王之豐 孫昊 胡電 金志軍 劉曉軍

卵巢癌的發(fā)病率低于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，居婦科惡性腫瘤的第三位，但死亡率卻超過宮頸癌及子宮內(nèi)膜癌之和，居婦科癌癥首位，是嚴(yán)重威脅婦女健康的最大疾患[1-2]。由于卵巢癌的癥狀不典型，容易被歸為其他疾病的并發(fā)癥，“無聲的殺手”因此得名。臨床上缺乏有效的篩查技術(shù)，因此卵巢癌通常在晚期才被診斷出來，預(yù)后較差[3-4]。目前，卵巢癌的治療依賴于手術(shù)和鉑類藥物，但腫瘤在腹腔內(nèi)和盆腔內(nèi)的種植轉(zhuǎn)移無法控制。最新研究顯示，卵巢癌5年后的存活率僅為48.6%[2，5]。因此，迫切需要開發(fā)新的診斷指標(biāo)和預(yù)后治療靶標(biāo)來優(yōu)化治療方案。

lncRNAs是一種調(diào)節(jié)性的非編碼RNA，其異常調(diào)控被認(rèn)為與許多疾病有關(guān)。miRNAs在不同類型的腫瘤中起著抑癌或癌基因的作用[6]，而lncRNAs常常作為miRNAs間接調(diào)控基因表達(dá)的靶點(diǎn)。大量研究表明，miRNAs與lncRNAs之間的相互作用能較大程度影響癌癥的發(fā)生和發(fā)展[7]。因此，建立一種有效的方法來鑒定與癌癥相關(guān)的lncRNA-miRNA相互作用是非常重要的。競爭性內(nèi)源RNA（CeRNA）假說的提出讓人們對lncRNA-miRNA之間作用機(jī)制的認(rèn)識上升到一個新的層面[8]。至今已有許多報道證實lncRNAs ABHD11-AS1對卵巢癌的進(jìn)程有促進(jìn)作用，但作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的探究[9]。而值得關(guān)注的是lncRNAs ABHD11-AS1存在miR-133a的結(jié)合位點(diǎn)[10]，而miR-133a是否通過介導(dǎo)ABHD11-AS1信號從而影響卵巢癌的進(jìn)程目前還沒有相關(guān)研究。故本研究旨在探究miR-133a能否通過介導(dǎo)ABHD11-AS1信號影響卵巢癌的進(jìn)展，并深入分析其作用機(jī)制。

材料與方法

1細(xì)胞株 人卵巢癌細(xì)胞TOV-112D和CaVO3購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。人輸卵管上皮細(xì)胞TEC購自上海鈺博生物科技有限公司。所有細(xì)胞均使用42.5%MCDB105（含1.5 g/L碳酸氫鈉）+42.5% M199（含2.2 g/L碳酸氫鈉）培養(yǎng)液中，同時加入15%胎牛血清以及1%的青霉素-鏈霉素培養(yǎng)。并將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，常規(guī)消化傳代，選用對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

2主要試劑 PRMI-1640培養(yǎng)液購自HyClone公司；胎牛血清購自Gibco；RIPA裂解液和BCA試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；NC siRNA，lncRNAsABHD11-AS1 siRNA，NC siRNA inhibitor、miR-133a inhibitor以及NC mimic和miR-133a mimic委托上海合星生物科技有限公司合成；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；TRLzol試劑以及TIANSeq M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司；SYBR Green qPCR Mix購自于Thermo Fisher Scientific公司；CCK-8檢測試劑購自北京索萊寶公司；pMIR-reporter熒光素酶載體購自美國Ambion 公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自于北京索萊寶公司。

3Real-time PCR 采用TRIzol試劑按照說明書從細(xì)胞中分離出總RNA。然后按照操作說明書通過TIANSeq M-MLV逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Green qPCR Mix進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，控制條件在95℃ 10 min;95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 10 s下利用SYBR Green qPCR Mix進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，經(jīng)歷35個循環(huán)后檢測其溶解曲線并分析樣本Ct值。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算mRNA的相對表達(dá)量。實驗中所用引物序列見表1。

表1 Real-time PCR引物序列

4免疫印跡分析 在冰上用預(yù)冷后的RIPA裂解液裂解細(xì)胞。使用BCA試劑盒對細(xì)胞總蛋白進(jìn)行定量，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。每組總蛋白上樣量為20 μg，再用10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行分離，最后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1.5 h后，用以下主要抗體在4 ℃下培養(yǎng)過夜：小鼠單克隆抗人β-actin antibody（1∶3 000；Cell Signaling Technology），小鼠單克隆抗人EGFR（1∶1 500；Cell Signaling Technology）。用PBS沖洗膜5次，每次5 min，并在室溫下用辣根過氧化物酶（HRP）結(jié)合的山羊抗鼠IgG（1∶5 000；Santa Cruz Biotechnology）培養(yǎng)2 h。用化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測系統(tǒng)檢測條帶，并用image-j軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。

5細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞增長到70% 融合時，采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，按照試劑盒說明書轉(zhuǎn)染NC siRNA、ABHD11-AS1 siRNA和NC inhibitor、miR-133a inhibitor或者NC mimic和miR-133a mimic。ABHD11-AS1 siRNA的序列為：Forward：5'-GCUACGAGAUCAUGAGCCA-3'，Reverse：5'-UGGCUCAUGAUCUCGUAGC-3'。

6CCK-8實驗 將細(xì)胞接種至96孔板，每孔的密度為1.0×103/孔。分別于細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的 0、24、48、72和96 h時加入10 μL的CCK-8試劑。2 h后用酶標(biāo)儀測量OD450值。

7雙熒光素酶檢測 將含有ABHD11-AS1野生型序列的質(zhì)粒wt-ABHD11-AS1和突變型序列的質(zhì)粒mut-ABHD11-AS1分別與miR-133a mimic或者NC mimic共轉(zhuǎn)染至TOV-112D細(xì)胞內(nèi)，24 h后采用雙熒光素酶報告的基因檢測試劑盒檢測各組的熒光強(qiáng)度。以熒光素酶pGL-3.0為內(nèi)參，分析各組熒光素酶的活性。

8統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析主要用GraphPad Prism 8.0和SPSS17.0軟件進(jìn)行。兩樣本的比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗分析，三組及以上的差異分析則利用單因素方差分析，事后比較采用LSD法。當(dāng)P＜0.05時，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1lncRNAs ABHD11-AS1對卵巢癌細(xì)胞增殖的影響Real-time PCR檢測lncRNAs ABHD11-AS1在卵巢癌細(xì)胞TOV-112D和CaVO3和人輸卵管上皮細(xì)胞TEC中的表達(dá)，結(jié)果顯示：ABHD11-AS1在TOV-112D和CaVO3中的表達(dá)水平明顯高于TEC細(xì)胞。為了探究lncRNAs ABHD11-AS1的表達(dá)水平對卵巢癌細(xì)胞增殖影響，在TOV-112D和CaVO3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ABHD11-AS1 siRNA，運(yùn)用CCK-8實驗進(jìn)行檢測，結(jié)果表明：下調(diào)lncRNAs ABHD11-AS1表達(dá)水平可明顯抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖（圖1，P＜0.01）。

圖1 Real-time PCR檢測lncRNAsABHD11-AS1在卵巢癌細(xì)胞和人輸卵管上皮細(xì)胞中的表達(dá)

2lncRNAs ABHD11-AS1對miR-133a的調(diào)控作用 在轉(zhuǎn)染ABHD11-AS1 siRNA后，用Real-time PCR檢測CaVO3和TOV-112D中的miR-133a的表達(dá)。一方面，從圖2A（Real-time PCR）可以看出在CaVO3和TOV-112D中轉(zhuǎn)染ABHD11-AS1 siRNA后，miR-133a的表達(dá)明顯升高（P＜0.01）。另一方面，圖2B（雙熒光素酶）結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-133a mimic和野生型lncRNAs ABHD11-AS1后的細(xì)胞熒光強(qiáng)度顯著降低（P＜0.01）。因此，上述結(jié)果說明lncRNAsABHD11-AS1參與調(diào)控miR-133a的表達(dá)。

圖2 lncRNAs ABHD11-AS1對miR-133a的調(diào)控

3miR-133a在卵巢癌細(xì)胞系和人輸卵管上皮細(xì)胞TEC中的表達(dá)情況 Real-time PCR檢測卵巢癌細(xì)胞系TOV-112D、CaVO3和人輸卵管細(xì)胞TEC中miR-133a的表達(dá)，結(jié)果顯示：相對于TEC細(xì)胞，miR-133a在TOV-112D和CaVO3中的表達(dá)水平顯著降低（圖3），在TOV-112D和CaVO3細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染NC mimic和miR-133a mimic，Real-time PCR結(jié)果（圖3）顯示：與NC mimic組相比，在轉(zhuǎn)染了miR-133a mimic后的TOV-112D和CaVO3細(xì)胞中miR-133a的表達(dá)水平會明顯增加（P＜0.01）。轉(zhuǎn)染miR-133a mimic能夠顯著增加TOV-112D和CaVO3細(xì)胞中miR-133a的表達(dá)水平。

圖3 miR-133a在卵巢癌細(xì)胞系和人輸卵管上皮細(xì)胞TEC中的表達(dá)

4miR-133a對卵巢癌細(xì)胞增殖的影響 在得出上述結(jié)論后，我們進(jìn)一步探究了miR-133a的表達(dá)水平對卵巢癌細(xì)胞增殖的影響。首先對TOV-112D和CaVO3細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染miR-133a mimic并培養(yǎng)24 h，隨后用CCK-8檢測二者的增殖能力，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖能力降低（圖4，P＜0.01），說明上調(diào)miR-133a的表達(dá)有利于抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖。根據(jù)上述結(jié)果，進(jìn)一步探究miR-133a與卵巢癌細(xì)胞增殖的關(guān)系，在TOV-112D和CaVO3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-133a inhibitor，結(jié)果表明：下調(diào)miR-133a表達(dá)水平可明顯促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖（圖5，P＜0.01）。

圖4 miR-133a對卵巢癌細(xì)胞TOV-112D和CaVO3增殖的影響

圖5 miR-133a inhibitor 對卵巢癌細(xì)胞增殖的檢測

5卵巢癌細(xì)胞中miR-133a下游靶基因EGFR的表達(dá)檢測 在TOV-112D和CaVO3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-133a mimic后，檢測下游靶基因EGFR的表達(dá)，結(jié)果顯示：與NC mimic組相比，轉(zhuǎn)染miR-133a mimic后兩株細(xì)胞中EGFR的表達(dá)水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖6，P＜0.01）。此外，為了進(jìn)一步探究miR-133a與卵巢癌細(xì)胞中EGFR表達(dá)的關(guān)系，在前期研究基礎(chǔ)上，在TOV-112D和CaVO3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-133a inhibitor，結(jié)果表明：與NC inhibitor組相比，轉(zhuǎn)染miR-133a inhibitor后兩株細(xì)胞中EGFR的表達(dá)水平明顯提高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖7，P＜0.01）。

圖6 miR-133a mimics對卵巢癌細(xì)胞EGFR表達(dá)的檢測

圖7 miR-133a inhibitor對卵巢癌細(xì)胞EGFR表達(dá)的檢測

6卵巢癌細(xì)胞中蛋白EGFR的表達(dá)檢測 在TOV-112D和CaVO3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-133a mimic后檢測下游蛋白EGFR的表達(dá)，結(jié)果顯示：與NC mimic組相比，轉(zhuǎn)染miR-133a mimic能夠顯著降低兩株細(xì)胞中EGFR的表達(dá)水平，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖8，P＜0.01）。與此相反，在TOV-112D和CaVO3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-133a inhibitor，結(jié)果表明：與NC inhibitor組相比，轉(zhuǎn)染miR-133a inhibitor后細(xì)胞中EGFR的表達(dá)水平明顯提高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖9，P＜0.01）。

圖8 miR-133a mimics對下游蛋白EGFR的表達(dá)檢測

圖9 miR-133a inhibitor對下游蛋白EGFR的表達(dá)檢測

7lncRNAsABHD11-AS1的表達(dá)水平對EGFR表達(dá)的影響 根據(jù)上述結(jié)果，為了探究lncRNAs ABHD11-AS1的表達(dá)水平對EGFR表達(dá)的影響，在TOV-112D和CaVO3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ABHD11-AS1 siRNA，運(yùn)用Real-time PCR以及WB實驗進(jìn)行檢測，結(jié)果表明：與NC siRNA組相比，轉(zhuǎn)染ABHD11-AS1 siRNA后細(xì)胞中EGFR的表達(dá)水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖10，P＜0.01）。

圖10 Real-time PCR和WB實驗檢測ABHD11-AS1 siRNA對EGFR表達(dá)的影響

討論

miRNAs作為一種小分子非編碼RNA，其長度約21～25個核苷酸，能夠結(jié)合目的基因的3'非編碼區(qū)（3'UTRs）來抑制基因表達(dá)[8]。由于一個miRNA靶向多個mRNA，因此miRNA在眾多生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用，如細(xì)胞增殖、血管生成、細(xì)胞周期和細(xì)胞遷移等。研究表明miRNAs的改變影響著腫瘤的發(fā)展，miRNAs在腫瘤中異常表達(dá)，并且由于其靶點(diǎn)的性質(zhì)miRNAs起著腫瘤啟動子或抑制子的作用[11]。多個miRNAs已經(jīng)被證實能夠調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的增殖，并調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生進(jìn)展與轉(zhuǎn)移，其中，miR-133a在卵巢癌的發(fā)病和轉(zhuǎn)移的過程中起著至關(guān)重要的作用[12-13]。與此類似，lncRNA作為一種長度大于200個核苷酸的非編碼RNA。研究表明其與各種疾病尤其是腫瘤有著密不可分的聯(lián)系，正逐步成為研究熱點(diǎn)[14]。ceRNA假說指出lncRNA可以通過miRNA的結(jié)合位點(diǎn)吸附miRNA從而釋放miRNA下游的靶基因[8]。研究表明，lncRNAsABHD11-AS1通過調(diào)控miR-361-3p/PDPK1信號促進(jìn)胃癌的發(fā)展[15]，亦有研究證實，其靶向細(xì)胞周期蛋白D1促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展[16]，皆表明其與腫瘤密不可分。LEI等通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)lncRNAsABHD11-AS1上存有miR-133a的結(jié)合位點(diǎn)[10]，且有實驗證實了該結(jié)合位點(diǎn)的可行性[17-18]。而且我們的實驗結(jié)果更進(jìn)一步證實，在卵巢癌細(xì)胞中下調(diào)ABHD11-AS1顯著促進(jìn)了miR-133a的表達(dá)，雙熒光素酶結(jié)果顯示，同時轉(zhuǎn)染miR-133a mimic和野生型ABHD11-AS1的片段顯著抑制了熒光素酶的活性。上述結(jié)果說明ABHD11-AS1能夠與miR-133a結(jié)合。

miR-133a首次被報道是一項在小鼠上進(jìn)行的試驗研究，研究發(fā)現(xiàn)miR-133a通過調(diào)節(jié)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2）在胚胎肌肉發(fā)育過程中對成肌細(xì)胞增殖和分化起著至關(guān)重要的作用[19-20]。腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞最大的區(qū)別是腫瘤細(xì)胞過度增殖的生長特性，隨著對miR-133a進(jìn)一步的研究，人們發(fā)現(xiàn)miR-133a在前列腺癌[21]、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌[22]、乳腺[23]、膀胱[24]、食管[25]和結(jié)直腸腫瘤[26]中的表達(dá)與正常組織相比相對下調(diào)。研究表明miR-133a表達(dá)的恢復(fù)被報道可以抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[21-26]。這些證據(jù)都表明miR-133a在多種人類癌癥中起抑癌作用。我們的研究也驗證了這一點(diǎn)：上調(diào)miR-133a能顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖能力，且抑制miR-133a的表達(dá)水平會促進(jìn)其增殖。再結(jié)合lncRNAs ABHD11-AS1在卵巢癌組織中的高表達(dá)以及抑制ABHD11-AS1的表達(dá)能夠顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖[9]的研究發(fā)現(xiàn)，可以推測下調(diào)lncRNAs ABHD11-AS1能夠釋放miR-133a來抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，我們的研究也證實了這一點(diǎn)，通過下調(diào)lncRNAs ABHD11-AS1的表達(dá)水平，可以明顯抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖以及EGFR的表達(dá)水平。

眾所周知，miRNAs通常通過與靶mRNAs的3'utr結(jié)合抑制靶mRNAs的表達(dá)來發(fā)揮其生物學(xué)功能。SONG等人[27]通過生物信息學(xué)的方法預(yù)測miR-133a的基因靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)表皮生長因子受體（EGFR/ErbB-1/HER1）在3'UTR上有兩個高度保守的miR-133a結(jié)合位點(diǎn)，miR-133a能夠靶向調(diào)控EGFR來抑制宮頸癌細(xì)胞在體內(nèi)增殖。研究發(fā)現(xiàn)miR-133a通過直接靶向非小細(xì)胞肺癌[28]、前列腺癌[29]和乳腺癌[30]中的3'UTR抑制EGFR的表達(dá)。EGFR是表皮生長因子（EGF）成員的細(xì)胞表面受體，是ErbB受體家族的一員，在刺激細(xì)胞內(nèi)蛋白酪氨酸激酶[31]活性方面起著關(guān)鍵作用。據(jù)報道，EGFR在多種腫瘤呈高表達(dá)，并且EGFR的過度表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展、對化療和放療的抵抗以及預(yù)后不良有關(guān)，表明它是一種癌基因[32]。我們的研究顯示，上調(diào)miR-133a顯著抑制卵巢癌細(xì)胞中EGFR的表達(dá)，在抑制miR-133a的表達(dá)水平后發(fā)現(xiàn)此抑制作用被逆轉(zhuǎn)，這提示了miR-133a可能通過抑制EGFR的表達(dá)來發(fā)揮抗卵巢癌細(xì)胞增殖的作用。

綜上，本研究主要探討了卵巢癌細(xì)胞中miR-133a的表達(dá)水平對抗癌作用的影響，并深入研究了其作用機(jī)制。結(jié)果表明，相對于人輸卵管上皮細(xì)胞，miR-133a在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)水平更低，而上調(diào)其表達(dá)則有利于抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖能力，通過抑制miR-133a的表達(dá)水平，也驗證了這一點(diǎn)。主要作用機(jī)制是lncRNAs ABHD11-AS1通過調(diào)控miR-133a，進(jìn)而上調(diào)其下游靶基因EGFR的表達(dá)，從而促進(jìn)卵巢癌的惡性表型。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突