劉夏荔，馬惠強(qiáng)，黃凱峰，姬宇婷，楊 紅，*

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，上海 200080；2.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，天津 300020；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200080；4.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理系，天津 300020）

0 引言

納米醫(yī)學(xué)是化學(xué)、物理、生命科學(xué)、材料科學(xué)等傳統(tǒng)學(xué)科相融合的研究領(lǐng)域，其作為一個(gè)相對(duì)新的跨多學(xué)科研究方向備受關(guān)注[1]。納米醫(yī)學(xué)在藥物靶向輸送、高效疫苗、超靈敏分子診斷器件等應(yīng)用方向具有廣闊前景，有望促進(jìn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，改變目前行醫(yī)的方式。肺部疾病是導(dǎo)致人類死亡的主要疾病之一，每年因肺病死亡的人數(shù)占全球總死亡人數(shù)的1/6，預(yù)計(jì)到2030年，此比例將增加至1/5[2]。現(xiàn)已有許多研究表明納米醫(yī)學(xué)應(yīng)用在肺癌[3]、肺纖維化[4]、急性肺損傷[5]、哮喘[6]和其他肺部疾病的治療方面具有優(yōu)勢(shì)，其為肺部疾病的治療提供了新的干預(yù)手段。

本課題組前期合成了一種具有生物活性的新型多肽金納米粒P12[7]，由序列為CLPFFD的多肽包裹在金納米粒表面組成。課題組已證實(shí)P12可通過抑制Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）信號(hào)通路發(fā)揮抑炎效用，并且在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠模型中證實(shí)P12可通過誘導(dǎo)肺巨噬細(xì)胞向抑炎促修復(fù)的M2型分化進(jìn)而發(fā)揮治療作用[5]。此外，還發(fā)現(xiàn)與其他給藥方式（腹腔給藥和尾靜脈給藥）相比，氣道給藥途徑可使P12靶向肺巨噬細(xì)胞，提高其在靶細(xì)胞中的生物利用率[8]，在低濃度時(shí)就可達(dá)到較好的治療效果。

本課題組前期的研究表明P12在細(xì)胞水平具有良好的安全性，不影響人外周血單核細(xì)胞、人單核細(xì)胞白血病來源巨噬細(xì)胞和小鼠骨髓分化巨噬細(xì)胞的活力[5，9-10]。為了促進(jìn)P12的臨床轉(zhuǎn)化，本研究參考《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》（GLP）和已發(fā)表的系統(tǒng)評(píng)價(jià)金納米粒子/化療藥物在小動(dòng)物（小鼠、大鼠等）上的生物安全性文章[11-12]，探究經(jīng)氣道給藥時(shí)小鼠對(duì)P12的最大耐受劑量，并明確P12的急性毒性，以期評(píng)價(jià)P12的體內(nèi)安全性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)試驗(yàn)用野生型C57BL/6J雌性小鼠18只，7～8周齡，體質(zhì)量20～24 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。所有動(dòng)物試驗(yàn)操作均由上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后進(jìn)行。

1.2 裸金納米粒子與P12的制備

裸金納米粒子制備：將檸檬酸鈉（2mL，38.8mmol/L）加入到沸騰的氯金酸溶液（20 mL，1 mmol/L）中，持續(xù)攪拌并加熱15 min，冷卻后即得到粒徑約13 nm的裸金納米粒子。

P12合成：將體積比為1∶10的多肽溶液（1mmol/L）和裸金納米粒子混勻，避光靜置12 h，即可得到濃度為10 nmol/L的P12（如圖1所示）。

圖1 P12的制備示意圖

1.3 裸金納米粒子與P12的表征

利用透射電子顯微鏡（HITACHI，HT7700，日本）分別對(duì)合成的裸金納米粒子及P12的形貌及粒徑大小進(jìn)行表征：首先吸取5μL樣品滴加于銅網(wǎng)上，然后常溫靜置1 h，待樣品干燥后使用透射電子顯微鏡觀察成像結(jié)果并記錄保存（加速電壓80 kV）。此外，利用納米粒度儀（Malvern，Zetasizer NanoZS，英國）對(duì)裸金納米粒子及P12的粒度分布和分散特性進(jìn)一步驗(yàn)證：取1 mL樣品置于聚苯乙烯測(cè)試皿中，然后插入納米粒度儀樣品槽，選擇粒徑測(cè)量模式進(jìn)行粒徑大小檢測(cè)（溫度25℃，金折射率為0.2）。

1.4 氣道給藥方法

于腹腔注射1%的戊巴比妥鈉（45 mg/kg）麻醉18只小鼠，之后將小鼠呈仰臥位固定于泡沫板上，脫除頸前毛發(fā)，使用75%酒精浸潤的棉球消毒完成備皮。在小鼠頸前正中剪一道約3 mm的縱向切口，鈍性分離皮膚下的肌肉等組織，暴露氣管。用1 mL胰島素注射器抽取50μL的P12（125 nmol/L～2μmol/L）或磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）后，經(jīng)環(huán)甲膜刺入氣管內(nèi)，推動(dòng)注射器，見到紫紅色液體進(jìn)入氣道且小鼠呼吸變得急促，肺部聞及濕啰音，則可確認(rèn)藥物進(jìn)入肺部。

1.5 劑量遞增試驗(yàn)

將125 nmol/L作為P12的初始濃度經(jīng)小鼠氣道給藥（50μL），觀察并記錄一周內(nèi)小鼠每日的體質(zhì)量變化和臨床癥狀[11]。劑量遞增試驗(yàn)觀察設(shè)置2個(gè)終點(diǎn)指標(biāo)：體質(zhì)量下降＞15%或臨床癥狀評(píng)分＞2分。若一周內(nèi)沒有觀察到2種終點(diǎn)指標(biāo)，則在7 d觀察結(jié)束后，取新的一只小鼠經(jīng)氣道給予加倍濃度的P12，重復(fù)以上觀察，直至出現(xiàn)任一觀察終點(diǎn)指標(biāo)，或者給予的P12劑量達(dá)到2μmol/L（50μL）。當(dāng)滿足這2個(gè)終點(diǎn)指標(biāo)中的任何一個(gè)時(shí)，劑量遞增停止，并將此濃度的上一個(gè)濃度作為P12氣道給藥的最大耐受劑量。

1.6 急性毒性試驗(yàn)

隨機(jī)將12只小鼠分為3組（每組4只）：氣道給予50μL PBS的對(duì)照組、氣道給予50μL P12（500 nmol/L）的治療劑量組以及氣道給予50μL P12（2μmol/L）的大劑量組。在氣道給予PBS或P12 24 h后，取小鼠的主要臟器及血液，測(cè)量小鼠的臟器系數(shù)，檢測(cè)血常規(guī)、血生化，并確認(rèn)組織病理變化，以判斷P12是否有急性毒性。

1.6.1 血常規(guī)、血生化檢測(cè)

3組小鼠經(jīng)氣道給予P12 24 h后，經(jīng)心臟采血。將所得血液取0.l mL裝于含乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝劑的微量離心管中用于血常規(guī)檢測(cè)，余下約0.8 mL收集于不含抗凝劑的微量離心管中用于血生化檢測(cè)。通過自動(dòng)動(dòng)物血液細(xì)胞分析儀（BC-2800Vet）檢測(cè)含有EDTA抗凝劑的血液的全血細(xì)胞計(jì)數(shù)、分類計(jì)數(shù)信息。將不含抗凝劑的血液在3 500 r/min、4℃條件下離心10 min得到血清，并通過自動(dòng)生化分析儀（西門子ADVIA240）檢測(cè)血生化指標(biāo)，包括血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、尿素、血肌酐、總蛋白、白蛋白、球蛋白、鈉、鈣、磷、鉀的水平等。

1.6.2 肺組織病理切片制備和圖像評(píng)價(jià)

3組小鼠經(jīng)氣道給予P12 24 h后進(jìn)行安樂死，取小鼠的給藥部位（氣管）及胸腺、肺、心臟、肝、脾、腎、腎上腺等組織，置于4%多聚甲醛中浸泡固定，經(jīng)組織脫水、透明和浸蠟后取出于包埋框內(nèi)進(jìn)行包埋，制備石蠟切片。再經(jīng)過烤片、脫蠟、水化、蘇木精-伊紅染色、脫水、透明和封片后制備成病理切片。采用正置光學(xué)顯微鏡進(jìn)行圖像采集，由病理科醫(yī)生對(duì)圖像進(jìn)行評(píng)價(jià)分析。

1.6.3 臟器系數(shù)測(cè)定

3組小鼠經(jīng)氣道給予P12 24 h后進(jìn)行安樂死，取出肺、心臟、肝、脾和腎組織，在PBS中洗去表面血污，并在吸水紙上吸去表面水分后稱量質(zhì)量。用器官質(zhì)量除以小鼠體質(zhì)量即得到臟器系數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 7統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，2組間比較采用t檢驗(yàn)，2組以上組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P12的理化特性表征

P12由一個(gè)直徑為13 nm的裸金納米粒子和覆蓋在表面的短肽（序列為CLPFFD）涂層組成。與傳統(tǒng)的納米給藥系統(tǒng)不同，P12是一種不攜帶任何治療藥物但具有生物活性的納米粒子[7]。裸金納米粒子和P12的透射電子顯微鏡圖像顯示二者具有相似的均勻球形結(jié)構(gòu)，平均直徑為（13.0±0.4）nm[如圖2（a）所示]。采用動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)測(cè)定裸金納米粒子和P12的水化粒徑，結(jié)果顯示，P12的水化粒徑比裸金納米粒子大3.4 nm，表明P12表面存在多肽偶聯(lián)[如圖2（b）所示]。

圖2 P12的表征

2.2 小鼠氣道給予P12后7 d的毒性試驗(yàn)

將125 nmol/L（50μL）作為氣道給藥的初始劑量，直至給藥劑量（2μmol/L，50μL）到達(dá)治療劑量（500 nmol/L，50μL）的4倍，也沒有觀察到小鼠體質(zhì)量下降＞15%，并且臨床癥狀表現(xiàn)正常，包括自主活動(dòng)、精神狀態(tài)、毛色情況及給藥部位的局部狀態(tài)。由此可見，氣道給予P12的最大耐受劑量高于治療劑量。并且小鼠氣道給藥后7 d的體質(zhì)量變化與給予P12的劑量無明顯關(guān)系（如圖3所示），表明P12在治療劑量范圍內(nèi)沒有明顯毒副作用。

圖3 劑量遞增試驗(yàn)對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響結(jié)果

2.2.1 P12對(duì)小鼠的臟器系數(shù)及血常規(guī)的影響

3組小鼠經(jīng)氣道給藥后的臟器系數(shù)及血常規(guī)分析結(jié)果見表1。與對(duì)照組小鼠相比，治療劑量組和大劑量組小鼠在給藥后24 h的主要器官（包括肺、心、肝、脾和腎）臟器系數(shù)均無顯著變化。血常規(guī)分析結(jié)果表明，P12經(jīng)氣道給藥后對(duì)小鼠紅細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞壓積、白細(xì)胞數(shù)量、中性粒細(xì)胞百分比及單核細(xì)胞百分比等參數(shù)不產(chǎn)生影響。此外，治療劑量組和大劑量組的淋巴細(xì)胞百分比[（74.88±1.79）%、（76.10±1.77）%]與對(duì)照組[（78.40±1.05）%]相比，雖有所下降，但3組的淋巴細(xì)胞百分比均在正常范圍[（74.00±6.00）%]內(nèi)[12]。

表1 3組經(jīng)氣道給藥后的臟器系數(shù)及血常規(guī)分析結(jié)果

2.2.2 P12對(duì)小鼠血生化及組織病理的影響

血生化檢驗(yàn)結(jié)果顯示，治療劑量組以及大劑量組的小鼠經(jīng)氣道給予P12后，血清蛋白、肝酶、血清無機(jī)離子和腎功能指標(biāo)沒有顯著變化（見表2）。其中，總蛋白和球蛋白水平?jīng)]有顯著變化，谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶水平也無顯著改變，鈉、鈣、磷、鉀濃度也無顯著變化，尿素、血肌酐水平也沒有顯著變化。然而，大劑量組小鼠經(jīng)氣道給予P12后，白蛋白水平[（29.33±0.59）g/L）]與對(duì)照組[（31.25±1.01）g/L]相比有所下降，但是其值仍然在正常參考范圍內(nèi)[（28.90±2.47）g/L][13]。

表2 3組經(jīng)氣道給藥后的血生化分析結(jié)果

另外，取小鼠的給藥部位（氣管）及胸腺、肺、心、肝、脾、腎、腎上腺等臟器組織進(jìn)行病理學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)3組小鼠經(jīng)氣道給藥后并沒有造成各個(gè)器官及給藥部位的組織病理改變（如圖4所示）。這些結(jié)果表明氣道給予小鼠治療劑量和大劑量的P12不會(huì)產(chǎn)生急性毒性。

圖4 3組小鼠經(jīng)氣道給藥后的組織病理變化

3 討論

納米醫(yī)學(xué)作為一個(gè)相對(duì)新的跨多學(xué)科研究領(lǐng)域發(fā)展迅猛[14-15]。金納米粒子在疾病的治療及診斷中具有強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)，其不但可作為藥物遞送的載體，用于遞送小分子藥物、DNA、RNA、小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）、蛋白質(zhì)、多肽和抗體等[16]，還可通過多肽修飾技術(shù)賦予其新的抗炎活性。近年來，金納米粒子在治療肺部疾?。ǚ伟?、肺纖維化和急性肺損傷等）中展示出廣闊的應(yīng)用前景[14]，其作為新型納米藥物主要包括以下3個(gè)方面的優(yōu)勢(shì)：一是毒性低，易于合成且具有高比表面積，可用于裝載藥物和活性分子；二是可通過調(diào)整粒徑大小、形狀、表面電荷和表面涂層等途徑，使其具有新的生物活性；三是在組織中的濃度易被定量分析，便于對(duì)其進(jìn)行定位，以獲取其對(duì)組織和細(xì)胞的靶向性信息。

相較于金納米粒子的合成表征與醫(yī)學(xué)應(yīng)用拓展方面的研究，在體內(nèi)安全性及毒理學(xué)方面的研究目前相對(duì)較少[12]。隨著金納米粒子在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用，該信息變得非常重要。在安全性方面，以往的研究結(jié)果好壞參半，這可能是由于功能化的金納米粒子表面連接或裝載不同的活性分子，使其具有高度多樣性與異質(zhì)性，進(jìn)而表現(xiàn)出不同的安全性[16]。這些研究結(jié)果提示不同的金納米粒子制劑可能具有其獨(dú)特的生物活性、體內(nèi)分布和被清除能力。因此，在臨床研究前期，應(yīng)采用小動(dòng)物甚至大動(dòng)物對(duì)其安全性進(jìn)行測(cè)試[17]。

本研究對(duì)P12的表面電荷和粒徑大小等理化性質(zhì)進(jìn)行表征，證實(shí)了P12的表面有多肽的偶聯(lián)。目前，已有研究者開發(fā)出不同的多肽金納米體系，賦予金納米粒子抑制蛋白激酶C激活等不同的活性功能[16]，本研究中合成的P12為多肽修飾金納米粒子的應(yīng)用提供了新的證據(jù)。在小鼠經(jīng)氣道給予P12的一周內(nèi)，發(fā)現(xiàn)即使給藥劑量高達(dá)治療劑量的4倍也沒有觀察到小鼠體質(zhì)量和臨床癥狀（自主活動(dòng)、精神狀態(tài)、毛色變化及給藥部位的局部狀態(tài)等）的異常。一項(xiàng)通過大鼠尾靜脈給予GNP-50PKCi[由裸金納米粒子與蛋白激酶C抑制劑（PKCi）雜交合成]的安全性評(píng)估研究表明，GNP-50PKCi未對(duì)大鼠體質(zhì)量變化和臨床癥狀產(chǎn)生影響[16]，與本研究結(jié)果相符。此外，本研究中在氣道給予治療劑量或大劑量P12 24 h后，發(fā)現(xiàn)小鼠的臟器系數(shù)（肺、心、肝、脾和腎）、血常規(guī)（紅細(xì)胞/白細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞壓積等指標(biāo)）、血生化（血清蛋白、血清無機(jī)離子、肝酶和腎功能指標(biāo)）及組織病理（氣管、胸腺、肺、心、肝、脾、腎和腎上腺）特征均表現(xiàn)正常，表明氣道給予該劑量的P12不會(huì)產(chǎn)生急性毒性，具有較好的生物安全性。一項(xiàng)評(píng)估攜帶陽離子表面活性劑的金納米粒子GNRs在小鼠體內(nèi)外毒性的研究也與本研究的結(jié)果一致，該研究發(fā)現(xiàn)GNRs不會(huì)造成小鼠組織的病理變化，沒有急性毒性作用，表現(xiàn)出良好的安全性[18]。而最近的一篇綜述對(duì)過去12 a金納米粒子在疾病動(dòng)物模型的治療及毒性作用進(jìn)行了總結(jié)，發(fā)現(xiàn)其并沒有經(jīng)常出現(xiàn)嚴(yán)重的毒性或不良反應(yīng)，僅有2項(xiàng)研究報(bào)道了其副作用[17]。

本研究與先前的研究相符，證明了多肽金納米粒P12具有較好的體內(nèi)安全性，為P12氣道給藥提供了系統(tǒng)的體內(nèi)安全性信息，對(duì)未來抗炎納米顆粒應(yīng)用于急性肺損傷等肺部疾病的治療具有重要的指導(dǎo)意義。但本研究也存在一些局限性以待完善：（1）采用小動(dòng)物開展試驗(yàn)，小動(dòng)物和人之間的差異可能會(huì)影響藥物安全性的真實(shí)評(píng)估效果；（2）缺乏采用具有明確毒性的藥物作為陽性對(duì)照。