韓 變,李惠霞,劉永剛,石明明,倪春輝,張 敏

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730070;2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所,蘭州 730070)

當(dāng)歸(Angelica sinensis)屬傘形目傘形科2年生草本植物,別名為歸、秦歸、西當(dāng)歸、岷當(dāng)歸等,通常以干燥的根入藥,有補(bǔ)血活血、保肝潤肺和促進(jìn)免疫系統(tǒng)等作用[1],在抗腫瘤、調(diào)節(jié)子宮平滑肌、抗炎、抗損傷等方面發(fā)揮重要作用[2],在臨床上也得到廣泛應(yīng)用。

腐爛莖線蟲(Ditylenchus destructorThone,1945)在分類上隸屬于動物界(Animal)、線蟲門(Nematoda)、墊 刃 目(Tylenchida)、墊 刃 總 科(Tylenchidac)、莖線蟲屬(Ditylenchus),也稱馬鈴薯莖線蟲、馬鈴薯腐爛莖線蟲、甘薯莖線蟲,在全國溫帶地區(qū)都有發(fā)生,可為害90～120種植物,包括糧食作物、中藥材、經(jīng)濟(jì)作物及雜草等[3],是破壞性最大的植物線蟲之一[4]。當(dāng)歸莖線蟲病俗稱當(dāng)歸麻口病,病原為腐爛莖線蟲(D.destructor),是當(dāng)歸上重要的病害之一,可使當(dāng)歸揮發(fā)性成分散失,藥材質(zhì)量下降,藥用價(jià)值和商品價(jià)值降低[5]。據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn),在當(dāng)歸整個(gè)生育期內(nèi)腐爛莖線蟲均可危害,但以前期為主,當(dāng)歸受害后,一般年份減產(chǎn)在30%左右,隨著長期迎茬和重茬種植,發(fā)病率可達(dá)85%,嚴(yán)重者高達(dá)100%,甚至絕收[1]。

本研究擬對采自青海省西寧市大同縣和海東市互助縣當(dāng)歸莖線蟲群體進(jìn)行形態(tài)觀察和測量,基于r DNA-ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,以明確線蟲種類,并分析其群體差異,以期為該地區(qū)腐爛莖線蟲病的檢疫、預(yù)防及控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試線蟲

分離自2019年11月青海省海東市互助縣(E 102°2′18″,N 36°48′54″)、西 寧 市 大 通 縣(E 101°43′26″,N 36°57′48″)當(dāng)歸麻口病樣。

1.2 供試菌株

培養(yǎng)線蟲用茄鐮孢菌(Fusarium solani),由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物線蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 線蟲的分離

將采集的當(dāng)歸麻口病樣,用自來水沖洗干凈,晾干后拍照觀察。采用改良貝曼漏斗法[6]分離線蟲。取兩層紙巾將切成小塊的當(dāng)歸包裹放于漏斗中,漏斗下部用橡皮管接指形管,加水漫過紙巾包、浸透當(dāng)歸組織。靜置10～12 h后,取下指形管對分離得到的線蟲進(jìn)行消毒、計(jì)數(shù),備用。

1.4 線蟲消毒

以3 000 r/min離心富集目標(biāo)線蟲,棄上清液;用0.5%次氯酸鈉消毒2 min后,3 000 r/min離心,棄上清液;用無菌水沖洗2～3次;隨后用混合消毒液(0.5%硫酸鏈霉素100μL、0.5%氨芐青霉素100μL、無菌水800μL)消毒10 min后,以3 000 r/min離心2 min,棄上清液;用無菌水沖洗3次,最后定容至1 m L,在4℃下保存,備用[7]。

1.5 線蟲的形態(tài)學(xué)鑒定

1.5.1 線蟲的殺死固定 參照謝輝等[8]方法,將目標(biāo)線蟲挑取至載玻片水滴中,手持載玻片在酒精燈火焰上方加熱5～6 s,加熱時(shí)注意觀察線蟲,當(dāng)蟲體突然伸直時(shí),停止加熱。

1.5.2 觀察鑒定 在光學(xué)顯微鏡(蔡司,德國)下觀察形態(tài)特征和測量特征值,參照謝輝[9]與段玉璽[10]的方法,采用de Man公式對形態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,其中a=體長/體寬、b=體長/體前端至食道腺末端的距離、c=體長/尾長、c′=尾長/肛門處體寬、v=雌蟲體前端至陰門的距離×100/雌蟲體長和V′=雌蟲體前端至陰門的距離×100/雌蟲體前端至肛門距離。以劉維志等[11]對線蟲分類特征的描述為參照,鑒定線蟲種類。

1.6 線蟲的分子生物學(xué)鑒定

1.6.1 線蟲DNA提取 參照卓侃等[12]的方法略有改動,提取單條線蟲DNA。挑取單條線蟲于去離子水中清洗3遍,挑入裝有10μL線蟲裂解液(Worm Lysis Buffer,WLB)的200μL Buffer管中,以3 500 r/min離心3 min。反復(fù)凍融2次(液氮處理1 min,85℃水浴1 min),自然溶解后加入1μL蛋白酶K(1 mg/m L),將Buffer管放入預(yù)熱的PCR儀中,65℃溫育1 h,95℃下10 min,反應(yīng)結(jié)束后即獲得單條線蟲DNA。隨后以12 000 r/min離心5 min,上清液直接用于PCR擴(kuò)增,最后于4℃保存,備用。

1.6.2 r DNA-ITS區(qū)段PCR擴(kuò)增 采用線蟲ITS區(qū)通用引物[13]TW81(5′-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3′)、AB28(5′-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′),對目標(biāo)線蟲ITS-r DNA基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增采用25μL體系:DNA模板3μL,2×TaqPCR Master Mix 12.5μL,上、下游引物(10μmol/L)1μL,dd H2O補(bǔ)足到25μL。

PCR擴(kuò) 增 程 序:94℃預(yù) 變 性4 min,94℃變性10 s,55℃退火20 s,72℃延伸1 min,38個(gè)循環(huán)后,72℃終延伸5 min,最終于4℃保存,備用。

取5μL PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,然后將PCR產(chǎn)物送往北京擎科西安分公司測序。使用軟件Seq Man進(jìn)行序列拼接,于NCBI進(jìn)行BLAST比對,下載同源性較高的序列,以BI法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[14]:使用MAFFT比對分析后,用DAMBE檢測飽和度,用軟件Mr MTgui連接PAUP與Mr Model Test進(jìn)行模型選擇,最后使用Mrbayes以最佳模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,用Fig Tree修正系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6.3 r DNA-ITS區(qū)段PCR-RFLP分析 采用DdeⅠ、HinfⅠ、Tru9Ⅰ(MseⅠ)和SduⅠ4種內(nèi)切酶,參照Subbotin等[15]的方法對線蟲r DNA-ITS區(qū)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。酶切采用20 μL體系,即PCR產(chǎn)物8μL,內(nèi)切酶(10 U/μL)1μL,與內(nèi)切酶相對應(yīng)的Buffer 2μL,dd H2O 9μL。反應(yīng)條件為37℃1.5 h。反應(yīng)結(jié)束后,用2%瓊脂糖凝膠(含0.5 mg/L核酸染色劑)分離擴(kuò)增產(chǎn)物,用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察、拍照分析。酶切片段大小通過在線軟件Wbcuter 2.0(http://www.firstmarket.com/cutter/cut2.html)獲得,以Subbotin等[13]A-G型D.destructor作為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 線蟲群體的分離

從青海省海東市互助縣和西寧市大通縣當(dāng)歸麻口病株中共分離到4個(gè)線蟲群體,其中互助縣分離得到3個(gè)線蟲群體,分別編號為HZAI、HZA2、HZA3;大同縣分離得到1個(gè)線蟲群體,編號為DTA1。

2.2 當(dāng)歸莖線蟲癥狀觀察

腐爛莖線蟲主要危害歸頭部分(圖1-B)。一般從當(dāng)歸蘆頭開始發(fā)病,發(fā)病初期,根部無明顯癥狀,后期主要表現(xiàn)為植株表皮粗糙,表皮縱裂呈褐色裂紋,深約2～3 mm,內(nèi)部組織呈海綿狀、木質(zhì)化(圖1-B)。嚴(yán)重時(shí)整株根部皮層組織干爛,從表皮至維管束全部呈褐色糠腐狀(圖1-C)。

圖1 當(dāng)歸莖線蟲病癥狀Fig.1 Symptoms of stem nematode disease of A.sinensis

2.3 線蟲的形態(tài)學(xué)鑒定

2.3.1 特征描述 該線蟲熱殺死后蟲體前端伸直,尾后端向腹部彎曲(圖2-A,2-B)。線蟲唇區(qū)低平,略有縊縮,口針細(xì)小,長約10～13μm,基部球明顯,呈圓形。中食道球呈卵圓形,有膜瓣(圖2-C)。食道狹部窄,食道腺自背面略覆蓋腸的前端,排泄孔位于腸與食道連接處之前,半月體位于排泄孔前(圖2-D)。尾圓錐形,末端稍圓(圖2-F)。蟲體側(cè)線6條(圖2-H)。雌蟲陰門稍有突起,后陰子宮囊向肛門延伸(圖2-G),約為陰門至肛門距離的3/4(圖2-B,2-E)。雄蟲交合刺略向腹部彎曲,交合傘向后延伸,至尾長的1/3處(圖2-F)。

圖2 青海當(dāng)歸線蟲群體光學(xué)顯微鏡照片F(xiàn)ig.2 Light photomicrographs of nematode populations on A.sinensis in Qinghai

2.3.2 線蟲形態(tài)特征測量值 通過形態(tài)特征和測量值比較,由表1、表2可知,與甘肅省當(dāng)歸腐爛莖線蟲群體相比,青海省當(dāng)歸群體雄蟲、雌蟲體長均略小,雄蟲尾長和c值(體長/體寬)略大,雌蟲a值(體長/尾長)略大,其他測量值均基本一致。

表1 4個(gè)青海省當(dāng)歸線蟲群體雄蟲蟲體相關(guān)測量值Table 1 Measurements of male of four nematode populations on A.sinensis from Qinghai province

表2 4個(gè)青海省當(dāng)歸線蟲群體雌蟲蟲體相關(guān)測量值Table 2 Measurement of female of four nematode populations on A.sinensis from Qinghai province

2.4 分子生物學(xué)鑒定

2.4.1 線蟲rDNA-ITS序列分析 經(jīng)雙向測序后拼接,群體HZA1、HZA2、HZA3和DTA1的r DNA-ITS序列長度依次為919 bp、916 bp、888 bp和919 bp,上傳NCBI獲得GenBank登錄號依次為MW422776、MW422777、MW422778和MW048797。

經(jīng)BLAST比對,發(fā)現(xiàn)HZA1、HZA2、HZA3和DTA1 4個(gè)群體與腐爛莖線蟲種群的同源性較高,與中國腐爛莖線蟲群體有著不同程度的相似性,其中HZA1的rDNA-ITS序 列與EF208210(甘薯C基因型群體)相似度為95.62%,ITS1序列長度相差2個(gè)堿基,且存在40個(gè)堿基差異;HZA2 rDNA-ITS序列與EF208213(甘薯D基因型群體)相似度達(dá)98.53%,ITS1區(qū)序列長度相差2個(gè)堿基,且存在12個(gè)堿基差異。HZA3、DTA1兩個(gè)群體r DNA-ITS序列完全一致,與FJ911551(馬鈴薯B基因型群體)相似度為95.78%,但I(xiàn)TS1區(qū)序列長度與FJ911551相差2個(gè)堿基,且存在48個(gè)堿基差異。

2.4.2 線蟲r DNA-ITS序列聚類分析 采用貝葉斯法構(gòu)建ITS-r DNA系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3),青海當(dāng)歸4個(gè)線蟲群體與除A基因型之外的其他型腐爛莖線蟲聚為一枝。HZA1線蟲群體單獨(dú)為一支;HZA2與F基因型腐爛莖線蟲群體親緣關(guān)系較近,與其他型腐爛莖線蟲距離較遠(yuǎn);DTA1和HZA3線蟲群體聚為一支,且不屬于其他已知類型。據(jù)此,將青海當(dāng)歸分離出的莖線蟲群體鑒定為腐爛莖線蟲(D.destructor),其基因型待定。2.4.3 r DNA-ITS區(qū)段PCR-RFLP分析 通過軟件Wbcuter 2.0,用4種內(nèi)切酶得到的片段數(shù)量與具體大小見表3。4個(gè)青海當(dāng)歸莖線蟲群體的酶切片段分為3種類型,HZA1和HZA2各為1種,HZA3和DTA1為1種。其中DdeⅠ和SduⅠ酶切片段為3種片段;HinfⅠ酶切為4種片段;Tru9Ⅰ(MseⅠ)酶切片段類型為2類,即4種和5種不同片段,且不同類型片段存在長度差異。以4種內(nèi)切酶DdeⅠ、HinfⅠ、Tru9Ⅰ(MseⅠ)及SduⅠ對青海當(dāng)歸線蟲r DNA-ITS區(qū)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切驗(yàn)證,如圖4所示,結(jié)果與使用軟件Wbcuter 2.0酶切片段類型一致,但這4個(gè)當(dāng)歸的線蟲群體與腐爛莖線蟲其他群體酶切片段存在明顯差異。

圖4 青海省當(dāng)歸線蟲群體與腐爛莖線蟲r DNA-ITS區(qū)段PCR-RFLP結(jié)果Fig.4 PCR-RFLP results of rDNA-ITS haplotypes of D.destructor on A.sinensis from Qinghai province

表3 青海省當(dāng)歸線蟲群體與腐爛莖線蟲r DNA-ITS PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果Table 3 Enzyme digestion results of rDNA-ITS PCR products of D.destructor on A.sinensis from Qinghai province

圖3 基于r DNA-ITS序列貝葉斯50%多數(shù)原則腐爛莖線蟲系統(tǒng)發(fā)育樹(支點(diǎn)的數(shù)值為貝葉斯后驗(yàn)概率)Fig.3 Phylogenetic tree based on Bayesian 50% majority principle of r DNA-ITS sequence from D.destructor(the value of the pivot points is the Bayesian posterior probability)

3 討論

本研究應(yīng)用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)的方法對青海當(dāng)歸麻口病的病原線蟲進(jìn)行鑒定,將其定為腐爛莖線蟲(D.destructor),這一結(jié)果證明腐爛莖線蟲在青海省互助縣和大通縣已定殖,并侵染當(dāng)歸。

國內(nèi)外關(guān)于腐爛莖線蟲的研究發(fā)現(xiàn),腐爛莖線蟲種內(nèi)存在明顯的分化現(xiàn)象,在致病力方面,來自不同寄主的群體存在差異,但尚未劃分出生理小種[14]。在抗藥性方面,丁中等[16-17]研究表明,不同地區(qū)的腐爛莖線蟲群體對不同類型殺線劑的抗性存在差異。在基因型方面,國內(nèi)學(xué)者[18-21]根據(jù)r DNA-ITS片段長度將腐爛莖線蟲群體分為A(或S)類型和B(或L)類型,而Subbtion等[15]根據(jù)r DNA-ITS二級結(jié)構(gòu)將世界范圍內(nèi)不同寄主上的腐爛莖線蟲群體分為A～G 7個(gè)基因型,中國腐爛莖線蟲群體分為除G基因型之外的其他6個(gè)基因型,以A基因型群體為主。Arnika等[22]根據(jù)A～G不同基因型ITS1的主要差異區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物,通過特異性引物PCR擴(kuò)增結(jié)果確定腐爛莖線蟲的不同基因型。本研究對采集青海省當(dāng)歸麻口病上的4個(gè)線蟲群體進(jìn)行形態(tài)觀察及測量,發(fā)現(xiàn)該4個(gè)群體形態(tài)特征與劉維志等[24]和謝輝[9]對腐爛莖線蟲的描述基本一致,蟲體測計(jì)值與王玉娟等[23]的描述存在差異,雄蟲尾長與c值略大,雄蟲c值較陳品三等[25]報(bào)道的略小,其他各形態(tài)測量值范圍基本一致;整體測量值與劉維志等[24]、謝輝[9]、Goodey[26]和Thorne[27]的報(bào)道基本保持一致,符合腐爛莖線蟲模式種的測量值范圍,而形態(tài)測量值存在的微小差異,可能是由于地理環(huán)境差異或寄主不同造成的。通過r DNA-ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析,發(fā)現(xiàn)青海當(dāng)歸線蟲群體與腐爛莖線蟲群體聚為一支,其中HZA2群體與F基因型腐爛莖線蟲群體親緣關(guān)系較近,HZA1、HZA3和DTA1群體與其他型腐爛莖線蟲親緣關(guān)系都比較遠(yuǎn)。經(jīng)r DNA-ITS區(qū)PCRRFLP分析,青海當(dāng)歸線蟲群體與A-G基因型均

存在差異,不能歸于A-G任何一基因型,對于其 基因型界定,有待進(jìn)一步探索研究。

D.destructor是一種多食性、遷移性植物內(nèi)寄生線蟲,其寄主約100多種[7,28-29],包括當(dāng)歸、黨參、人參和薄荷等藥材。另外,青海當(dāng)歸腐爛莖線蟲群體與甘肅定西、岷縣等地當(dāng)歸群體、黨參群體在致病性上是否存在差異,是否能侵染黨參,以及不同地區(qū)當(dāng)歸腐爛莖線蟲在耐寒性、耐鹽性等其他生物學(xué)特性方面是否有差異尚待研究。