王奕潔, 江哲恒, 孫雯佳, 武曉丹, 曹勁松, 付玉杰*

(1.東北林業(yè)大學(xué) 森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學(xué) 化學(xué)化工與資源利用學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DAB)是一個(gè)二萜類紫杉烷衍生物[1],主要分布于紅豆杉屬植物[2]的樹皮、枝條、根、種子和芯材中,在枝葉中含量最高[3]。10-DAB化學(xué)結(jié)構(gòu)式與紫杉醇非常相近[4]，是合成抗癌藥物紫杉醇和多烯紫杉醇的重要前體產(chǎn)品[5]，具有很高的應(yīng)用價(jià)值[6]。目前，紅豆杉中提取10-DAB的方法主要包括溶劑提取法、超聲波提取法、微波提取法、浸漬法、滲漉法、加熱回流法等[7]，然而上述方法普遍存在溶劑消耗量大、環(huán)境污染嚴(yán)重、操作過程復(fù)雜、產(chǎn)率低、產(chǎn)物雜質(zhì)較多等問題[8]。所以，需尋找一種高效、方便、綠色、環(huán)保的方法[9]對植物中的10-DAB進(jìn)行特異性識(shí)別分離[10]，從而為植物活性成分的高效分離提供科學(xué)基礎(chǔ)[11]。分子印跡技術(shù)(MIT)是近年來被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離應(yīng)用中，集分子設(shè)計(jì)、分子識(shí)別、仿生生物工程等[12]眾多學(xué)科優(yōu)勢發(fā)展起來的一門學(xué)科分支，具有預(yù)定性、識(shí)別性和實(shí)用性的特點(diǎn)[13]。何慧清等[14]通過沉淀聚合法合成了白藜蘆醇分子印跡聚合物微球，該材料對白藜蘆醇最大吸附量可達(dá)16.80 mg/g；楚善明等[15]采用回流沉淀聚合法與復(fù)合模板技術(shù)相結(jié)合，以槲皮素與橙皮素作為復(fù)合模板分子，合成了對天然產(chǎn)物中黃酮類化合物具有選擇性的分子印跡聚合物，吸附量范圍在37.54～49.82 mg/g之間；閆艷等[16]合成了對紫杉醇有親和性和選擇性的分子印跡聚合物，但以10-DAB為模板的納米級(jí)分子印跡材料未見報(bào)道。本研究通過沉淀聚合法成功制備了10-DAB分子印跡納米微球(10-DAB-MINs)來進(jìn)行10-DAB的高效富集，確定了10-DAB-MINs的最佳制備條件，并通過吸附動(dòng)力學(xué)和吸附等溫線探討了吸附機(jī)理，以期為10-DAB的高效分離提供一種新思路。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DAB)，購自天津希恩思生化科技有限公司；4-乙烯基吡啶(4-VP)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)、偶氮二異丁腈(AIBN)，均購自阿拉丁(上海)有限公司。甲醇、乙腈、甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酰胺(AM)、巴卡亭Ⅲ和紫杉醇等其他試劑，均為市售分析純。

KQ-250DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；DGX9073型真空干燥箱；JSM-7500F掃描電子顯微鏡(SEM)，日本JEOL公司；Zeta PALS激光粒度分析儀；miniX全自動(dòng)比表面積及孔徑分布測定儀，日本Microtrac BEL公司；IR Affinity-1S傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)儀，日本島津公司；熱重分析(TG)儀，美國珀金埃爾默公司；反相高效液相色譜(RP-HPLC)，安捷倫公司。

1.2 10-DAB-MINs的制備

取0.05 mmol 10-DAB、0.5 mmol 4-VP分散于裝有40 mL甲醇的圓底燒瓶中，超聲波溶解后于室溫下避光攪拌8 h制備預(yù)聚體；之后，在溶液中加入1.5 mmol交聯(lián)劑EGDMA、1.22×10-3mmol引發(fā)劑AIBN，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，油浴環(huán)境中60 ℃反應(yīng)24 h進(jìn)行聚合反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后，收集聚合物[17-18]。用甲醇/乙酸(體積比9∶1)進(jìn)行多次洗脫去除模板分子10-DAB，直至洗脫液中檢測不到10-DAB。NINs的合成方法與10-DAB-MINs相同，只是合成過程中不添加模板分子10-DAB[19]。將10-DAB-MINs和NINs常溫下進(jìn)行干燥，以備進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)使用。

1.3 10-DAB-MINs的吸附機(jī)理探究

1.3.1吸附動(dòng)力學(xué) 在20 mL質(zhì)量濃度0.2 g/L的10-DAB標(biāo)準(zhǔn)溶液中，加入10-DAB-MINs(NINs)20 mg，放入搖床中在室溫下吸附5、10、15、20、30、40、60、120、240和360 min后離心。采用HPLC測定不同時(shí)間上清液中10-DAB的質(zhì)量濃度，并根據(jù)式(1)[20-21]計(jì)算不同時(shí)間10-DAB-MINs(NINs)的吸附量，并繪制吸附量與吸附時(shí)間的吸附曲線。

(1)

式中：C0—10-DAB的初始質(zhì)量濃度，g/L；Ct—t時(shí)刻10-DAB的質(zhì)量濃度，g/L；V—10-DAB甲醇溶液的體積,mL；m—10-DAB-MINs(NINs)的質(zhì)量，g。

采用準(zhǔn)一級(jí)和準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，動(dòng)力學(xué)模型公式可見式(2)和(3):

(2)

(3)

式中：Qe—10-DAB-MINs(NINs)在吸附平衡時(shí)的吸附量，mg/g；Qt—10-DAB-MINs(NINs)在t時(shí)刻的吸附量，mg/g；K1—準(zhǔn)一級(jí)吸附速率常數(shù)；K2—準(zhǔn)二級(jí)吸附速率常數(shù)。

1.3.2吸附等溫線 將20 mg 10-DAB-MINs(NINs)分別置于20 mL質(zhì)量濃度0.02～0.2 g/L的10-DAB標(biāo)準(zhǔn)溶液中，充分吸附24 h后離心[22]。采用HPLC法測定上清液中10-DAB的質(zhì)量濃度，10-DAB-MINs(NINs)的吸附量按式(4)計(jì)算，繪制吸附等溫線，并依據(jù)吸附量評價(jià)10-DAB-MINs(NINs)的吸附性能。

(4)

式中：Ce—10-DAB甲醇溶液中10-DAB平衡質(zhì)量濃度，g/L。

采用Langmuir、Freundlich吸附等溫模型以及Langmuir-Freundlich吸附等溫模型對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，Langmuir、Freundlich以及Langmuir-Freundlich吸附等溫模型的公式[23-25]如下:

(5)

(6)

(7)

式中：Qmax—10-DAB的最大吸附量，mg/g；KL—Langmuir吸附常數(shù)；KF—Freundlich吸附常數(shù)；1/n—等溫平衡吸附指數(shù)；Kd—解離常數(shù)；n—異質(zhì)性指數(shù)。

1.3.3循環(huán)吸附實(shí)驗(yàn) 樣品瓶中加入20 mg的 10-DAB-MINs(NINs)，20 mL的10-DAB甲醇溶液(0.4 g/L)，置于預(yù)設(shè)溫度25 ℃的搖床中。吸附24 h后，過濾分離，再用甲醇/乙酸(體積比9∶1)的洗脫液洗滌、采用HPLC測定10-DAB在甲醇溶液和解吸附溶液中的殘留量。重復(fù)5次吸附，每一次吸附過程的吸附量和解吸量[25]按式(8)和(9)計(jì)算。

(8)

(9)

式中：Qa—每次循環(huán)的吸附量,mg/g；Cd—洗脫液中10-DAB的質(zhì)量濃度，g/L；D—每次循環(huán)的解吸附量，mg/g；Vs—洗脫溶液的體積，1 mL。

1.3.4選擇性吸附實(shí)驗(yàn) 稱取3份10 mg的10-DAB-MINs(NINs)于樣品瓶中，分別加入20 mL 0.1 g/L的10-DAB、巴卡亭Ⅲ和紫杉醇的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其在室溫下?lián)u床中充分吸附24 h，而后離心，用HPLC法分別測定上清液中10-DAB、巴卡亭Ⅲ、紫杉醇的質(zhì)量濃度，并計(jì)算吸附量。

1.4 表征分析

1.4.110-DAB-MINs表征 采用SEM分析10-DAB-MINs的表面形貌；采用激光粒度分析儀分析材料的粒徑；采用全自動(dòng)比表面積及孔徑分布測定儀對10-DAB-MINs的孔徑進(jìn)行分析；采用FT-IR儀分析材料的官能團(tuán)，掃描波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1；采用TG分析儀分析樣品的熱穩(wěn)定性，溫度范圍為0～800 ℃。

1.4.2HPLC分析 RP-HPLC分析采用Agilent Technologies 1260高效液相色譜系統(tǒng)，配有標(biāo)準(zhǔn)手動(dòng)進(jìn)樣器、四元泵、恒溫柱室(TCC)和可變波長掃描紫外檢測器(VWD)。采用C18高效液相色譜柱(250 mm×4.60 mm, 5 μm, 00G-4012-E0，美國飛諾美)，以乙腈/水(體積比42∶58)為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min。10-DAB的檢測波長設(shè)為234 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子印跡聚合物制備條件篩選

2.1.1功能單體的種類 功能單體與模板分子之間形成的弱作用力強(qiáng)度會(huì)影響選擇性吸附性能，因此功能單體的種類和用量會(huì)影響10-DAB-MINs的吸附能力，需要對功能單體的種類及用量進(jìn)行篩選。分別探討了MAA、AM及4-VP這3種功能單體對10-DAB-MINs吸附量的影響，結(jié)果見表1。從表1可以看出，以4-VP為功能單體制備的分子印跡聚合物對10-DAB的吸附量達(dá)到27.41 mg/g，大于以MAA和AM為功能單體制備的分子印跡聚合物的吸附量，因此選擇4-VP為最優(yōu)的功能單體。

表1 分子印跡聚合物10-DAB-MINs制備條件篩選

2.1.2模板分子和功能單體的比例 為了進(jìn)一步確定聚合物制備的最佳條件，選擇模板分子與4-VP按不同的物質(zhì)的量比(1∶6、1∶7、1∶8、1∶9和1∶10)進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果如表1所示，發(fā)現(xiàn)當(dāng)10-DAB 與4-VP物質(zhì)的量比為1∶10 時(shí)，吸附量最大，達(dá)到27.41 mg/g。

2.1.3模板分子與交聯(lián)劑的比例 對模板分子與交聯(lián)劑EGDMA比例進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如表1所示。隨著EGDMA的增加,分子印跡聚合物的吸附量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。當(dāng)10-DAB與EGDMA的物質(zhì)的量比為1∶30時(shí)，吸附量最高，達(dá)到27.42 mg/g。當(dāng)EGDMA用量繼續(xù)增加吸附量卻下降，可能是10-DAB-MINs表面形成了冗余接枝，這極大地影響后續(xù)洗脫和吸附實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。因此，選擇10-DAB與EGDMA的最優(yōu)物質(zhì)的量比為1∶30。

2.1.4聚合溫度 在合成反應(yīng)過程中保持參與反應(yīng)的物質(zhì)質(zhì)量與反應(yīng)條件不變，在3種不同的溫度(50、60和70 ℃)下進(jìn)行10-DAB-MINs的制備，對制備出的10-DAB-MINs的吸附量進(jìn)行比較選擇出最佳的溫度。由表1可以看出，當(dāng)溫度為60 ℃時(shí)，吸附量最大，由于起始加入10-DAB的量相同，聚合度在此溫度下也達(dá)到最大，為69.63%。

2.2 材料表征

a.10-DAB; b.10-DAB-MINs; c.NINs

2.2.2SEM分析 用掃描電鏡對制備的10-DAB-MINs和NINs進(jìn)行表征,結(jié)果見圖2。由圖可知，10-DAB-MIN和NINs均呈現(xiàn)均勻的球形結(jié)構(gòu)。通過對比可以發(fā)現(xiàn)，在放大倍數(shù)相同時(shí)，10-DAB-MINs相較NINs表面更粗糙。這是因?yàn)榫酆衔?0-DAB-MINs表面成功形成了模板分子10-DAB的識(shí)別空穴，由此可以說明10-DAB-MINs被成功制備。

a.10-DAB-MINs,×10 000; b.10-DAB-MINs,×30 000; c.10-DAB-MINs,×50 000;d.NINs,×10 000; e.NINs,×30 000; f.NINs,×50 000

2.2.3粒徑分析 對10-DAB-MINs和NINs進(jìn)行粒徑分析，由圖3可以看出10-DAB-MINs和NINs均是納米級(jí)別的粒子，10-DAB-MINs粒子的粒徑主要分布在347.5～355 nm之間，NINs粒子的粒徑主要分布在318～324 nm之間，這可能是10-DAB-MINs制備過程中添加模板分子10-DAB形成了特異性識(shí)別空腔，導(dǎo)致粒徑較大。

圖3 10-DAB-MINs(a)和NINs(b)的粒徑分布

2.2.4孔徑分布分析 根據(jù)孔徑分布曲線圖4可以看出，10-DAB-MINs以1.5 nm左右的微孔為主，NINs則以1.7 nm左右的微孔為主，兩者的平均孔徑分別為8.54和7.06 nm。10-DAB-MINs與NINs的比表面積分別為 0.66和0.64 m2/g，孔容分別為1.86×10-3和1.32×10-3cm3/g。10-DAB-MINs的比表面積大于NINs，出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能是10-DAB-MINs聚合物內(nèi)部形成了NINs內(nèi)部結(jié)構(gòu)中沒有的印跡孔穴。

圖4 孔徑分布

2.2.5TG分析 圖5為10-DAB-MINs與NINs在溫度為50～800 ℃范圍內(nèi)的TG曲線。

圖5 材料的熱重曲線

由圖5可知，在溫度為50～300 ℃時(shí)，兩種材料都有輕微的質(zhì)量損失，這可能是材料表面水分的蒸發(fā)以及交聯(lián)劑和功能單體的分解；300～400 ℃時(shí)，兩種材料的質(zhì)量損失速率明顯加快，這是由于材料表面的聚合物層的分解所導(dǎo)致的，這一現(xiàn)象說明成功合成了10-DAB-MINs和NINs。通過對比10-DAB-MINs和NINs兩條曲線可以看出，NINs在410 ℃時(shí)失去大部分質(zhì)量，幾乎完全分解，而10-DAB-MINs失去大部分質(zhì)量的溫度在430 ℃左右，10-DAB-MINs的分解溫度高于NINs，這說明合成的10-DAB-MINs化學(xué)鍵結(jié)合牢固，熱穩(wěn)定性強(qiáng)。

2.3 動(dòng)力學(xué)吸附曲線

為了探討10-DAB-MINs(NINs)的吸附特性，使用準(zhǔn)一級(jí)和準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行擬合，如圖6所示，10-DAB-MINs(NINs)的吸附量隨時(shí)間的增加而增加。通過計(jì)算得到兩種模型所對應(yīng)的相關(guān)參數(shù)如表2所示。對比可知，10-DAB-MINs使用準(zhǔn)一級(jí)和準(zhǔn)二級(jí)模型擬合出的R2值相當(dāng)，但是準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行擬合后所得到的R2要略大，表明10-DAB-MINs不僅存在化學(xué)吸附，也存在非特異性的物理吸附。這是由于10-DAB-MINs具備的立體空腔和結(jié)合位點(diǎn)上的特定分子識(shí)別作用，以及隨機(jī)分布在表面上的官能團(tuán)的共同吸附所致。NINs使用準(zhǔn)一級(jí)模型擬合出的R2較大，這是由于NINs表面缺乏足夠的特異性空腔，化學(xué)吸附不足，以非特異性的物理吸附為主。然而10-DAB-MINs的準(zhǔn)二級(jí)平衡吸附量大于準(zhǔn)一級(jí)平衡吸附量，由此表明10-DAB-MINs以化學(xué)吸附為主。

圖6 動(dòng)力學(xué)吸附曲線 圖7 Langmuir、Freundlich(a)及Langmuir-Freundlich(b)等溫吸附曲線

表2 動(dòng)力學(xué)吸附參數(shù)

2.4 等溫吸附曲線

對10-DAB-MINs(NINs)的吸附過程進(jìn)行吸附等溫線探究，根據(jù)不同質(zhì)量濃度的10-DAB甲醇溶液對聚合物吸附量的影響繪制了10-DAB-MINs(NINs)的吸附等溫曲線，如圖7所示。從圖7可以看出，隨著10-DAB甲醇溶液質(zhì)量濃度的增加，10-DAB-MINs和NINs的吸附量均出現(xiàn)上升趨勢，且10-DAB-MINs吸附量均大于NINs。

Langmuir是一個(gè)單分子層的均勻吸附模型，F(xiàn)reundlich通常用來描述非均勻吸附模型，所以Langmuir和Freundlich吸附等溫線模型均不足以描述實(shí)際的吸附模型。為了彌補(bǔ)這一不足，同時(shí)采用Langmuir-Freundlich吸附等溫線模型對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，結(jié)果如表3所示。

由表3中相關(guān)系數(shù)R2可以看出 Langmuir和Freundlich吸附等溫線模型對數(shù)據(jù)的擬合結(jié)果相近，均小于Langmuir-Freundlich吸附等溫線模型擬合的結(jié)果R2(0.982 7)，說明該吸附過程的機(jī)理更符合Langmuir-Freundlich吸附等溫線模型。這可能是由于在該吸附條件下，除了10-DAB-MINs的印跡孔穴對10-DAB分子產(chǎn)生了均勻的單分子層吸附，印跡分子的表面與10-DAB之間存在的非化學(xué)鍵力也可能引發(fā)部分多相吸附表面的吸附平衡。因此，10-DAB-MINs符合Langmuir-Freundlich吸附等溫線模型。

表3 等溫吸附擬合參數(shù)

2.5 循環(huán)利用性

如圖8所示，經(jīng)過5次循環(huán)實(shí)驗(yàn)，每次循環(huán)后10-DAB-MINs的吸附量都高于NINs。循環(huán)使用時(shí)10-DAB-MINs吸附量和解吸附量保持穩(wěn)定，吸附量最高可達(dá)31.42 mg/g，說明10-DAB-MINs吸附能力強(qiáng)且有良好的可重復(fù)利用性。在經(jīng)歷了5次吸附-解吸循環(huán)后10-DAB-MINs仍然保持著28.66 mg/g 的吸附量，表明10-DAB-MINs具有良好的可重復(fù)利用性。

圖8 10-DAB-MINs和NINs的重復(fù)利用性能

2.6 選擇吸附性

為了更好地探究10-DAB-MINs的特異性吸附能力，選擇了兩種質(zhì)量濃度相同(0.1 g/L)的與10-DAB結(jié)構(gòu)相似物質(zhì)的溶液作為干擾物質(zhì)(如圖9)，對10-DAB-MINs(NINs)在單元體系中對目標(biāo)化合物10-DAB(a)及兩種干擾物質(zhì)巴卡亭Ⅲ(b)、紫杉醇(c)的吸附能力進(jìn)行了比較。吸附結(jié)果如表4所示，由表中可以看出，10-DAB-MINs對10-DAB有明顯的選擇性吸附能力，吸附量達(dá)37.08 mg/g?？梢?0-DAB-MINs對10-DAB有優(yōu)異的選擇吸附性。

表4 10-DAB-MINs的選擇性吸附能力

圖9 10-DAB(a)、巴卡亭Ⅲ(b)和紫杉醇(c)結(jié)構(gòu)式

3 結(jié) 論

3.1以10-DAB為模板成功制備了可高效選擇性識(shí)別10-DAB的分子印跡納米微球。對樣品進(jìn)行了一系列表征，證明10-DAB-MINs成功合成，且穩(wěn)定性良好。采用最佳制備條件，利用沉淀聚合法所制得的10-DAB-MINs對10-DAB具有較高的吸附能力，吸附量達(dá)到37.42 mg/g。

3.2吸附動(dòng)力學(xué)和吸附等溫線實(shí)驗(yàn)表明10-DAB-MINs的吸附動(dòng)力學(xué)過程符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，吸附平衡過程符合Langmuir-Freundlich吸附等溫線模型。此外，循環(huán)吸附實(shí)驗(yàn)表明：該10-DAB-MINs在進(jìn)行5次循環(huán)吸附后對10-DAB仍有良好的吸附量，該材料有良好的重復(fù)利用性。