楊雪冰，董 上，夏海濤，山小淞，梅雪松，魏曉雪

(1.黑龍江省科學(xué)院，哈爾濱 150000； 2.黑龍江省林業(yè)科學(xué)院伊春分院，黑龍江 伊春 153000； 3.黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所，哈爾濱 150040； 4.黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江 大慶 163319)

百里香屬(ThymusL.)植物是唇形科的低矮灌木，在中國分布有17種，2變種，主要分布于黃河以北的干旱及半干旱山區(qū)礫石坡地及草地[1]。黑龍江省分布8種，1變種，調(diào)查中發(fā)現(xiàn)百里香、地椒2種在黑龍江省也有分布[2]。顯脈百里香和興安百里香分布具有地帶性，其中顯脈百里香只分布于黑龍江省，興安百里香分布于黑龍江省和遼寧省[3-4]。關(guān)于顯脈百里香和興安百里香揮發(fā)油提取和成分的研究鮮有報(bào)道，對(duì)興安百里香的探討多集中于植物形態(tài)和快速繁育方面[5-6]。王玲等對(duì)黑龍江省4種野生百里香屬植物東北百里香(ThymusmandschuricusRonn.)、顯脈百里香、興凱百里香(ThymusprzewalskiiNakai)、興安百里香的種子微形態(tài)進(jìn)行了比較研究[5]，并于2010年對(duì)這4種百里香屬植物的扦插苗在不同處理?xiàng)l件下的生根情況進(jìn)行了比較研究[6]。閆紅秀等運(yùn)用微波法提取興安百里香揮發(fā)油并對(duì)其主要組分活性進(jìn)行了研究，得到主要成分為百里香酚(52.52%)、α-萜品烯(12.72%)和對(duì)傘花烴(8.24%)。體外抑菌實(shí)驗(yàn)表明，興安百里香揮發(fā)油3種主要組分中，百里香酚抑菌活性最強(qiáng)[7]。本研究采用水蒸氣蒸餾法提取百里香揮發(fā)油，利用GC-MS對(duì)黑龍江省4種野生百里香的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析、鑒定，以期為進(jìn)一步合理開發(fā)利用黑龍江省興安百里香資源提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

百里香和興安百里香采集于黑龍江省黑河市五大連池風(fēng)景區(qū)(東經(jīng)126°00′～126°26′，北緯48°34′～48°48′)，地椒和顯脈百里香采集于黑龍江省伊春市(東經(jīng)127°37′～130°46′，北緯46°28′～4°26′)，模式標(biāo)本保存于黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所植物標(biāo)本室(HNR)。采樣于2020年9月進(jìn)行，選擇在天氣晴好的上午，在植株離地面10 cm處用剪刀截取整株百里香，包括植株的莖、葉、花和果實(shí)，多株混合隨機(jī)采樣，帶回實(shí)驗(yàn)室陰干。氣質(zhì)聯(lián)用分析儀為安捷倫7890A-7000B氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國安捷倫科技公司生產(chǎn))，所用試劑除正己烷為色譜純外，其余試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 百里香揮發(fā)油提取

稱取百里香粉末10～20 g置于1 L圓底燒瓶中，按料液比1∶10(m/V)的體積加入蒸餾水并避光浸泡15 h，用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油5 h，提取的揮發(fā)油用過量無水硫酸鈉吸取水分后保存于2 mL Agilent樣品瓶中，放入-4℃ 冰箱中保存待測。含油率計(jì)算如下：

W(%)=m1/m2×100%

式中：W為含油率，%；m1為百里香揮發(fā)油的質(zhì)量，計(jì)量單位為g；m2為百里香陰干樣原料的質(zhì)量，計(jì)量單位為g。

1.2.2 百里香揮發(fā)油成分分析

色譜條件：色譜柱：HP-5 MS，5%苯甲基聚硅氧烷彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度250℃，柱室溫度70℃(5 min)，以8℃/min 升溫速率升至150℃(保持10 min)，10℃升至250℃(保持8 min)；載氣：高純氦氣，柱前壓8.12 Psi，流速1.0 mL/min，分流比37∶1。

質(zhì)譜條件：接口溫度280℃。電離方式：EI，電子能量70 eV，離子源溫度250℃，四極桿溫度130℃。調(diào)諧方式：標(biāo)準(zhǔn)調(diào)諧。質(zhì)量掃描方式：SCAN，溶劑延遲3 min。掃描范圍m/z：35～550。

分析方法：用 HP-5 MS 色譜柱對(duì)色譜分離條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳的分離條件，進(jìn)行GC-MS分析，獲得揮發(fā)油的總離子流色譜圖(TIC)。利用該儀器所配的Nist 2008 質(zhì)譜庫進(jìn)行檢索，再對(duì)所得的譜圖進(jìn)行人工核對(duì)和補(bǔ)充檢索，用面積歸一化法測得各組分的百分含量。

1.2.3 百里香揮發(fā)油香氣的感官評(píng)價(jià)方法

百里香揮發(fā)油的感官評(píng)價(jià)方法按GB/T 14454.2-2008《香料香氣評(píng)定法》對(duì)百里香揮發(fā)油進(jìn)行香氣感官評(píng)價(jià)，天然香料除評(píng)辨其即時(shí)的香氣外，還應(yīng)注意對(duì)其在揮發(fā)過程中所呈現(xiàn)的頭香香韻特征、體香香韻特征、尾香香韻特征進(jìn)行評(píng)析，以綜合評(píng)定其香氣質(zhì)量[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 百里香揮發(fā)油含油率比較

從表1可知，不同品種的百里香揮發(fā)油的含油率有較大差異，含油率范圍為0.29%～1.72%，其中，興安百里香的揮發(fā)油含油率最高，為1.72%，百里香次之，為0.76%，顯脈百里香含油率為0.55%，地椒含油率最低為0.29%。4種百里香揮發(fā)油含量之間的差異顯著，五大連池地區(qū)的2種百里香揮發(fā)油含油率顯著高于伊春地區(qū)。

表1 4種百里香揮發(fā)油含量比較Tab.1 Comparison of the content of essential oil from 4 Thymus species

2.2 百里香揮發(fā)性成分分析

4種百里香屬植物共檢測出55種化合物，利用Nist標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫—計(jì)算機(jī)聯(lián)機(jī)檢索，結(jié)合查閱質(zhì)譜手冊(cè)和文獻(xiàn)資料分析核對(duì)，共鑒定出38種化合物采用面積歸一化法測定各種成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2。從化學(xué)成分種類來看，4種揮發(fā)油主要由16種萜烯類、9種醇類、5種酚類、2種酯類、1種酮類、1種醚類、1種醛類等組成。黑龍江省4種野生百里香揮發(fā)性成分占比最多的均為百里香酚，其中興安百里香、顯脈百里香、地椒的揮發(fā)油百里香酚占比達(dá)到75%以上，按照揮發(fā)油中主要成分分類法，可以將4種百里香揮發(fā)油均定為百里香酚型。

表2 4種百里香揮發(fā)油化學(xué)成分及其相對(duì)含量Tab.2 Volatile chemical compositions and relative content of essential oil from 4 Thymus species

4種野生百里香揮發(fā)油的主要化學(xué)成分及相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)表現(xiàn)出一定的差異。興安百里香鑒定出21種成分，占總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的98.16%，百里香酚占比最高，為79.04%。其次為2-環(huán)己烯-1-醇和2-異丙基-1-甲基苯，分別占比5.15%和4.09%，其余成分總和占總量的9.88%。百里香鑒定出20種成分，占總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的96.85%，主要成分為百里香酚32.86%、龍腦13.45%、4-萜品醇9.93%、2-環(huán)己烯-1-醇7.77%、橙花醇乙酸酯5.94%等。顯脈百里香鑒定出25種成分，占總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的95.49%，百里香酚占比最高，為77.73%，其余成分占比不高，只有5種成分占比超過1%，剩余14種都未超過1%。地椒鑒定出21種成分，占總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的97.05%，百里香酚為最主要成分，占比最高，為78.05%，其余20種成分占比總和為18%，其中含量在1%～5%的化合物共6種，剩余沒有占比超過1%的成分。

從鑒定出的化合物相對(duì)分子質(zhì)量來看，相對(duì)分子質(zhì)量稍大的倍半萜及含氧倍半萜含量占絕大多數(shù)。所鑒定的化合物中，最小相對(duì)分子質(zhì)量為128，只有1-辛烯-3-醇一種化合物；相對(duì)分子質(zhì)量為136的化合物共6個(gè)，都為帶環(huán)的烯烴類(單萜)，平均含量較??；相對(duì)分子質(zhì)量為154的化合物較多，有7種，全為醇類或其衍生物，其中龍腦含量較大，其次為4-萜品醇和2-環(huán)己烯-1-醇平均含量相對(duì)較大；相對(duì)分子質(zhì)量為150的化合物有4種，其中百里香酚是百里香揮發(fā)油的主要成分，含量最高。相對(duì)分子質(zhì)量為152的化合物有反式-松香芹醇和檸檬醛2種，含量在2%左右；相對(duì)分子質(zhì)量超過200的化合物共11種，其中相對(duì)分子質(zhì)量為204化合物最多，共8個(gè)，都是倍半萜類化合物，平均含量較小，總量也不大，但為重要的尾香成分；相對(duì)分子質(zhì)量為220的化合物只有異長葉烯一種，是萜烯類化合物。

2.3 百里香揮發(fā)油香氣的感官評(píng)價(jià)

百里香揮發(fā)油提取物的感官特征呈微黃至淡褐色，按照GB/T 14454.2-2008《香料香氣評(píng)定法》評(píng)價(jià)表明，具有清涼帶干焦的藥草香又兼有龍腦、芳樟醇、石竹烯等的清香氣息，香氣透發(fā)有力但粗糙，留香持久。4種百里香揮發(fā)油共有的化合物有5個(gè)，分別為α-萜品烯、百里香酚、4-萜品醇、石竹烯、異長葉烯，其中百里香酚在4種百里香揮發(fā)油中含量均為最高，除百里香酚和龍腦外，沒有超過占比10%的成分。

3 討論

國內(nèi)已報(bào)道的新疆、陜西、貴州、寧夏和甘肅等地野生百里香的揮發(fā)油含量為0.16%～0.67%[9-13]，但本研究中，興安百里香揮發(fā)油含量高達(dá)1.72%，百里香揮發(fā)油含量為0.76%，顯著高于其他地區(qū)，也高于伊春地區(qū)的顯脈百里香和地椒。經(jīng)調(diào)查，野生興安百里香生長在五大連池地區(qū)龍門石寨，百里香生長在藥泉山，兩處皆為火山熔巖經(jīng)風(fēng)化形成的火山灰土?；鹕交彝潦俏宕筮B池地區(qū)的主要土壤類型之一，具有有機(jī)質(zhì)含量含量高、土壤容重小、孔隙度與持水能力高等特點(diǎn)，同時(shí)受玄武巖母質(zhì)中礦物態(tài)磷和鉀的作用，使火山灰土中全磷和全鉀含量較高[14]，這可能是興安百里香揮發(fā)油含量顯著高于其他百里香的原因。

百里香酚型是百里香屬植物主要的化學(xué)型，于二汝等總結(jié)了已報(bào)道的國內(nèi)13種百里香的化學(xué)型，有8種為百里香酚型，其主要成分百里香酚的含量介于22.72%～36.00%；國內(nèi)引進(jìn)的13種百里香也主要以百里香酚型為主，其中上海引進(jìn)的銀斑百里香的百里香酚含量占比最高，為60.62%[13]。閆紅秀等提取的興安百里香揮發(fā)油中，百里香酚為52.52%[7]，均低于本研究中興安百里香的百里香酚79.04%。本研究中，顯脈百里香為百里香酚型，與張妤研究結(jié)果顯脈百里香為橙花醇型、但在花末期轉(zhuǎn)變?yōu)辇埬X/百里香酚型有明顯區(qū)別[15]。

閆紅秀等研究發(fā)現(xiàn)，興安百里香精油主要成分為百里香酚(52.52%)、α-萜品烯(12.72%)和對(duì)傘花烴(8.24%)[7]。本研究中，興安百里香的揮發(fā)油成分與閆紅秀的研究結(jié)果類似，都以百里香酚為主，不同的是本研究中未檢出對(duì)傘花烴；祁偉等[16]對(duì)山東德州郊區(qū)野生百里香精油成分進(jìn)行分析，鑒定出30種化合物，主要成分為百里香酚(15.64%)和香芹酚等；張有林等[5]研究發(fā)現(xiàn)，甘肅鎮(zhèn)原縣的百里香精油主要成分為百里香酚(22.72%)和香芹酚(11.57%)等，本研究中百里香精油主要成分為百里香酚32.86%，未檢測到香芹酚；苗延青等[17]對(duì)陜西秦嶺山區(qū)地椒的精油成分進(jìn)行分析，鑒定出52種化合物，主要成分為百里香酚(20.87%)、香芹酚(16.58%)、對(duì)傘花烴(15.62%)和龍腦(4.68%)等物質(zhì)。而本研究中地椒精油中，百里香酚為最主要成分，占比78.05%，未檢測到龍腦。由此可見，百里香屬植物精油的主要組分與前人研究存在較大差異，地區(qū)差異性明顯，同種、不同產(chǎn)地的百里香精油成分和含量存在明顯差異，受基因型、地理環(huán)境、氣候條件等因素影響較大。黑龍江省分布的3種野生百里香百里香酚含量占比遠(yuǎn)高于其他地區(qū)，這可能與黑龍江省的地理環(huán)境、取樣時(shí)期相關(guān)，同時(shí)受到基因型和環(huán)境型的共同影響。

4 結(jié)論

黑龍江省4種野生百里香含油率范圍為0.29%～1.72%，而本研究中，興安百里香揮發(fā)油含量高達(dá)1.72%，百里香揮發(fā)油含量為0.76%，顯著高于其他地區(qū)，也高于伊春地區(qū)的顯脈百里香和地椒。

4種百里香屬植物共檢測出55種化合物，共鑒定出38種化合物。從化學(xué)成分種類來看，4種揮發(fā)油主要由16種萜烯類、9種醇類、5種酚類、2種酯類、1種酮類、1種醚類、1種醛類等組成。4種百里香揮發(fā)油共有的化合物有5個(gè)，分別為α-萜品烯、百里香酚、4-萜品醇、石竹烯、異長葉烯。

黑龍江省4種野生百里香揮發(fā)性成分占比最多的均為百里香酚，其中興安百里香、顯脈百里香、地椒的揮發(fā)油百里香酚占比達(dá)到75%以上，按照揮發(fā)油中主要成分分類法，可以將4種百里香揮發(fā)油均定為百里香酚型。黑龍江省分布的3種野生百里香，百里香酚含量占比遠(yuǎn)高于其他地區(qū)。

百里香揮發(fā)油提取物的感官特征呈微黃至淡褐色，按照GB/T 14454.2-2008《香料香氣評(píng)定法》評(píng)價(jià)表明，具有清涼帶干焦的藥草香又兼有龍腦、芳樟醇、石竹烯等的清香氣息，香氣透發(fā)有力但粗糙，留香持久。