劉曉魯，孫景春，高煥鑫，林承剛*

(1.中國科學(xué)院海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071；2.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003；3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237；4.中國科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心，山東 青島 266071；5.中國科學(xué)院海洋牧場工程實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071；6.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

引 言

大多數(shù)生物體內(nèi)都存在生物節(jié)律(biorhythm)，又稱為生物鐘(biological clock)，不論是真菌、細(xì)菌亦或是人類，生物鐘都會影響其一生中各項(xiàng)生命活動(dòng)。生物節(jié)律可按照其循環(huán)周期分為近年節(jié)律(circannual rhythm)和晝夜節(jié)律(circadian rhythm)等[1-2]。近年節(jié)律包括與生物季節(jié)性周期變化相關(guān)的行為，如動(dòng)物的生理行為(魚類洄游、候鳥遷徙)，植物的四季變化(發(fā)芽、開花、結(jié)果、落葉)等[2]；晝夜節(jié)律是研究的最為深入生物節(jié)律，包括哺乳動(dòng)物的睡醒周期、血壓變化等生理活動(dòng)[3-5]，甚至近年來有研究表明，人體內(nèi)淋巴細(xì)胞在血液和淋巴系統(tǒng)中的生理節(jié)律運(yùn)動(dòng)與日月交替同步，一天中不同時(shí)間點(diǎn)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)的強(qiáng)度不一樣[6]；在昆蟲中發(fā)現(xiàn)成蟲羽化節(jié)律(adult emergence rhythms)周期約為24 h，果蠅Drosophilapseudoobscura集中在黎明前后羽化，隨著光周期的變化其羽化高峰會發(fā)生轉(zhuǎn)移[7]；蜜蜂伴隨著太陽升起探采花蜜，蚊蟲在傍晚成群出沒都屬于晝夜節(jié)律運(yùn)動(dòng)[8]。

仿刺參(Apostichopusjaponicus，Selenka)又稱為刺參，屬棘皮動(dòng)物門，海參綱，刺參科[9]，是我國重要的海水養(yǎng)殖品種[10]。仿刺參作為一種底棲動(dòng)物，長期處于一種黑暗、光照強(qiáng)度較低的環(huán)境中，在白天光照強(qiáng)度較高時(shí)，會躲避并棲息于礁石、大型海藻葉片等隱蔽處；而在日落之后直至凌晨天亮之前，活動(dòng)較為活躍，表現(xiàn)出較為典型的負(fù)趨光性特征。張碩等[11]在研究不同光照以及人工礁模型對仿刺參行為影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，在只有光照沒有人工礁的條件下，大部分的仿刺參會停留在光照強(qiáng)度比較低的區(qū)域但個(gè)別仿刺參仍具有活動(dòng)的現(xiàn)象；在光照和人工礁都存在的條件下，大部分仿刺參會停留并聚集在人工礁內(nèi)或人工礁的陰影區(qū)域，且會長時(shí)間保持。由此可見，光照對于刺參來說是一種影響其活動(dòng)節(jié)律的重要環(huán)境因子，光照周期的變化可能形成了仿刺參的晝夜活動(dòng)節(jié)律。因其活躍的攝食活動(dòng)發(fā)生在夜晚所以仿刺參被認(rèn)為是一種晝伏夜出的動(dòng)物。孫佳敏等[12]研究表明，給予仿刺參近似于自然光照周期(12L：12D)的條件，在光照階段時(shí)其攝食活動(dòng)比例較低，而在黑暗階段，仿刺參從20:00的攝食活動(dòng)開始活躍，比例迅速增加，在0—2:00時(shí)間段達(dá)到攝食高峰，隨后黑暗階段轉(zhuǎn)入光照條件下時(shí)，仿刺參的攝食比例迅速下降，比例幾乎為0，這佐證了仿刺參晝夜活動(dòng)節(jié)律。光照是否為影響刺參晝夜活動(dòng)節(jié)律的唯一環(huán)境因子？孫佳敏等[12]發(fā)現(xiàn)在全光照條件下(24 L)，仿刺參仍然會從20:00開始增大攝食比例，到0:00和02:00之間達(dá)到峰值(13%)，隨后下降；而在全黑暗條件下(24 D)仿刺參一直處于活躍狀態(tài)，但整體夜晚較白天更為活躍。可見在改變光照條件下仿刺參仍然能夠保持其晝夜攝食節(jié)律，推測是由于其體內(nèi)的生物鐘所控制的內(nèi)源性節(jié)律。晝夜節(jié)律受相關(guān)生物鐘基因的節(jié)律性表達(dá)調(diào)控，生物鐘基因編碼的蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控其靶基因的節(jié)律性表達(dá)，而形成自主調(diào)控的循環(huán)，其中一小部分被稱為經(jīng)典生物鐘基因(clock gene，CG)，包括CLOCK、TIM、PER、CYC(一種果蠅基因，相當(dāng)于哺乳動(dòng)物中的BAML1)等[13]。生物鐘基因與啟動(dòng)子區(qū)域的特殊位點(diǎn)結(jié)合進(jìn)而通過轉(zhuǎn)錄—翻譯多反饋環(huán)路彼此之間相互作用，促進(jìn)蛋白磷酸化形成、構(gòu)建或破壞二聚體結(jié)構(gòu)等方式形成一個(gè)24 h的時(shí)鐘環(huán)路[14-15]。本研究將初步探究仿刺參全基因組中的生物鐘基因，并利用不同光照條件下仿刺參觸手的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)[16]以表征光照對仿刺參生物鐘基因表達(dá)變化。

1 方法

1.1 生物鐘基因的篩查

在KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)搜索哺乳動(dòng)物(Circadian rhythm，map04710)和果蠅(Circadian rhythm-fly，map04711)的晝夜節(jié)律通路，在KEGG Genes數(shù)據(jù)庫中下載通路中的每一個(gè)基因的蛋白序列。在NCBI下載仿刺參的蛋白質(zhì)序列(Genbank accession number: MRZV00000000)，用于仿刺參相關(guān)基因的篩查。

1.2 基因同源比對

利用本地Blastp(https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/sra.cgi?view=software.NCBI SRA Toolkit, version 2.7.1)將下載的同源基因序列與仿刺參基因組蛋白序列進(jìn)行雙向?qū)Ρ?，得到刺參中相?yīng)的候選同源基因，序列對比的E-value設(shè)為1e-10，并選取最小E-value的同源基因認(rèn)為是最佳仿刺參生物鐘候選同源基因。

1.3 生物鐘基因的表達(dá)分析

根據(jù)作者已有不同光照條件下(黑暗對照組，120 lx光照5 min，120 lx光照1 h)仿刺參觸手的RNA-Seq數(shù)據(jù)[16](SRA accession number：PRJNA590004)，分析仿刺參生物鐘基因的表達(dá)量變化情況。

具體而言，9只健康的成體仿刺參(體重103.59～120.84 g)，購買于山東東方海洋科技有限公司。實(shí)驗(yàn)前，將仿刺參暫養(yǎng)在循環(huán)儲水桶中適應(yīng)1周，每天喂食一次，暫養(yǎng)溫度為13.8 ℃至16.5 ℃。實(shí)驗(yàn)開始前，所有仿刺參隨機(jī)分為三組，其中一組為黑暗條件對照組(“Dark”)。其他兩組的仿刺參暴露于大約120 lx的光強(qiáng)環(huán)境下，一組暴露5 min(“Lt5m”)，另一組暴露1 h(“Lt1h”)。三組在黑暗條件下的實(shí)驗(yàn)玻璃水缸中適應(yīng)1 d。實(shí)驗(yàn)開始于早晨8點(diǎn)，在暴露于不同環(huán)境條件后，立即解剖仿刺參并收集觸手樣品，經(jīng)液氮速凍并保存與-80 ℃以用于后續(xù)的RNA提取和測序。從三組仿刺參觸手中提取RNA樣品(3組×3個(gè)重復(fù))并進(jìn)行RNA質(zhì)量檢測。1 ug的total RNA為建庫起始RNA，純化后的cDNA文庫在Illumina Novaseq 6000平臺進(jìn)行2×150bp paired-end測序。

2 結(jié)果

晝夜節(jié)律是一種內(nèi)源性生物鐘，在無外環(huán)境誘導(dǎo)下可大約維持24 h。通過整理KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫中哺乳動(dòng)物和果蠅的晝夜節(jié)律通路每個(gè)基因，共篩選得到參考生物鐘成員基因18個(gè)，其中CLOCK、BAML1/CYC和PER基因被認(rèn)為是兩個(gè)通路中共存基因。根據(jù)數(shù)據(jù)庫的記錄，部分基因有多個(gè)同工酶或由不同亞基組成，總計(jì)篩選得到29個(gè)參考基因，其KEGG基因編號列于表1中。Blastp搜索結(jié)果發(fā)現(xiàn)，絕大部分晝夜節(jié)律通路成員同源基因在仿刺參基因組中被鑒定出來，包括經(jīng)典生物鐘基因的CLOCK和BMAL1/CYC基因；少數(shù)基因雖然匹配到候選基因，但并非目標(biāo)同源基因，如RORA(RAR-related orphan receptor alpha)和VRI(Vrille)基因，并且未鑒定出仿刺參中CKI1的epsilon亞基。除此之外，未能鑒定出任何一條DEC、PER基因的同源基因。總的來說，18個(gè)生物鐘基因共鑒定出15個(gè)同源基因，但均未完全覆蓋任何一種通路。

表1 仿刺參基因組中晝夜節(jié)律通路成員基因的同源性匹配結(jié)果

表2 不同光照下仿刺參觸手轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)中部分生物鐘基因表達(dá)情況

圖1 仿刺參生物鐘基因在不同光照下的表達(dá)模式

重新分析不同光照環(huán)境下仿刺參觸手轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)中上述生物鐘基因的表達(dá)變化以初步探究光照條件改變是否影響仿刺參節(jié)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在此轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)中只有CLOCK基因在Lt1h:Lt5m組具有顯著下調(diào)表達(dá)(log2FC=-1.120 9，q-value=0.007 3)，除此之外在Lt1h:Lt5m中還發(fā)現(xiàn)BMAL1/CYC(log2FC=-0.274 74)和TIM(log2FC=-0.792 95)也具有下調(diào)表達(dá)趨勢。未發(fā)現(xiàn)有生物鐘基因在Dark:Lt1h或Dark:Lt5m組有顯著差異表達(dá)情況。隨后將所有生物鐘基因在不同光照條件下的表達(dá)量繪制聚類熱圖以直觀表示光照對生物鐘基因表達(dá)量的影響。結(jié)果表明，Dark組和Lt5m具有較相似的表達(dá)模式；除RBX1和AMPK以外，幾乎所有的生物鐘基因均在Lt5m組上調(diào)表達(dá)，在Lt1h組下調(diào)表達(dá)，就表達(dá)模式而言，光照能夠在一定程度上影響生物鐘基因在仿刺參中的表達(dá)量。

3 討論

生物節(jié)律普遍存在于生物的各級水平，是生命科學(xué)的重大基礎(chǔ)理論問題[17]。生物節(jié)律由機(jī)體的內(nèi)源性生物鐘驅(qū)動(dòng)和調(diào)控，生物鐘不停地自激振蕩，同時(shí)根據(jù)接收到的外界環(huán)境周期性變化的信號來調(diào)控自振激蕩，使機(jī)體生命活動(dòng)的節(jié)律與環(huán)境同步，隨外界環(huán)境的晝夜變化有節(jié)奏地、協(xié)調(diào)地進(jìn)行[18]。生物鐘存在機(jī)體的幾乎所有細(xì)胞中，其在細(xì)胞功能中產(chǎn)生節(jié)律，使生物過程24 h與環(huán)境保持一致[2,19]。生物體的光受體接受光-暗周期信號，通過一系列生物鐘基因表達(dá)變化，調(diào)節(jié)效應(yīng)器的活動(dòng)并與環(huán)境周期保持同步，是不同生物的生物鐘運(yùn)作的普遍分子機(jī)制[17,20]。盡管不同生物的生物鐘基因的表達(dá)調(diào)控模式有所區(qū)別，但目前研究表明，從果蠅到哺乳動(dòng)物的生物鐘基因具有同源性[21-22]，分化性[23]，結(jié)構(gòu)多態(tài)性[24-25]，基因結(jié)構(gòu)保守性[26]。本研究結(jié)果也表明，針對哺乳動(dòng)物和果蠅的晝夜節(jié)律通路成員基因，在仿刺參基因組中找到了絕大多數(shù)的同源基因，支持了仿刺參的晝伏夜出的習(xí)性是其內(nèi)源性生物鐘調(diào)控結(jié)果，但大多數(shù)模式生物為晝行性晝夜節(jié)律，且PER等關(guān)鍵基因未能匹配到同源基因說明仍需要對仿刺參的晝夜節(jié)律調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入探究。

在果蠅中，CLOCK和CYC均為轉(zhuǎn)錄因子，通常以異二聚體形式發(fā)揮正性調(diào)節(jié)作用。PER和TIM兩種基因啟動(dòng)子的E-框是其作用的目標(biāo)靶。CLOCK：CYC異二聚體能夠激活PER和TIM基因轉(zhuǎn)錄生成相應(yīng)蛋白，而且也激活VRI、PDF、CCG等基因生成蛋白質(zhì)或引起相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)[27]。昆蟲的行為節(jié)律受光周期制約，而在這種制約機(jī)制中光周期所起的作用是給內(nèi)源性行為節(jié)律提供所需的時(shí)間信號[8]。轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)表明，在Lt1h:Lt5m組，CLOCK表達(dá)量顯著下調(diào)，BMAL1/CYC也具有下調(diào)的趨勢，CLOCK:CYC異二聚體下調(diào)表達(dá)可能會減弱這種正向調(diào)節(jié)作用，除了未檢索到的PER同源基因，CLOCK:CYC異二聚體激活的TIM在Lt1h:Lt5m也具有下調(diào)趨勢。上述生物鐘基因下調(diào)表達(dá)能夠減弱生物體的生物學(xué)效應(yīng)，說明人為施加光源刺激能夠在一定程度上干擾仿刺參節(jié)律，減弱其活動(dòng)。仿刺參本是一種晝伏夜出的生物，在白天光照充足下活動(dòng)較弱，棲息于自然界中光強(qiáng)較低的陰影處。孫佳敏等[12]的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)也表明非正常的自然光照能夠影響仿刺參攝食節(jié)律，結(jié)合轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，生物鐘基因在光照后5 min先上調(diào)表達(dá)，在光照1 h又下調(diào)表達(dá)，推測可能是仿刺參對突如其來的非常規(guī)光照刺激的一種應(yīng)激表達(dá)現(xiàn)象；但是在5 min到1 h之間，生物鐘基因受光照刺激后恢復(fù)正常的調(diào)控表達(dá)模式，下調(diào)表達(dá)以給予機(jī)體減弱活動(dòng)的信號。

因目前尚未有任何關(guān)于仿刺參晝夜節(jié)律基因的研究，且大多數(shù)關(guān)于仿刺參自然狀態(tài)下的行為研究集中于攝食活動(dòng)與光照影響的行為特征，關(guān)于晝夜節(jié)律參考較少。本研究仍存在一定局限性，參考了人和果蠅晝夜節(jié)律通路，兩者與仿刺參親緣性仍較遠(yuǎn)，是否存在仿刺參特有晝夜節(jié)律基因仍需要系統(tǒng)和全面的研究；本文選取的為仿刺參觸手只是仿刺參的局部組織，其它重要組織如體壁、管足等是否為重要的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)組織仍待考究，且本實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行生理實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，需要更全面和更深入的進(jìn)一步探究，以填補(bǔ)經(jīng)典生物鐘基因的空白部分，闡明仿刺參的晝夜節(jié)律。