群則可去除41.57%±1.08%的重油，而QM混合菌群在20 天內(nèi)即可去除42.31%±3.51%的重油，50 天時可去除53.48%±2.89%的重油。表明強(qiáng)化連續(xù)馴化培養(yǎng)可以有效的提升混合菌群的重油降解效果，而進(jìn)行菌群復(fù)配后的混合菌群在進(jìn)一步提升重油降解效果的基礎(chǔ)上，還可以實(shí)現(xiàn)更加高效的重油降解。故推測連續(xù)培養(yǎng)過程同時也是混合菌群的定向馴化過程，促使菌群結(jié)構(gòu)向有利于重油降解的方向進(jìn)化。

圖3 連續(xù)培養(yǎng)前后的QD混菌及四合一混合菌群（QM）的重油降解率

為了研究菌群對石油各族組分的降解，對強(qiáng)化后的QD 菌群及QM 混合菌群降解的石油樣品進(jìn)行族組分分析（圖4）。結(jié)果顯示，就輕質(zhì)組分來說，50天時，強(qiáng)化QD菌群及QM菌群分別可實(shí)現(xiàn)46.93%、73.71%的飽和烴組分降解以及40.83%、53.17%的芳香烴組分降解。同時，對兩種混合菌群的石油族不同組分的降解效率進(jìn)行相關(guān)性分析（表3）發(fā)現(xiàn)，樣品中飽和烴及芳香烴含量與時間均成顯著負(fù)相關(guān)。QM 菌群及強(qiáng)化QD 菌群均能實(shí)現(xiàn)對輕質(zhì)組分的有效降解，且QM菌群的降解效率及降解效果均明顯優(yōu)于強(qiáng)化QD菌群。

表3 降油菌群作用下各組分質(zhì)量與時間的相關(guān)系數(shù)及50d降解率

圖4 混合菌群對石油族不同組分隨時間的降解情況

就難降解的重質(zhì)組分來說，強(qiáng)化QD 混合菌群降解樣品中膠質(zhì)含量與時間成顯著負(fù)相關(guān)，瀝青質(zhì)含量與時間無明顯相關(guān)關(guān)系，而QM混合菌群降解樣品中的結(jié)果恰恰相反。強(qiáng)化QD混合菌群可以實(shí)現(xiàn)對36.15%膠質(zhì)的有效降解而不能實(shí)現(xiàn)對瀝青質(zhì)的有效降解，而QM 混合菌群可以實(shí)現(xiàn)對25.56%±5.40%的瀝青質(zhì)的有效降解而不能實(shí)現(xiàn)對膠質(zhì)的有效降解。這可能是因為QM混合菌群在有限時間內(nèi)僅將重質(zhì)組分降解為結(jié)構(gòu)更為簡單的短鏈烴，對膠質(zhì)、飽和烴和芳香烴組分進(jìn)行了“補(bǔ)充”。

2.3 混合菌群重油降解性能評價

選取QM 混合菌群降解石油過程中0、30 天、50 天的樣品進(jìn)行層析和傅里葉紅外光譜分析（圖5）。結(jié)果顯示，混合菌群在實(shí)現(xiàn)簡單結(jié)構(gòu)的降解之外，在難降解有機(jī)物的活化及輕量化過程中存在明顯的積極作用。2930cm、2850cm為—CH—的伸縮振動吸收峰，460cm、1380cm為—CH—的面內(nèi)彎曲振動吸收峰。在飽和烴降解過程中烷基吸收峰的高度降低，表明脂肪烴甲基、亞甲基的降解是重油降解的一種重要途徑；在芳香烴、膠質(zhì)和瀝青質(zhì)中烷基吸收峰的高度逐漸升高，且在降解中后期尤為明顯，表明重油降解過程會導(dǎo)致芳香烴、膠質(zhì)、瀝青質(zhì)的飽和度增大，直接表現(xiàn)為苯環(huán)的開環(huán)。1000～650cm的區(qū)域為C—H 面外彎曲振動區(qū)，為苯環(huán)取代基特征振動吸收峰。如圖5(b)～(d)所示，芳香烴及膠質(zhì)組分在重油降解過程中后期出現(xiàn)了明顯的吸收峰，表明苯環(huán)上取代基增多，混合菌群對苯環(huán)大Π 鍵有活化作用。1260cm、1120cm及1080cm為酯基和醚基特征吸收峰。降解實(shí)驗中后期芳香烴和膠質(zhì)中出現(xiàn)了降解前僅存在于瀝青質(zhì)中的酯基和醚基的特征吸收峰，表明混合菌群可實(shí)現(xiàn)含酯基及醚基的多環(huán)縮合環(huán)化合物的部分降解。綜上所述，除實(shí)現(xiàn)甲基、亞甲基等輕質(zhì)基團(tuán)的降解外，混合菌群還可能通過多環(huán)結(jié)構(gòu)的開環(huán)、活化及酯基醚基等特征基團(tuán)的輕量化等方式，提高難降解有機(jī)物的可降解性。

圖5 重油樣品紅外譜圖

3 結(jié)論

混合菌群的連續(xù)強(qiáng)化培養(yǎng)及混合菌群間的復(fù)配可顯著提高其重油降解能力?；旌暇篞M50天內(nèi)重油降解率可達(dá)53.48%±2.89%，瀝青質(zhì)降解率可達(dá)25.56%±5.40%，成功實(shí)現(xiàn)單菌難以達(dá)到、高效且穩(wěn)定的重油及重質(zhì)組分的降解。混合菌群中起主要降油作用的優(yōu)勢菌屬為、、、等且在降解過程不同階段中存在明顯差異， 其中、等菌屬的細(xì)菌或?qū)χ刭|(zhì)及難降解組分有著優(yōu)良的降解性能。QM混合菌群降油過程中改變了重油，尤其是重油重質(zhì)組分結(jié)構(gòu)，使重質(zhì)組分飽和度增大、多環(huán)結(jié)構(gòu)活化，顯著提升了重油的生物可降解性。