黃 蓓 陳 鋒△ 楊 柯 楊 磊 李潤強

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200）

炎性疼痛（inflammatorypain）系在無外部觸發(fā)因素下的自發(fā)性疼痛，是臨床常見的病理性疼痛，骨關(guān)節(jié)炎痛、跌打腫痛炎癥產(chǎn)生的疼痛則是骨組織、肌肉組織炎癥病變引起的疼痛，是慢性炎性痛的易發(fā)部位。目前，炎性疼痛治療臨床多用抑制疼痛的西藥，一類為麻醉性鎮(zhèn)痛藥物，鎮(zhèn)痛效果雖好，但抗炎作用并不理想，且長期使用副作用較大［1］；另一類為非甾體類解熱鎮(zhèn)痛藥物，但主要用來治療輕中度疼痛，對炎性痛的緩解和治療效果并不好，且存在腎損害、抗血小板凝聚、水腫、誘發(fā)消化道潰瘍等諸多不良反應(yīng)［2］。傳統(tǒng)中藥復(fù)方有著多靶點、不良反應(yīng)少等獨特優(yōu)勢，為炎性疼痛的治療提供了新的選擇。近年來，運用中藥熱熨治療骨傷科炎性疼痛特別是寒性炎痛有很多成功病例［3-9］。

“燙療藥”是由筆者所在醫(yī)院全國名老中醫(yī)、全國名老中醫(yī)藥專家第二批帶徒導(dǎo)師李桂文教授擬方的院內(nèi)中藥制劑，具有獨特的壯瑤醫(yī)特色。燙療藥屬于典型的中藥熱熨制劑，用時可反復(fù)蒸熱熨燙敷于患處，也可置熱跌打藥酒中反復(fù)燙洗。全方具活血化瘀、溫通經(jīng)脈、抗炎鎮(zhèn)痛止痹之功，可用于骨關(guān)節(jié)炎痛、風(fēng)濕骨痛、坐骨神經(jīng)痛、跌打腫痛、腰及頸椎增生引起的疼痛等［10-13］。本研究通過小鼠熱板法、小鼠扭體法、小鼠耳郭腫脹法、小鼠足跖腫脹法、小鼠棉球植入法［14］，研究燙療藥鎮(zhèn)痛和抗炎作用，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級KM小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄兼用，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004。標(biāo)準(zhǔn)條件飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食、飲水，環(huán)境溫度（22±2）℃、相對濕度65%～70%，人工黑暗和光照交替，使用許可證號：SYXK（桂）2019-0001。

1.2 實驗藥物

燙療藥（寬筋藤、大黃、大駁骨、蘇木、桂枝、川烏、草烏、大羅傘、小羅傘、續(xù)斷、姜黃、骨碎補、艾葉、澤蘭、防風(fēng)），將藥材加適量蒸餾水煎煮20 min，過濾，濃縮得0.6 g/mL的棕黃色藥液，待藥液冷卻后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。由廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院藥物研發(fā)中心自制，規(guī)格：150 g/包，批準(zhǔn)文號：桂藥制字Z01060103。生產(chǎn)批號：20201009）。雙氯芬酸二乙胺乳膠劑（扶他林，GSK Consumer Healthcare Schweiz AG，2X8C）。

1.3 試劑與儀器

0.9%氯化鈉注射液（回音必集團(tuán)江西東亞制藥有限公司，2020060117）；75%酒精（武漢市雪環(huán)醫(yī)用消毒用品有限公司，20210101）；冰乙酸（成都市科隆化學(xué)品有限公司，2018071701）；二甲苯溶液（成都市科隆化學(xué)品有限公司，2020042101）；復(fù)方醋酸地塞米松乳膏（華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，2019016X）；注射用青霉素鈉（江西省科達(dá)動物藥業(yè)有限公司，20210427）；水合氯醛（成都市科隆化學(xué)品有限公司，2018091101）。熱板儀（RB-200智能熱板儀）、BSA223S萬分之一天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）、PV-200足跖容積測量儀（成都泰盟軟件有限公司）、MLS-3781L-PC（高壓蒸汽滅菌器）、101-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱恒溫干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.4 熱板實驗

1.4.1 動物篩選 將熱板儀調(diào)至（55±0.5）℃，將雌性小鼠置于熱板上，密切觀察小鼠反應(yīng)，以舔后足為痛覺敏感指標(biāo)。秒表記錄從將小鼠置于熱板上到出現(xiàn)舔后足的時間，共兩次，每次間隔5 min，取其均值為該小鼠的痛閾值。痛覺反應(yīng)過敏（跳躍、逃竄或痛閾值小于10 s）或痛反應(yīng)遲鈍（痛閾值大于30 s）的小鼠棄去不用，篩選出其他符合要求的動物進(jìn)行實驗。

1.4.2 分組與給藥 將篩選合格的60只雌性KM小鼠按痛閾值分為5組，即空白對照組，陽性對照組，燙療藥高、中、低劑量組，每組12只?？瞻讓φ战M、陽性對照組小鼠腳掌分別涂抹0.9%氯化鈉注射液0.1 mL、扶他林0.1 mg，每日1次，連續(xù)7 d給藥。燙療藥組用燙療藥藥液50 mL將醫(yī)用紗布浸潤后平鋪于干凈飼養(yǎng)盒中，將動物置于盒中自由活動30 min，燙療藥低劑量組每天1次，中劑量組每天2次，高劑量組每天3次，連續(xù)7 d。分別在給藥后第2日、第4日、第7日，用熱板法依次測定各鼠痛閾值2次（每次間隔2 h），如小鼠60 s內(nèi)仍未產(chǎn)生疼痛反應(yīng)，應(yīng)立即取出不再刺激，痛閾值按60 s計算。鎮(zhèn)痛率（%）=（用藥組平均痛閾值-空白對照組平均痛閾值）÷空白對照組平均痛閾值×100%。

1.5 扭體實驗

取健康KM小鼠60只，雌雄各半，隨機分為5組，分組及給藥方法同熱板法，末次給藥24 h后，每只小鼠注射0.6%冰醋酸0.2 mL/10 g，觀察10 min內(nèi)扭體反應(yīng)次數(shù)。鎮(zhèn)痛率（%）=（空白對照組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù)）÷空白對照組扭體次數(shù)×100%

1.6 耳郭腫脹實驗

取健康KM小鼠70只，雌雄兼用，按體質(zhì)量隨機分為5組，即空白對照組，陽性對照組，燙療藥高、中、低劑量組，每組14只（雌性6只，雄性8只）?？瞻讓φ战M和陽性對照組小鼠右耳外耳郭中央分別涂抹0.9%氯化鈉注射液0.1 mL、復(fù)方醋酸地塞米松乳膏0.1 mg，每日1次，連續(xù)7 d。燙療藥組小鼠右耳外耳郭中央涂抹燙療藥藥液0.1 mL，低劑量組每天1次，中劑量組每天2次，高劑量組每天3次，連續(xù)7 d。末次給藥后24 h，在小鼠左右耳外耳郭的中央分別滴加二甲苯20 μL，1 h后將小鼠脫頸椎處死，剪下雙耳，用8 mm直徑打孔器在兩耳相同部位打下耳片并稱重。耳郭腫脹率（%）=（右耳耳片重-左耳耳片重）÷左耳耳片重×100%

1.7 足跖腫脹實驗

將健康KM小鼠60只，雌雄各半，隨機分為5組，即空白對照組，陽性對照組，燙療藥高、中、低劑量組，每組12只。分別在每只小鼠右后肢踝關(guān)節(jié)處畫上閉合的標(biāo)記線，用足跖容積測量儀測得小鼠平齊標(biāo)記線下的足跖體積作為致炎前足跖容積?？瞻讓φ战M、陽性對照組小鼠右后肢踝關(guān)節(jié)處涂抹0.9%氯化鈉注射液0.1 mL、復(fù)方醋酸地塞米松乳膏0.1 mg，每日1次，連續(xù)7 d。燙療藥組小鼠右后肢踝關(guān)節(jié)處涂抹燙療藥藥液0.1 mL，低劑量組每天1次，中劑量組每天2次，高劑量組每天3次，連續(xù)7 d。末次給藥后24 h，在每只小鼠右后足跖向腳掌處注射新鮮雞蛋清0.1 mL，分別于1、2、4、6 h同一部位測2次小鼠足跖容積，取平均值作為致炎后足跖容積。足跖腫脹率（%）=（致炎后足跖容積-致炎前足跖容積）÷致炎前足跖容積×100%

1.8 棉球植入實驗

將脫脂棉制成約10 mg緊致的小棉球，高壓滅菌后置于恒溫干燥箱60℃干燥3 h后保存?zhèn)溆?。將健康KM小鼠60只，雌雄各半，隨機分為5組，即空白對照組，陽性對照組，燙療藥高、中、低劑量組，每組12只。每只小鼠經(jīng)10%水合氯醛（0.1 mL/只）麻醉后，75%酒精消毒，在無菌條件下切開小鼠背部皮膚，向左右腋下各植入棉球1個，縫合切口，術(shù)后每只小鼠連續(xù)3 d注射青霉素（0.2 mL/只，8萬單位）。空白對照組、陽性對照組小鼠腳掌處分別涂抹0.9%氯化鈉注射液0.1 mL、復(fù)方醋酸地塞米松乳膏0.1 mg，每日1次，連續(xù)14 d；燙療藥組小鼠給藥方法同熱板法燙療藥組給藥方法，連續(xù)14 d。末次給藥24 h后，將小鼠脫頸椎處死，剪開皮膚，剝?nèi)庋拷M織的棉球，于恒溫干燥箱60℃干燥1 h后稱重。肉芽腫凈量（mg）=干燥后棉球肉芽腫重量-原棉球重量。棉球肉芽抑制率（%）=（空白對照組肉芽腫凈量-給藥組肉芽腫凈重）÷空白對照組肉芽腫凈重×100%

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。實驗數(shù)據(jù)結(jié)果以（）表示，對數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗作組間比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠痛閾值及鎮(zhèn)痛率的比較

見表1。與空白對照組相比，燙療藥高、中、低劑量組在給藥的第2、4、7日均可一定程度延長小鼠痛閾值，且中劑量連續(xù)給藥7 d可明顯提高小鼠的痛閾值（P＜0.05），鎮(zhèn)痛率達(dá)79.73%，表明燙療藥對熱所致疼痛有鎮(zhèn)痛效果。燙療藥各劑量組間及與陽性對照組間比較無顯著差異（P＞0.05）。

表1 各組小鼠痛閾值及鎮(zhèn)痛率的比較（±s）

表1 各組小鼠痛閾值及鎮(zhèn)痛率的比較（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組 別n 給藥前痛閾值（s）給藥后第2日痛閾值（s） 鎮(zhèn)痛率（%）給藥后第4日痛閾值（s） 鎮(zhèn)痛率（%）給藥后第7日痛閾值（s） 鎮(zhèn)痛率（%）12 12 12 12 12空白對照組陽性對照組燙療藥低劑量組燙療藥中劑量組燙療藥高劑量組21.05±5.63 24.05±6.16 22.10±5.89 20.99±6.15 23.10±5.69 15.85±3.09 20.17±5.87*17.19±5.47 16.82±5.28 19.16±8.48-27.29 8.50 6.15 20.92 14.52±6.24 15.53±5.18 14.89±4.02 13.30±2.75 18.89±9.41-6.96 2.52-8.43 30.09 14.22±4.16 14.82±5.70 16.71±6.59 25.55±15.11*15.14±6.20-4.29 17.56 79.73 6.52

2.2 各組小鼠扭體次數(shù)的比較

見表2。與空白對照組相比，燙療藥各劑量組小鼠扭體次數(shù)均顯著降低（P＜0.05），且鎮(zhèn)痛率與給藥次數(shù)相關(guān)；與陽性對照組相比，燙療藥高劑量組小鼠的扭體次數(shù)顯著減少（P＜0.01），且鎮(zhèn)痛率達(dá)77.78%，表明燙療藥對冰醋酸所致疼痛具有良好的鎮(zhèn)痛效果。各燙療組間比較無顯著差異（P＞0.05）。

表2 各組小鼠扭體次數(shù)及鎮(zhèn)痛率的比較（±s）

表2 各組小鼠扭體次數(shù)及鎮(zhèn)痛率的比較（±s）

組 別n 扭體次數(shù)（次） 鎮(zhèn)痛率（%）空白對照組陽性對照組燙療藥低劑量組燙療藥中劑量組燙療藥高劑量組12 12 12 12 12 18.75±6.70 12.42±5.68*12.18±7.15*9.83±6.07**4.17±5.08**△-33.78 35.11 47.56 77.78

2.3 各組小鼠耳郭腫脹情況比較

見表3。與空白對照組比較，燙療藥各劑量均能引起二甲苯致小鼠耳郭腫脹度、耳郭腫脹率明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），提示燙療藥對二甲苯所致的小鼠耳郭腫脹沒有明顯的抑制作用。燙療藥各劑量組間及與陽性對照組間比較無顯著差異（P＞0.05）。

表3 各組小鼠耳郭腫脹情況比較（±s）

表3 各組小鼠耳郭腫脹情況比較（±s）

組別空白對照組陽性對照組燙療藥低劑量組燙療藥中劑量組燙療藥高劑量組n 14 14 14 14 14耳郭腫脹度（mg）1.44±1.68 2.81±2.98 2.81±1.71*3.67±2.48*4.17±2.53**耳郭腫脹率（%）20.74 51.02 35.25 44.67 51.14

2.4 各組小鼠足跖腫脹情況比較

見表4。與空白對照組比較，給予燙療藥1 h后開始顯著降低雞蛋清所致小鼠足跖容積和足跖腫脹率的升高（P＜0.05～0.01），高、中劑量藥效可維持4h，低劑量可維持2 h。燙療藥各組小鼠的足趾腫脹率與給藥次數(shù)呈量效關(guān)系，表明燙療藥對雞蛋清致炎作用具有明顯抑制作用。與陽性對照組比較，燙療藥低劑量組給藥6 h后，小鼠足跖腫脹度升高有顯著差異（P＜0.01），燙療藥各劑量組間無顯著差異（P＞0.05）。

表4 各組小鼠足趾腫脹情況的比較

2.5 各組小鼠肉芽組織增生的比較

見表5。與空白對照組相比，燙療藥中劑量組可顯著減少小鼠棉球肉芽腫組織增生（P＜0.01），抑制率達(dá)36.94%，高、低劑量有一定程度減少小鼠棉球肉芽腫組織增生作用，表明燙療藥對小鼠棉球肉芽腫增生具有明顯抑制作用。燙療藥各劑量組間及與陽性對照組間比較無顯著差異（P＞0.05）。

表5 各組小鼠肉芽腫情況的比較

3 討論

在鎮(zhèn)痛實驗中，通過熱板法可知燙療藥各劑量組在給藥的第2、4、7日均可延長小鼠痛閾值，其中燙療藥中劑量組在給藥的第7日明顯提高了小鼠的痛閾值；通過扭體法可知燙療藥各劑量組均不同程度地顯著減少小鼠的扭體次數(shù)，鎮(zhèn)痛率與給藥次數(shù)呈正相關(guān)?？寡讓嶒炛?，燙療藥各劑量組對二甲苯致小鼠耳郭腫脹度均有明顯升高；燙療藥各劑量給藥后1 h對新鮮雞蛋清所致小鼠足跖容積和足跖腫脹率明顯降低，高、中劑量藥效可維持4 h，低劑量可維持2 h；燙療藥各劑量組小鼠棉球肉芽腫凈量明顯降低，其中燙療藥中劑量組效果最顯著。以上結(jié)果表明燙療藥在鎮(zhèn)痛方面，對冰醋酸誘發(fā)的炎性疼痛具有較好的鎮(zhèn)痛效果；在抗炎作用方面，燙療藥對急性滲出性炎性水腫無明顯抑制作用，對雞蛋清所致小鼠急性足趾腫脹具有較好的抑制作用，對炎癥后期肉芽組織增生具有明顯抑制作用。

燙療藥抗炎鎮(zhèn)痛作用可能與熱敏通道TRP有關(guān)。TRP介導(dǎo)多種急慢性炎癥疼痛，除了溫度和機械刺激，多種辛味中藥如吳茱萸、白芥子、生姜、肉桂、大蒜、白芷等的活性成分，以及內(nèi)源性H+及炎癥介質(zhì)都能夠激活熱敏通道［15］。當(dāng)組織受損傷時，受損傷細(xì)胞會釋放大量的炎性介質(zhì)，如H+、K+、緩激肽、組胺、ATP、5-HT和NO等，內(nèi)源性炎性介質(zhì)通過多種信號通路進(jìn)一步激活熱敏通道而引起疼痛［16］，這種情況稱為區(qū)域敏化。在激動劑、溫度和炎癥等相關(guān)因素的綜合作用下，熱敏通道致敏，產(chǎn)生炎癥病理證候。有學(xué)者的相關(guān)研究也證實了關(guān)節(jié)炎性小鼠在后期表現(xiàn)出機械性痛覺過敏減輕與TRPV1通道缺失有關(guān)［17］。燙療藥可能正是應(yīng)用TRPV1、TRPA1作用機制，通過減少炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，抑制TRP激動劑炎性因子的活性，脫敏TRP通道，起到抗炎鎮(zhèn)痛的作用，另外處方里溫?zé)崴幈旧硭腡RPV1激動劑和燙療藥熱熨時的較高溫度激活TRPV1通道，產(chǎn)生熱感；達(dá)到一定條件后，抑制低溫及炎性因子等TRPA1激動劑的活性，交叉脫敏TRPA1通道，從而消除低溫及炎癥誘發(fā)的冷痛，發(fā)揮散寒止痛的作用，關(guān)于燙療藥抗炎鎮(zhèn)痛的作用分子機理還有待進(jìn)一步的研究。

燙療藥以瑤藥寬筋藤（青坐翁）、大駁骨祛風(fēng)止痛、舒筋活絡(luò)為君，臣以壯藥大羅傘、小羅傘祛風(fēng)濕、止痹痛；佐以川烏、草烏、防風(fēng)祛風(fēng)濕，溫經(jīng)止痛；艾葉溫經(jīng)散寒止痛；骨碎補、續(xù)斷續(xù)筋接骨、補腎強骨；大黃、蘇木、澤蘭、姜黃活血化瘀止痛，體現(xiàn)“治風(fēng)先治血，血行風(fēng)自滅”的治療理念，活血化瘀藥與溫經(jīng)散寒藥合用，使血得溫則行，血行瘀消，諸癥自愈。全方共奏活血祛瘀、解痙止痛之功。中藥燙療經(jīng)過加熱外熨敷于患收，藥力經(jīng)皮入肉、從筋至骨、從外到內(nèi)，起到溫經(jīng)通絡(luò)、祛風(fēng)散寒的功效，從而更好地發(fā)揮其活血化瘀、舒筋活絡(luò)、消腫止痛的作用。