王雨童， 趙彩鴻， 王曉東， 楊 玲(林木遺傳育種國家重點實驗室，東北林業(yè)大學林學院， 黑龍江 哈爾濱 150040)

花楸(Sorbuspohuashanensis)是薔薇科蘋果亞科花楸屬落葉喬木，是集觀賞、藥用和食用價值為一體的高效益珍貴樹種[1]。野生花楸主要分布于中國的東北、華北等地，朝鮮北部和俄羅斯西伯利亞東部也有少量分布[2]。由于花楸的園林觀賞價值逐漸被人們重視，過度的濫采亂挖對中國東北東部林區(qū)花楸的野生資源造成了極大的破壞，部分地區(qū)的種群瀕臨消失，因此，采取有效的保護措施保存花楸種質(zhì)資源并加快花楸的開發(fā)利用研究具有重要意義。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，花楸樹種子具有深度或絕對的休眠狀態(tài)，屬于嚴格休眠種子[3]。在花楸種子播種前期對其進行一定的層積處理能夠有效地提高種子發(fā)芽率[4-7]。用花楸種子的水浸液對白菜種子進行培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，白菜種子萌發(fā)受到了明顯的抑制，說明引起花楸種子休眠的主要原因是花楸的果肉、果汁、種皮和種胚中均含有明顯抑制種子萌發(fā)的物質(zhì)脫落酸(ABA)[8]。ABA是導致花楸種子休眠的另一重要因素[9]。因此，可以將花楸種子休眠歸類為生理休眠。最新研究發(fā)現(xiàn)，外源乙烯能提高花楸胚胎的萌發(fā)率，在胚胎破裂過程中乙烯生物合成的增加使NO代謝途徑中H2O2含量增加，從而調(diào)控胚胎的休眠和萌發(fā)[10]。

近年來，我國多數(shù)地區(qū)土地鹽堿化越發(fā)嚴重，限制了作物的生長和發(fā)育[11]。研究表明，土壤中的鹽堿成分作為影響植物生長和產(chǎn)量最常見的脅迫因素之一，從種子萌發(fā)到開花結(jié)實整個生長發(fā)育過程中造成植物發(fā)芽率低、發(fā)芽延遲、幼苗死亡率高、葉綠素含量減少和光合性能降低等影響[12]。鹽堿脅迫會導致種子吸水不足，子葉中儲藏的蛋白水解酶活性受到抑制，使呼吸作用受到抑制，種子難以萌發(fā)[13]。鹽脅迫降低了種子發(fā)芽率，從而損害了許多物種幼苗的建立[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，外源乙烯可以有效地改善鹽脅迫對種子萌發(fā)的抑制作用[15]，但對其調(diào)控機制尚不明確。于建等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在植物種子萌發(fā)的過程中，乙烯作為植物體重要的激素和信號物質(zhì)，也參與到植物體眾多生理生化及生長發(fā)育過程，包括參與植物響應生物和非生物脅迫。鹽堿脅迫對花楸胚胎萌發(fā)的影響尚不清楚，乙烯是否可以提高鹽堿脅迫下花楸胚胎萌發(fā)率尚待研究確定。

本試驗用乙烯處理花楸胚胎，并對外源乙烯影響鹽堿脅迫下花楸胚胎萌發(fā)的作用進行觀察，對胚胎的萌發(fā)率、平均發(fā)芽速度、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)等數(shù)據(jù)進行記錄與處理。研究結(jié)果為明確外源乙烯促進花楸胚胎休眠解除的作用機制，闡明乙烯緩解鹽堿脅迫下花楸胚胎的作用機制提供理論依據(jù)，并為花楸在鹽堿地區(qū)推廣栽培提供參考依據(jù)，為人工促進花楸種子萌發(fā)、有效保護和擴展花楸自然資源提供技術和參考。

1 材料與方法

1.1 萌發(fā)試驗

1.1.1試驗材料

2020年10月上旬自東北林業(yè)大學帽兒山實驗林場成年花楸母樹采集成熟漿果后用水選法調(diào)制種子[17]。將處于安全含水量(9%～10%)的飽滿、純凈成熟種子放入塑封袋，于4 ℃ 貯藏于冰箱中備用。

1.1.2萌發(fā)試驗方法

1) 種子前處理

試驗前測定種子千粒重、含水量和生活力，然后在蒸餾水中(20±5)℃下吸脹48 h。將吸脹后種子用0.2%(v/v)NaClO溶液攪拌浸泡15 min，用無菌水沖洗至少3次，在冰上剝除種皮(花楸為無胚乳種子)擠出裸胚用于試驗，裸胚獲得方法同楊玲等[18]的研究方法。

2) 萌發(fā)試驗

乙烯(ETH)處理試驗。將胚胎放在3 mL (ETH濃度為138 μmol/L)浸濕的濾紙上吸脹，對照為直接在蒸餾水浸濕的濾紙上吸脹。所有試驗胚胎均在直徑9 cm的培養(yǎng)皿中(每皿30個胚)25 ℃，光照強度為60 μmol/(m2·s)(每天16 h光照)下萌發(fā)。對照和處理均設3個以上重復。

碳酸鈉(Na2CO3)、碳酸氫鈉(NaHCO3)處理試驗。將胚胎分別放在3 mL(Na2CO3濃度為8.92 mmol/L )、(NaHCO3濃度為14.15 mmol/L )浸濕的濾紙上吸脹，對照和萌發(fā)條件均同上。

Na2CO3、NaHCO3分別與乙烯的組合處理試驗。將胚胎放在3 mL Na2CO3與ETH混合液、NaHCO3與ETH混合液浸濕的濾紙上吸脹，對照和萌發(fā)條件均同上。

1.2 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)整理，采用Sigmaplot 12.5軟件進行繪圖，SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)方差分析、Duncan多重比較和相關性分析。方差分析在p=0.05水平上進行顯著性檢驗。平均數(shù)間統(tǒng)計學差異用鄧肯多重比較法在p=0.05顯著性水平上檢驗。各指標計算公式如下：

萌發(fā)率(%)=(胚胎萌發(fā)數(shù)/供試胚胎總數(shù))×100%;

平均發(fā)芽速度(d)=∑(D×n)/∑n

式中：D為從種子置床起算的天數(shù)，有的規(guī)定置床之日為0,有的規(guī)定為1。n為相應各天的發(fā)芽數(shù)。

發(fā)芽指數(shù)=∑Gt/Dt

式中：Gt為發(fā)芽試驗終期內(nèi)每日發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽日數(shù)，∑為總和。

發(fā)芽勢(%)=(日發(fā)芽數(shù)/供試胚胎總數(shù))×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙烯對鹽堿脅迫下花楸胚胎萌發(fā)的影響

不同處理對花楸胚胎萌發(fā)的影響如圖1所示。用Na2CO3、NaHCO3處理后的花楸胚胎的萌發(fā)率顯著低于對照，外源添加乙烯處理后萌發(fā)率雖沒有達到對照水平，但也顯著提高。由圖2可知，在萌發(fā)過程中(1～8 d)最先萌發(fā)的是乙烯處理，第3天即可萌發(fā)，最晚萌發(fā)的是NaHCO3處理(第6天)，第8天時各處理的萌發(fā)率由高至低依次為ETH(60%)、H2O(43%)、Na2CO3與ETH組合(28.89%)、NaHCO3與ETH組合(18.89%)、Na2CO3(13.33%)、NaHCO3(6.67%)，且各處理間差異顯著(p<0.05)。

注：不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(p<0.05)。下同。圖1 各處理對花楸胚胎萌發(fā)率的影響Fig.1 Effect of each process on the germination percentage of Sorbus pohuashanensis embryo

圖2 各處理下花楸胚胎1～8 d的萌發(fā)率Fig.2 Germination percentage of 1 to 8 days under various treatments of Sorbus pohuashanensis

2.2 ETH對鹽堿脅迫下花楸胚胎平均發(fā)芽速度的影響

平均發(fā)芽速度是指供試種子全部發(fā)芽所需要的時間，此指標可以反映種子的活力。由圖3可知，ETH處理后花楸胚胎的平均發(fā)芽速度最低(4.98 d)，顯著低于其他處理。與對照相比，經(jīng)Na2CO3、NaHCO3處理后花楸胚胎的平均發(fā)芽速度顯著提高，Na2CO3為6.77 d、NaHCO3為7.17 d，說明胚胎萌發(fā)受到抑制。向Na2CO3、NaHCO3中添加外源ETH后，平均發(fā)芽速度降低，達到對照(6.25 d)水平，說明Na2CO3、NaHCO3對胚胎萌發(fā)的抑制作用減弱，胚胎萌發(fā)能力增強。

圖3 各處理對花楸胚胎平均發(fā)芽速度的影響Fig.3 Effects of each process on the mean germination speed of Sorbus pohuashanensis embryo

2.3 ETH對鹽堿脅迫下花楸胚胎發(fā)芽指數(shù)的影響

各處理中，ETH處理后的花楸胚胎發(fā)芽指數(shù)最高(圖4)，且各處理的發(fā)芽指數(shù)間均存在顯著差異(p<0.05)。發(fā)芽指數(shù)最高的處理(ETH)是最低的處理(NaHCO3)的13倍多。由此可見，ETH不僅可以促進正常情況下的花楸胚胎萌發(fā)，還可以緩解鹽堿脅迫對花楸胚胎的抑制作用。各處理下花楸胚胎1～8 d的發(fā)芽指數(shù)見圖5。胚胎發(fā)芽指數(shù)在萌發(fā)過程中的變化是先增后降最后趨于穩(wěn)定，說明胚胎在發(fā)芽中期活力最高。

圖4 各處理對花楸胚胎發(fā)芽指數(shù)的影響Fig.4 Effects of each process on the germination index of Sorbus pohuashanensis embryo

注：圖中不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(p<0.05)。圖5 各處理下花楸胚胎1～10 d的發(fā)芽指數(shù)Fig.5 Germination index of 1 to 8 days under various processes of Sorbus pohuashanensis embryo

2.4 ETH對鹽堿脅迫下花楸胚胎發(fā)芽勢的影響

ETH處理對鹽堿脅迫下花楸胚胎發(fā)芽勢的影響見圖6。ETH處理后胚胎的發(fā)芽勢為24.44%，顯著高于對照，Na2CO3、NaHCO3處理后胚胎發(fā)芽勢顯著低于對照。說明ETH可以促進花楸胚胎萌發(fā)，Na2CO3、NaHCO3抑制了花楸胚胎萌發(fā)。向Na2CO3、NaHCO3中加入ETH后花楸胚胎的發(fā)芽勢分別提高40%和100%，但不顯著，說明加入外源ETH可以緩解鹽堿脅迫對花楸胚胎萌發(fā)的部分抑制作用。

圖6 各處理對花楸胚胎發(fā)芽勢的影響Fig.6 Effects of various processes on the germination potential of Sorbus pohuashanensis embryo

3 結(jié)論與討論

3.1 Na2CO3、NaHCO3處理抑制花楸胚胎萌發(fā)

Na2CO3、NaHCO3是東北地區(qū)鹽堿土中的主要成分，具有較強堿性，且pH值很高。鹽脅迫會抑制鹽生植物[19]和甜土植物[20]種子的萌發(fā)，堿脅迫除了直接抑制種子萌發(fā)外，還可以通過光合作用對植物生長進行影響[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照相比，用Na2CO3、NaHCO3處理后花楸胚胎的萌發(fā)率分別降低了70%和85%，發(fā)芽指數(shù)分別降低了72%和87%，發(fā)芽勢分別降低了62%和77%，平均發(fā)芽速度分別提高了8%和14%，均與對照差異顯著，說明鹽堿脅迫條件下花楸胚胎萌發(fā)會受到抑制。

3.2 外源ETH處理促進花楸胚胎休眠解除

ETH是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常見的植物生長調(diào)節(jié)劑，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。近年來，ETH具有打破種子休眠的作用，已經(jīng)逐漸得到證實，如蘋果(MaluspumilaMill.)[22]。此外，趙秋榮和楊湘虹[23]通過研究ETH的生物合成、代謝以及信號通路發(fā)現(xiàn)，ETH會參與到種子的休眠與萌發(fā)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ETH處理后胚胎的萌發(fā)率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢等均高于對照。ETH處理后花楸胚胎第3天即可萌發(fā)，早于其他處理，且在第8天時萌發(fā)率達到最高。結(jié)果表明，ETH對種子萌發(fā)具有促進作用。

此外，向Na2CO3、NaHCO3中加入ETH后，花楸胚胎的萌發(fā)率又顯著提升，說明ETH可以緩解Na2CO3、NaHCO3對花楸胚胎萌發(fā)的抑制，但具體的作用機理還尚不明確，需進一步進行研究。

3.3 外源ETH對鹽堿脅迫下的花楸胚胎萌發(fā)有調(diào)控作用

有研究發(fā)現(xiàn)，外源添加ETH、赤霉素、油菜素內(nèi)酯等化學物質(zhì)會緩解鹽堿脅迫對植物種子萌發(fā)和生長的抑制作用[24]。外源噴施ETH對鹽脅迫下萌發(fā)受到抑制的種子是有效的[25]。綜合ETH處理對正常情況下以及Na2CO3、NaHCO3脅迫條件下花楸樹胚胎的萌發(fā)率、發(fā)芽速度、發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽勢的結(jié)果可知，外源ETH不僅可使正常休眠的花楸胚胎萌發(fā)得更整齊、更快、萌發(fā)率更高，還對鹽堿脅迫下的花楸胚胎休眠有一定的解除作用。說明在花楸樹胚胎休眠解除和鹽堿脅迫解除中ETH具有重要的調(diào)控作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)外源ETH可以促進花楸胚胎萌發(fā)，鹽堿脅迫會抑制花楸胚胎萌發(fā)，外源添加ETH可以有效地改善鹽堿脅迫對花楸胚胎萌發(fā)的抑制作用。本研究結(jié)果為建立外源ETH促進花楸胚胎萌發(fā)技術提供了科學依據(jù)，并可為花楸在鹽堿地區(qū)推廣栽培提供參考。