代世成， 王 歡， 江連洲

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030）

蛋白質(zhì)是具有一定空間結(jié)構(gòu)的生物大分子，是多肽鏈經(jīng)過盤曲折疊形成的物質(zhì)。人們每天飲食中的蛋白質(zhì)主要來源于瘦肉、蛋類、豆類及魚類。大豆是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，營養(yǎng)豐富，約含有40%蛋白質(zhì)，是一種重要的蛋白質(zhì)食品來源[1]。大豆中的大豆蛋白是一種重要的植物蛋白，因其營養(yǎng)價值高、產(chǎn)量高、優(yōu)良的生物相容性和加工特性，被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、農(nóng)業(yè)、生物技術(shù)等領(lǐng)域。大豆分離蛋白中的主要成分7S 蛋白和11S 蛋白的三維結(jié)構(gòu)式見圖1。前期研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)可以通過物理、化學(xué)和酶添加的方法進(jìn)行處理，以提高蛋白質(zhì)的功能特性。但是，這些方法都存在一定的缺陷。前兩種方法對反應(yīng)條件要求嚴(yán)格，能耗高，試劑特異性弱。此外，酶解過程中容易產(chǎn)生苦味肽，降低了蛋白質(zhì)的利用率[2]。因此，結(jié)合生物活性物質(zhì)（植物多酚）對蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾可能是一種合適的方法。

圖1 7S蛋白和11S蛋白的三維結(jié)構(gòu)式

多酚廣泛存在于植物中，具有極高的生物活性，被人們稱為“第七類營養(yǎng)素”。多酚類化合物是指分子結(jié)構(gòu)中有若干個酚羥基的植物成分總稱。常見的植物多酚如兒茶素、原花青素、姜黃素、槲皮素的結(jié)構(gòu)式如圖2 所示。多酚類物質(zhì)具有很強(qiáng)的抗炎、抗菌和抗氧化特性，能夠減少炎性反應(yīng)，在預(yù)防心血管疾病中發(fā)揮作用[3]。因此，人們對多酚作為功能性食品中的生物活性成分頗感興趣。有大量研究表明，多酚能與蛋白質(zhì)結(jié)合改變蛋白質(zhì)和多酚的結(jié)構(gòu)及其功能性質(zhì)[4]。

圖2 常見植物多酚的結(jié)構(gòu)式

近年來，隨著對功能性復(fù)合食品需求的增加，多酚類物質(zhì)對蛋白質(zhì)功能特性的影響研究成為熱點[5]。蛋白質(zhì)和多酚是重要的食物成分，二者之間的相互作用對食品的生產(chǎn)和營養(yǎng)價值起著重要作用，這些相互作用對二者的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)會產(chǎn)生極大的影響，為了更好地了解及闡述大豆蛋白與植物多酚的相互作用，文中綜述了大豆蛋白與植物多酚發(fā)生相互作用對二者結(jié)構(gòu)和功能的影響，并列舉了一些表征二者相互作用的常用方法。這對于大豆蛋白-多酚復(fù)合物在食品加工和應(yīng)用中提供了參考，具有重要意義。

1 大豆蛋白與植物多酚的相互作用

大豆蛋白與多酚可以在不同條件下（pH，酶的添加，自由基的引入）發(fā)生相互作用，包括可逆的和不可逆的相互作用。在可逆的相互作用中，通常涉及非共價鍵，如氫鍵、疏水作用、靜電作用和范德華力。而在不可逆的相互作用中，大豆蛋白與多酚可在堿性條件下、酶的添加或自由基的引入時發(fā)生，形成共價鍵如C-N，C-S鍵[6]。

1.1 大豆蛋白與植物多酚非共價相互作用

大豆蛋白與多酚的非共價相互作用主要是蛋白質(zhì)上的氫原子受體和多酚的酚羥基結(jié)合形成氫鍵，蛋白質(zhì)上的某些氨基酸基團(tuán)或殘基也會和酚羥基或者苯環(huán)結(jié)合形成離子鍵、疏水作用、范德華力等[7]。圖3 所示為大豆分離蛋白（SPI）與兒茶素非共價作用機(jī)理，蛋白質(zhì)肽鍵上的氧原子和多酚的羥基之間可以形成氫鍵（a）。蛋白質(zhì)中的疏水氨基酸殘基可以通過疏水相互作用與多酚的非極性芳環(huán)結(jié)合（b）。并且在多酚和蛋白質(zhì)之間的靜電力中，蛋白質(zhì)上的正電荷基團(tuán)與多酚的負(fù)電荷羥基基團(tuán)相互作用（c）[8]。

圖3 SPI 與兒茶素的非共價相互作用機(jī)制

有研究表明，在很多情況下大豆蛋白與多酚的非共價相互作用中氫鍵和疏水在二者結(jié)合過程中起著重要作用，比如SPI 與表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）[2]，SPI 與兒茶素[7]，SPI 與茶多酚[9]。非共價相互作用對大豆蛋白和多酚結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)有一定影響。You等[2]發(fā)現(xiàn)EGCG的非共價修飾可以提高SPI 的功能特性，包括起泡、乳化和抗氧化性能。EGCG顯著改變了SPI 的二級和三級結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)了分子微環(huán)境的極性，并暴露更多的官能團(tuán)。Zhang等[10]發(fā)現(xiàn)花青素通過非共價作用可以顯著改變SPI 的二級結(jié)構(gòu)，形成的復(fù)合物改善了大豆蛋白產(chǎn)品的蛋白質(zhì)消化率和營養(yǎng)質(zhì)量，提高其在食品中的應(yīng)用。

1.2 大豆蛋白與植物多酚共價相互作用

圖4 是蛋白質(zhì)與多酚的共價相互作用機(jī)理，主要包括堿法、酶法和自由基接枝法，前兩種方法是多酚可以在堿性或者氧化酶存在的條件下，氧化生成醌類物質(zhì)，與蛋白發(fā)生親核加成反應(yīng)形成共價復(fù)合物（親核基團(tuán)包括氨基、巰基或者某些氨基酸殘基）。而自由基接枝法的原理是通過雙氧水和抗壞血酸的引入使體系內(nèi)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生的羥自由基進(jìn)攻蛋白質(zhì)側(cè)鏈的氨基酸殘基，生成一種活性中間產(chǎn)物，再與多酚形成共價鍵[8]。

圖4 蛋白質(zhì)與多酚的共價作用機(jī)理

與非共價相互作用相比，可能是由于共價作用不可逆，使得共價相互作用對大豆蛋白和多酚結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響更顯著。李楊等[11]發(fā)現(xiàn)在pH 7.4、2 h和pH 9.0、24 h處理條件下，SPI和花青素形成共價復(fù)合物的起泡性和乳化性顯著強(qiáng)于非共價復(fù)合物。代世成等[7]通過對比SPI與兒茶素的共價和非共價相互作用，發(fā)現(xiàn)在堿法下的共價相互作用對SPI的結(jié)構(gòu)影響更顯著，更大程度地提升了SPI的功能性質(zhì)，比如起泡性和抗氧化活性。

2 常見表征大豆蛋白- 植物多酚相互作用的方法

多酚與大豆蛋白結(jié)合的體系是非常復(fù)雜的，因此為了更好地表征復(fù)合物的性質(zhì)和相互作用僅僅用單一的分析方法是不夠的，往往要幾種分析方法聯(lián)用來分析復(fù)合物某一性質(zhì)或結(jié)構(gòu)變化。研究多酚與蛋白質(zhì)相互作用的方法有很多種，文中主要對電泳法、紫外-可見吸收光譜法、圓二色光譜法、傅里葉變換紅外光譜法、熒光光譜法、生物質(zhì)譜技術(shù)和分子對接技術(shù)（見附表）對多酚和蛋白質(zhì)相互作用的研究進(jìn)行探討，旨在為多酚與大豆蛋白相互作用的研究提供一定參考。

附表 表征蛋白質(zhì)-多酚相互作用的方法

2.1 電泳法

電泳法分為天然聚丙烯酰胺凝膠電泳（Nativepolyacrylamide gel electrophoresis，Native-PAGE）和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），是一種方便、快速、廉價的方法，通常用于確定蛋白質(zhì)和多糖、多酚等小分子的結(jié)合。

Native-PAGE是指電泳體系中未添加SDS和巰基乙醇等變性劑和還原劑的一種方法，由于在Native-PAGE處理過程中樣品是處于非變性狀態(tài)的，即仍保留蛋白質(zhì)本身的高活性，因此蛋白質(zhì)樣品或復(fù)合物樣品能保持原有的形狀和活性，電泳時蛋白的遷移率取決于蛋白的電荷和分子量，這有助于探究大豆蛋白和多酚結(jié)合后對大豆蛋白分子量的影響。而SDS-PAGE由于添加了SDS和巰基乙醇，SDS作為變性劑和助溶試劑，能破壞體系內(nèi)的非共價鍵。巰基乙醇作為強(qiáng)還原劑破壞二硫鍵。而大豆蛋白中含有多聚體，因此經(jīng)過SDS和巰基乙醇的處理，蛋白質(zhì)樣品會被完全還原成單體甚至是更小的亞基。SDS與蛋白質(zhì)樣品結(jié)合后會降低或消除蛋白質(zhì)分子之間的電荷差異，這就使得蛋白質(zhì)分子的遷移率只取決于蛋白質(zhì)分子大小，這有助于探究多酚對大豆蛋白亞基分子量的影響[12-13]。比如Li等[14]通過電泳法探究了乳鐵蛋白和EGCG通過非共價和共價（酶法，堿法，自由基接枝法）結(jié)合對蛋白質(zhì)分子量的影響差異。孫洪波等[15]通過SDS-PAGE證實了SPI-花青素非共價復(fù)合物和共價復(fù)合物的形成，SPI在堿性條件下和花青素形成了更強(qiáng)的共價交聯(lián)，這種交聯(lián)形成的作用不會被SDS和巰基乙醇阻斷。

2.2 紫外- 可見吸收光譜法

紫外-可見吸收光譜圖可以反映出分子內(nèi)共軛體系的結(jié)構(gòu)信息[16]。紫外-可見吸收光譜法是目前研究多酚與蛋白質(zhì)相互作用較基礎(chǔ)的方法之一，該方法的特點是簡單、快捷，檢出限低[17]。劉英杰等[18]發(fā)現(xiàn)花青素使SPI芳香族氨基酸處的微環(huán)境發(fā)生了改變，進(jìn)而誘導(dǎo)SPI多肽鏈伸展，發(fā)生解折疊。生物酶法交聯(lián)比化學(xué)堿法交聯(lián)更能促進(jìn)花青素與SPI的共價相互作用。

2.3 圓二色光譜法

圓二色光譜法常被用于測定蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)[19]。蛋白質(zhì)的圓二色譜分為兩段：一段遠(yuǎn)紫外區(qū)（185～245nm）；另一段是近紫外區(qū)（245～320nm）。遠(yuǎn)紫外區(qū)是肽鍵的吸收峰范圍，反映蛋白質(zhì)主鏈的構(gòu)象，包括蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)類型（α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲）及相對含量[20]。在近紫外區(qū)，譜峰可以較好地反映出蛋白質(zhì)構(gòu)象的細(xì)微變化。圓二色光譜法的特點是簡單、快速、準(zhǔn)確，而且干擾較少。同時不同的植物多酚與蛋白質(zhì)的結(jié)合具有選擇性，通過該方法可以探究不同多酚對不同蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)影響程度以及親和力的差異性。You等[2]發(fā)現(xiàn)SPI 與EGCG非共價結(jié)合后，α螺旋、β折疊和β轉(zhuǎn)角向無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致SPI 的二級結(jié)構(gòu)變得無規(guī)則化。由此可知，圓二色譜法可以有效地用于分析多酚與蛋白質(zhì)相互作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化。

2.4 傅里葉變換紅外光譜法

傅里葉變換紅外光譜法是研究蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的另一種常用方法，這種方法的特點是可以測定固體或液體，需要的樣品量較少。同時可以探究體系內(nèi)是否存在疏水作用、氫鍵和靜電作用的參與[21]。趙思明等[22]發(fā)現(xiàn)EGCG可以與SPI形成氫鍵，同時隨著EGCG添加濃度的增大，SPI中β折疊的含量隨之減小，α螺旋的含量隨之增大。這表明紅外光譜法對探究大豆蛋白與多酚相互作用及對蛋白結(jié)構(gòu)影響是不可缺少的研究方法。

2.5 熒光光譜法

熒光光譜法被廣泛用來探究蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)與多酚的相互作用程度大小。該方法的特點是靈敏度高、選擇性好、操作簡便、重復(fù)性好、線性范圍寬，但該方法對環(huán)境極為敏感，酸度、污染物及溫度等干擾均會限制此方法的使用。同時熒光光譜法可以探究非共價復(fù)合物體系內(nèi)的熒光淬滅類型以及熱力學(xué)參數(shù)，并確定多酚與蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)合常數(shù)和作用力類型[23]。劉勤勤等[24]通過熒光光譜法發(fā)現(xiàn)茶多酚對大豆分離蛋白存在靜態(tài)淬滅，二者的作用力主要是范德華力和氫鍵。

2.6 生物質(zhì)譜技術(shù)

用于研究分子結(jié)構(gòu)、動力學(xué)和分子間相互作用的常規(guī)研究方法，包括X射線結(jié)晶學(xué)、核磁共振光波譜、溶液中的光散射技術(shù)（動態(tài)、靜態(tài)、小角度X射線散射）、圓二色性（CD）、遠(yuǎn)紫外圓二色性、振動光譜學(xué)（傅里葉變換紅外光譜、拉曼光譜）、熒光光譜法、量熱法、凝膠色譜法和凝膠電泳。這些方法也有一些缺點，只能測量蛋白質(zhì)的整體結(jié)構(gòu)。比如X射線衍射需要大量的純物質(zhì)才能精確測量分子結(jié)構(gòu)。光譜法只能測量蛋白質(zhì)的二級、三級和更高級結(jié)構(gòu)的變化。質(zhì)譜法的使用可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的這些缺點，并在分子水平上準(zhǔn)確地確定蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化。質(zhì)譜主要用于確定原子質(zhì)量和同位素豐度。隨著高分辨率質(zhì)譜儀的出現(xiàn)，科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步拓寬了質(zhì)譜在有機(jī)化合物分析和結(jié)構(gòu)鑒定中的應(yīng)用。生物質(zhì)譜技術(shù)的基本原理是將分析物電離形成離子，然后通過電場（或磁場）按質(zhì)荷比（m/z）分離并分析和檢測m/z比。生物質(zhì)譜儀主要用于準(zhǔn)確測定生物大分子，如蛋白質(zhì)、核苷酸和糖，同時還提供分子結(jié)構(gòu)信息。比如電噴霧離子質(zhì)譜（ESI-MS）技術(shù)，其電離過程相對于其他方法更溫和，被廣泛應(yīng)用于研究小分子與生物大分子相互作用，比如蛋白質(zhì)和多酚的非共價相互作用，可以測定出非共價結(jié)合力的相關(guān)參數(shù)[25]。

2.7 分子對接技術(shù)

通過對多酚與蛋白質(zhì)分子對接結(jié)果進(jìn)行分析，可以得出多酚與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合自由能、結(jié)合位點和相互作用力等，可以用來輔助驗證實驗結(jié)果。Yang等[5]通過7S/11S 與EGCG 的分子對接結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白和EGCG的作用中涉及靜電作用、氫鍵和疏水作用，其中氫鍵占主導(dǎo)。You等[2]發(fā)現(xiàn)SPI與EGCG作用過程中主要是氫鍵和疏水相互作用占主導(dǎo)，這與熱力學(xué)實驗結(jié)論一致。以上實驗均證明了分子對接對于分析多酚與蛋白質(zhì)相互作用的有效性和可行性。

3 展望

目前，雖然大豆蛋白與植物多酚的相互作用中非共價相互作用研究的比較明確，而關(guān)于共價相互作用中很多反應(yīng)機(jī)制的研究還尚不透徹，比如蛋白質(zhì)與多酚復(fù)合后構(gòu)象的改變對多酚具體結(jié)構(gòu)和功能的影響研究還不夠深入，需要從微觀和宏觀的角度采用多種分析方法去表征復(fù)合物的結(jié)構(gòu)變化和功能性質(zhì)，只有探明蛋白質(zhì)與多酚的相互作用機(jī)制，才能更好地應(yīng)用于食品體系中，從而為蛋白質(zhì)與多酚的食品加工提供相關(guān)理論指導(dǎo)。