孫 浩 李 姣 張小燕 郭 濱 畢宏生 王興榮

葡萄膜黑色素瘤是眼科臨床常見的眼內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤之一，按發(fā)病部位可分為睫狀體黑色素瘤、脈絡(luò)膜黑色素瘤，其中脈絡(luò)膜黑色素瘤發(fā)病率最高，占葡萄膜黑色素瘤的85%以上[1]。研究發(fā)現(xiàn)，高增殖活性及易發(fā)生眼外轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致葡萄膜黑色素瘤診療困難及患者死亡率高的主要原因，并且腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是一個依賴于血管形成才能完成的過程，有超過 90%的患者會因此死于肝轉(zhuǎn)移[2]?，F(xiàn)有的研究證實，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原，能使血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生形態(tài)變化、轉(zhuǎn)移、分裂，進(jìn)而促進(jìn)新生血管形成和增強(qiáng)血管通透性[3]。因此，抑制腫瘤VEGF的生成被認(rèn)為是一種有效的抗腫瘤治療策略[4]。

石蒜堿從石蒜的鱗莖中提取而來，屬于吡咯苯三甲酸生物堿類抗氧化劑，擁有廣泛的抗病毒、抗炎、抗腫瘤等作用[5]。近年來，石蒜堿的潛在抗腫瘤特性受到了廣泛的關(guān)注。以往的研究表明，石蒜堿對乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、肝細(xì)胞癌、胃癌等多種惡性腫瘤具有一定的抑制作用[6]。Cao 團(tuán)隊在研究侵襲性極高的卵巢癌 Hey1B細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)，鹽酸石蒜堿在體內(nèi)可以顯著抑制異種移植的 Hey1B 小鼠體內(nèi)卵巢癌細(xì)胞新生血管的生成，并且能夠抑制血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(VE-cadherin)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和信號素 4D(Sema4D)等血管生成關(guān)鍵基因的表達(dá)[7-8]。因此，我們推測石蒜堿可能可以通過抑制VEGF的表達(dá)，進(jìn)而對葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用，從而達(dá)到抗葡萄膜黑色素瘤的目的。故本研究重點探討石蒜堿對葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞的影響，并分析其潛在的作用機(jī)制，為石蒜堿用于葡萄膜黑色素瘤的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料B16F10 細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。石蒜堿(北京儀化通標(biāo)科技有限公司，分子式C16H17NO4,HPLC≥98%，使用含體積分?jǐn)?shù) 0.1% DMSO 的 DMEM 配制為不同濃度用于實驗);胎牛血清(GICO公司，美國);DMEM 培養(yǎng)液(Hyclone公司，美國)。ELISA試劑盒(上海將來實業(yè)股份有限公司)；流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期與凋亡試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；CCK-8試劑盒和PCR試劑盒(山東思科捷生物科技有限公司)。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。裂隙燈顯微鏡(ZEISS，德國)；高倍顯微鏡(Leica-M841型，德國)；Bio-Tek酶標(biāo)儀(ELX-800，美國)；流式細(xì)胞儀(BD FACSVerse，美國)；快速溫度梯度PCR儀(TaKaRa，日本)；熒光定量PCR(RT-PCR)儀(羅氏480，德國)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組B16F10細(xì)胞使用含體積分?jǐn)?shù)10% 胎牛血清和100 mg·L-1鏈霉素、100×103U·L-1青霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2.5 g·L-1胰蛋白酶消化、傳代，取3～6代細(xì)胞用于實驗。實驗分6組，分別為0 μmol·L-1組(對照組)、1.560 μmol·L-1組、3.125 μmol·L-1組、6.250 μmol·L-1組、12.500 μmol·L-1組、25.000 μmol·L-1組，在B16F10細(xì)胞的DMEM培養(yǎng)基中分別加入相應(yīng)濃度的石蒜堿處理細(xì)胞，其中，對照組B16F10細(xì)胞正常培養(yǎng)，不添加石蒜堿。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞存活率將密度為1×104個·mL-1的B16F10細(xì)胞懸浮液接種到96 孔板內(nèi)，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng) 24 h。去上清，分組處理細(xì)胞(每組設(shè)3個復(fù)孔)后，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h。每孔加入 10 μL的 CCK-8 溶液，無菌培養(yǎng)箱孵育1 h后，酶標(biāo)儀450 nm波長檢測各孔光密度(D)，實驗重復(fù)3次。描繪生長曲線，計算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.3 RT-PCR檢測各組細(xì)胞VEGF-A mRNA 的表達(dá)水平B16F10細(xì)胞分組處理24 h后，離心收集各組細(xì)胞，按照試劑盒說明書提取RNA，用微量紫外可見光分光光度計定量RNA濃度，然后采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。引物序列：VEGF-A mRNA上游引物為5’-GCCCTTGCCTTGCTGCTCTACC-3’，下游引物為5’-GTGATGATTCTGCCTCCTCCTTC-3’；β-actin上游引物為5’-TCATGCGGATCAAACCTCACC-3’，下游引物為5’-TCACCGCCTTGGCTTGTCAC-3’。參照RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:95 ℃ 3 min 預(yù)變性；95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,40 個循環(huán)，然后 95 ℃ 60 s,60 ℃ 60 s。實驗重復(fù)2次。

1.2.4 ELISA檢測各組細(xì)胞VEGF-A蛋白的表達(dá)B16F10細(xì)胞分組處理24 h后，收集細(xì)胞上清液200 μL,嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測各組VEGF-A蛋白表達(dá)情況。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測

1.2.5.1 細(xì)胞周期檢測取生長狀態(tài)良好并且處于對數(shù)生長期的B16F10細(xì)胞，經(jīng) PBS 清洗、胰蛋白酶消化計數(shù)后，按每孔3×105個細(xì)胞接種于6孔板上，于 37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24 h。去上清，分組處理后繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，1000 r·min-1離心 4 min，沉淀細(xì)胞。加入1 mL冰浴預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管內(nèi)。加入1 mL冰浴預(yù)冷體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，輕輕吹打混勻，4 ℃固定12 h。將固定好的細(xì)胞離心去除乙醇，用預(yù)冷的 PBS 輕輕清洗 2遍后，加入0.5 mL 預(yù)冷的 PBS 重懸細(xì)胞。每管細(xì)胞樣品中加入按照細(xì)胞周期檢測試劑盒說明書配制的碘化丙啶染色液0.5 mL，緩慢并充分重懸細(xì)胞沉淀，37 ℃避光溫浴30 min，流式細(xì)胞儀行細(xì)胞周期檢測。

1.2.5.2 細(xì)胞凋亡檢測B16F10細(xì)胞經(jīng)PBS清洗、胰蛋白酶消化計數(shù)后，按每孔3×105個細(xì)胞接種于6孔板上，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24 h后去上清，分組處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清，細(xì)胞使用PBS洗滌，加入適量胰蛋白酶消化液消化，2 min后加入剛才收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清，1000 r·min-1離心4 min，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計數(shù)。取(5～10)×104個重懸的細(xì)胞，1000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC，最后加入10 μL碘化丙啶染色液輕輕混勻。室溫(20～25 ℃)避光孵育15 min，隨后置于冰浴中，使用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法檢測石蒜堿作用后各組細(xì)胞存活率CCK-8法檢測結(jié)果顯示，對照組、1.560 μmol·L-1、3.125 μmol·L-1、6.250 μmol·L-1、12.500 μmol·L-1、25.000 μmol·L-1石蒜堿作用于B16F10細(xì)胞24 h后，各組細(xì)胞存活率分別為100.00%、97.27%、89.67%、68.35%、36.65%、1.72%。可見，隨著石蒜堿作用濃度的增加，B16F10細(xì)胞存活率逐漸降低。根據(jù)細(xì)胞生長曲線,計算得出石蒜堿的IC50為7.950 μmol·L-1。

2.2 RT-PCR檢測各組細(xì)胞 VEGF-A mRNA表達(dá)RT-PCR檢測結(jié)果顯示，對照組、1.560 μmol·L-1組、3.125 μmol·L-1組、6.250 μmol·L-1組、12.500 μmol·L-1組、25.000 μmol·L-1組B16F10細(xì)胞VEGF-A mRNA相對表達(dá)量分別為1.00±0.01、0.95±0.02、0.82±0.01、0.78±0.01、0.69±0.01、0.58±0.01。各組B16F10細(xì)胞間VEGF-A mRNA相對表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=186.90，P=0.003)。兩兩比較結(jié)果顯示，與對照組相比，12.500 μmol·L-1組、25.000 μmol·L-1組石蒜堿下調(diào)B16F10細(xì)胞VEGF-A mRNA的表達(dá)較為顯著(均為P<0.01)，3.125 μmol·L-1，6.250 μmol·L-1組石蒜堿下調(diào)VEGF-A mRNA的表達(dá)也較明顯(均為P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；與對照組相比，1.560 μmol·L-1組B16F10細(xì)胞VEGF-A mRNA的表達(dá)下降不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 ELISA檢測各組細(xì)胞VEGF-A蛋白表達(dá)ELISA檢測結(jié)果顯示，對照組、1.560 μmol·L-1組、3.125 μmol·L-1組、6.250 μmol·L-1組、12.500 μmol·L-1組、25.000 μmol·L-1組B16F10細(xì)胞VEGF-A蛋白含量分別為(97.06±0.75)ng·L-1、(80.22±0.18)ng·L-1、(71.36±0.14)ng·L-1、(68.49±0.10)ng·L-1、(62.95±0.39)ng·L-1、(56.11±0.20)ng·L-1，各組B16F10細(xì)胞間VEGF-A蛋白含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=278.50，P=0.002)。兩兩比較結(jié)果顯示，與對照組相比，12.500 μmol·L-1、25.000 μmol·L-1組B16F10細(xì)胞VEGF-A蛋白含量下降較為顯著(均為P<0.01)，3.125 μmol·L-1，6.250 μmol·L-1組VEGF-A含量下降也較為明顯(均為P<0.05)，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義；與對照組相比，1.560 μmol·L-1組B16F10細(xì)胞VEGF-A含量下降不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測

2.4.1 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期結(jié)果顯示，石蒜堿干預(yù)B16F10細(xì)胞24 h后，G1期細(xì)胞比例明顯增加，G2期細(xì)胞比例明顯減少，各組B16F10細(xì)胞間G1期、G2期細(xì)胞比例差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)，S期細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.329)。兩兩比較結(jié)果顯示，不同濃度石蒜堿組與對照組相比，B16F10細(xì)胞間G1期、G2期細(xì)胞周期比例差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)，其中25.000 μmol·L-1組石蒜堿G1期細(xì)胞比例上升與G2期細(xì)胞比例下降最為明顯，與其他濃度石蒜堿組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)(表1)。

表1 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期結(jié)果

2.4.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，對照組破碎、壞死細(xì)胞的比例為0.04%,細(xì)胞凋亡率為0.00%;1.560 μmol·L-1組、3.125 μmol·L-1組、6.250 μmol·L-1組、12.500 μmol·L-1組、25.000 μmol·L-1組的石蒜堿處理B16F10細(xì)胞24 h后，破碎、壞死細(xì)胞的比例分別為7.43%、7.56%、7.44%、7.88%、8.38%,細(xì)胞凋亡率分別為12.80%、12.86%、16.68%、18.54%、22.20%。與對照組相比，12.500 μmol·L-1組、25.000 μmol·L-1組的石蒜堿干預(yù)24 h后，細(xì)胞凋亡比例明顯上升,正常細(xì)胞比例明顯下降(分別占72.04%和68.43%)。表明石蒜堿可以顯著促進(jìn)B16F10細(xì)胞的凋亡，并呈濃度依賴性(圖1)。

圖1 石蒜堿作用B16F10細(xì)胞后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果

3 討論

葡萄膜黑色素瘤是起源于葡萄膜黑色素細(xì)胞的眼內(nèi)惡性腫瘤，雖然相對罕見，但惡性程度極高，且極易發(fā)生轉(zhuǎn)移[9]。葡萄膜黑色素瘤起病隱匿，早期無典型癥狀，容易漏診或誤診，確診時患者病情往往已進(jìn)展至中后期，治療難度提升。盡管現(xiàn)有的診療手段不斷進(jìn)步，但患者總體生存率依然較低，預(yù)后不佳[10]。目前手術(shù)切除能夠挽救大多數(shù)原發(fā)性葡萄膜黑色素瘤患者的生命，但超過50%的葡萄膜黑色素瘤會發(fā)生擴(kuò)散，一旦發(fā)生擴(kuò)散，5年生存率僅為43%[11]。研究表明，腫瘤的產(chǎn)生、發(fā)育及擴(kuò)散均依賴血管提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)，運(yùn)走代謝廢物，以利于腫瘤快速繁殖，并且新生血管也為腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供了條件[12]。如果能成功阻斷或抑制腫瘤血管的新生，切斷其營養(yǎng)途徑，腫瘤細(xì)胞將會停止增殖而死亡，從而達(dá)到治療腫瘤的目的，這也正是國際上飽受關(guān)注的抗腫瘤血管形成療法[13]。

石蒜堿作為從石蒜科植物中提取出的一種活性生物堿，具有抗病毒、抗細(xì)菌、抗過敏、抗瘧疾等多種生物學(xué)作用[14]。隨著對石蒜堿研究的不斷深入人們發(fā)現(xiàn),石蒜堿不但能夠調(diào)節(jié)絕大多數(shù)腫瘤分子靶點及信號通路，還可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，影響細(xì)胞周期，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[15]，以往的研究發(fā)現(xiàn)，石蒜堿對白血病、多發(fā)性骨髓瘤、前列腺癌、肝細(xì)胞癌和乳腺癌等腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的選擇性抑制作用[16]。Liu 等[17]在體外研究中發(fā)現(xiàn)，石蒜堿通過誘導(dǎo)髓細(xì)胞白血病基因-1(Mcl-1)蛋白水平的降低，而觸發(fā)內(nèi)源性線粒體途徑誘導(dǎo)的人白血病細(xì)胞凋亡。Jin 等[18]研究表明，石蒜堿可以抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖中起重要作用的 JAKS-TAT 信號通路，從而誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的死亡。Hu等[19]研究闡明，石蒜堿能夠通過調(diào)節(jié)STAT的表達(dá)來抑制前列腺癌細(xì)胞生長。Yu等[20]研究報道，石蒜堿通過失活TCRP1/Akt/mTOR通路從而促進(jìn)人肝癌細(xì)胞的自噬和凋亡。Ji 等[21]在石蒜堿抗人乳腺癌細(xì)胞的實驗中發(fā)現(xiàn)，石蒜堿可通過死亡受體途徑誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞 MCF-7 的凋亡。但迄今為止，石蒜堿對葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞的作用研究較少，機(jī)制尚不明確，阻礙了石蒜堿在眼科抗腫瘤藥物中的開發(fā)與應(yīng)用。

以往研究證實，腫瘤細(xì)胞的生長、增殖和擴(kuò)散與異常血管生成密切相關(guān)[22]。而VEGF在新生血管中扮演著重要的角色。在本實驗中，我們利用分子生物學(xué)技術(shù)研究了石蒜堿對葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞的作用，并探討了可能的機(jī)制。石蒜堿干預(yù)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞24 h后，CCK-8法檢測結(jié)果顯示，石蒜堿可以有效地抑制葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞的生長，降低其細(xì)胞活性，IC50為 7.950 μmol·L-1。同時，ELISA和RT-PCR檢測VEGF-A蛋白和VEGF-A mRNA結(jié)果顯示，石蒜堿能夠顯著抑制VEGF-A的表達(dá)，其中12.500 μmol·L-1和25.000 μmol·L-1的石蒜堿抑制效果顯著。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果提示，石蒜堿能夠誘導(dǎo)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞凋亡，并且使細(xì)胞周期阻滯在S期，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞增殖。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，石蒜堿可以誘導(dǎo)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，引起細(xì)胞S期阻滯，進(jìn)而降低細(xì)胞活性、抑制細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與石蒜堿能夠下調(diào)VEGF-A mRNA的表達(dá)、抑制VEGF-A蛋白分泌水平，進(jìn)而拮抗VEGF的生成有關(guān)。本研究進(jìn)一步證實了石蒜堿對葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞具有濃度依賴性的抑制作用，表明石蒜堿有潛力成為未來臨床治療葡萄膜黑色素瘤的候選藥物。