王 瑋，楊世林, 2，彭萬錢，張 壯，歐陽輝, 3，馮育林, 2，羅穎穎*，何明珍, 2*

? 藥理與臨床 ?

蓽澄茄素治療失眠癥的藥效及相關(guān)機制研究

王 瑋1，楊世林1, 2，彭萬錢1，張 壯1，歐陽輝1, 3，馮育林1, 2，羅穎穎1*，何明珍1, 2*

1. 江西中醫(yī)藥大學(xué) 中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，江西 南昌 330006 2. 創(chuàng)新藥物與高效節(jié)能降耗制藥設(shè)備國家重點實驗室，江西 南昌 330006 3. 南昌市中藥與天然藥物活性成分研究重點實驗室，江西 南昌 330006

蓽澄茄素；失眠；睡眠剝奪；神經(jīng)遞質(zhì)；γ-氨基丁酸A受體α1

蓽澄茄素是從木犀科丁香屬植物紫丁香Lindl.分離得到的二芐基丁內(nèi)酯木脂素成分，其莖在藏族地區(qū)又稱藏沉香，民間常用作鎮(zhèn)靜安神藥。研究表明，蓽澄茄素具有滅錐蟲、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗癌等活性[8-11]，且對東莨菪堿誘導(dǎo)的小鼠遺忘癥具有神經(jīng)保護(hù)作用[12]，但關(guān)于其治療失眠癥的研究鮮有報道。因此，本研究擬初步探討蓽澄茄素治療失眠癥的藥效及潛在作用機制，為開發(fā)治療失眠癥的創(chuàng)新藥物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性ICR小鼠，體質(zhì)量16～18 g，4周齡，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，許可證號SCXK（湘）2019-0004。動物于12 h光暗周期、室溫22～24 ℃、濕度恒定的飼養(yǎng)室，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，自由進(jìn)食飲水。動物實驗經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號JZLLSC20210067）。

1.2 藥品與試劑

蓽澄茄素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.7%）由江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗室提供；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，批號20210401）購自展云化工有限公司；戊巴比妥鈉（批號2015011301）購自美國Merck公司；地西泮片（批號20191004）購自信誼制藥有限公司；二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號J20GR142557）購自源葉生物科技有限公司；氟馬西尼（批號Ro15-1788）購自MCE公司；濃縮型正常山羊血清（批號12L08A09）購自博士德生物工程有限公司；牛血清白蛋白（批號0703010160）購自Gen-view科技有限公司；檸檬酸鈉緩沖液（批號1114A0144）、蘇木素（批號20200629）、中性樹膠（批號6071021）購自北京索萊寶科技有限公司；DAB試劑盒（批號CW2069S）、TRIzol試劑（批號05421）購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；組織固定液（批號20210826）購自美倫生物技術(shù)有限公司；OCT包埋劑（批號1906-00）購自日本Sakura公司；對照品5-羥吲哚乙酸（5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA，批號BCCD4271，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT，批號BCCF8292，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購自美國Sigma公司；對照品γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA，批號B21979，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、-谷氨酸（-glutamic acid，Glu，批號B21916，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購自源葉生物科技有限公司；第一鏈cDNA合成試劑盒（批號H2126010）、Hieff UNICON?Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix（批號H6004030）購自上海翌圣生物科技有限公司；3,4-二羥基芐胺（3,4-dihydroxybenzylamine，DHBA，批號C11856507，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%）購自上海麥克林生化科技有限公司；γ-氨基丁酸受體Aα1（γ-aminobutyric acid A receptor α1，GABAAα1）抗體（批號DF8548）購自Affinity公司。

1.3 儀器

RM2235型切片機、DM2500型光學(xué)顯微鏡、CM1850型冰凍切片機（德國Leica公司）；KD-TS3A型組織自動脫水儀（北京佳源興業(yè)科技公司）；YB6LF型組織包埋機（湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)公司）；QTRAP 4500型質(zhì)譜儀、7500型qRT-PCR儀（美國AB Sciex公司）；5810R型冷凍離心機、AG型普通PCR儀（德國Eppendorf公司）；Tissuelyser-48型全自動樣品快速研磨儀（上海凈信科技有限公司）；KQ-4000B型數(shù)字超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法

2.1 蓽澄茄素對正常小鼠的作用研究

2.1.1 戊巴比妥鈉閾下實驗 實驗前首先進(jìn)行戊巴比妥鈉閾下劑量摸索，將30只小鼠隨機分為戊巴比妥鈉高、中、低劑量（35、30、25 mg/kg）組，小鼠ip戊巴比妥鈉，記錄入睡小鼠只數(shù)。閾下劑量選擇使90%～100%小鼠翻正反射不消失的最大劑量。另將60只小鼠隨機分為對照組及蓽澄茄素高、中、低劑量（100、50、25 mg/kg）組和地西泮（2 mg/kg）組，每組12只。藥物用0.5% CMC-Na溶液研磨配制成混懸液，各給藥組ig相應(yīng)藥物（10 mL/kg），對照組ig等體積的溶劑。給藥30 min后，ip戊巴比妥鈉閾下劑量，記錄30 min內(nèi)入睡小鼠只數(shù)。

2.1.2 戊巴比妥鈉閾上實驗 實驗前首先進(jìn)行戊巴比妥鈉閾上劑量摸索，將30只小鼠隨機分為戊巴比妥鈉高、中、低劑量（50、45、40 mg/kg）組，小鼠ip戊巴比妥鈉，記錄入睡小鼠只數(shù)。閾上劑量選擇使100%小鼠翻正反射消失的最小劑量。另將60只動物按“2.1.1”項下方法進(jìn)行分組和給藥，給藥30 min后，ip戊巴比妥鈉閾上劑量，記錄小鼠的入睡潛伏期（注射后到翻正反射消失的時間）和睡眠持續(xù)時間（翻正反射消失到恢復(fù)的時間）。

2.1.3 氟馬西尼拮抗實驗 取40只小鼠隨機分為蓽澄茄素＋氟馬西尼＋戊巴比妥鈉組、地西泮＋氟馬西尼＋戊巴比妥鈉組、溶劑（0.5% CMC-Na溶液）＋戊巴比妥鈉組、地西泮＋戊巴比妥鈉組以及蓽澄茄素＋戊巴比妥鈉組，每組8只。氟馬西尼作為蓽澄茄素機制研究的假設(shè)拮抗藥物，在給藥前20 min ip氟馬西尼（5 mg/kg）[13]，然后ig蓽澄茄素（100 mg/kg）、地西泮（2 mg/kg）或溶劑，30 min后ip戊巴比妥鈉閾下劑量，記錄30 min內(nèi)入睡小鼠只數(shù)。

2.1.4 免疫組化法觀察蓽澄茄素對正常小鼠腦組織GABAAα1蛋白表達(dá)的影響 將小鼠分為對照組、蓽澄茄素（100 mg/kg）組和地西泮（2 mg/kg）組，每組10只。各給藥組ig相應(yīng)藥物后，小鼠脫頸椎處死，取出腦組織浸泡于組織固定液中，自來水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透化，石蠟包埋后切片（厚5 μm），于42 ℃溫水中展片。按照DAB試劑盒說明書，分別滴加GABAAα1抗體及生物素標(biāo)記的羊抗兔/鼠抗體，另設(shè)置陰性對照未加一抗。通過Image J軟件統(tǒng)計GABAAα1陽性表達(dá)面積占比。

2.2 蓽澄茄素對睡眠剝奪小鼠的作用研究

將小鼠分為對照組、模型組、地西泮（2 mg/kg）組和蓽澄茄素低、中、高劑量（10、20、40 mg/kg）組，每組6只。除對照組外，其余各組參照文獻(xiàn)方法[14]制備失眠模型：采用厚度為80 mm玻璃制作110 cm×75 cm×50 cm的睡眠剝奪箱，箱內(nèi)放置12個高度為8 cm、直徑為6.3 cm的金屬平臺，平臺間相距15 cm，箱內(nèi)水深度為7 cm，水溫保持22 ℃，箱上置網(wǎng)蓋，網(wǎng)蓋上放置食物和水。除對照組小鼠外均放置在睡眠剝奪箱中的金屬平臺上，期間允許小鼠自由攝水?dāng)z食，每當(dāng)小鼠要進(jìn)入睡眠狀態(tài)時，其全身骨骼肌張力明顯降低，會垂頭觸水或落入水中而驚醒，無法進(jìn)入睡眠，即為睡眠剝奪。1周后，當(dāng)造模小鼠出現(xiàn)攝食減少、驚恐狀、易激惹、脫毛嚴(yán)重、相互撕咬等情況時，表明模型構(gòu)建成功。造模成功后各給藥組ig相應(yīng)藥物，對照組ig等體積的溶劑，1次/d，連續(xù)1周，給藥結(jié)束后進(jìn)行曠場實驗，收集腦組織。

2.2.1 曠場實驗 各給藥組ig相應(yīng)藥物30 min后進(jìn)行曠場實驗，小鼠在曠場儀中適應(yīng)2 min，用相應(yīng)儀器錄制各組小鼠10 min內(nèi)的總路程、平均速度、活動次數(shù)及時間、中央路程、中央平均速度等行為學(xué)指標(biāo)。

2.2.2 免疫組化法觀察蓽澄茄素對睡眠剝奪小鼠腦組織中GABAAα1蛋白表達(dá)的影響 按“2.1.4”項下方法檢測各組小鼠腦組織GABAAα1蛋白表達(dá)。

2.2.3 qRT-PCR檢測皮層和海馬組織中mRNA表達(dá) 按照試劑盒說明書分別提取各組小鼠皮層和海馬組織中總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列：上游引物5’-ACTGCTGGACGGTTATGACAATCG-3’、下游引物：5’-GAGTGCCATCCTCTGTGATACGC-3’；上游引物：5’-AGGGAAATCGTGCGTGAC-3’、下游引物：5’-AT-ACCCAGGAAGGAAGGCT-3’。

2.2.4 LC-MS/MS檢測腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量變化 稱定腦組織，加入10倍的水制成腦勻漿后，加入4倍體積的甲醇，混勻后在冰上放置25 min，12 000 r/min離心15min，每100微升樣品加10 μL內(nèi)標(biāo)（DHBA，0.3 g/L），進(jìn)行LC-MS/MS分析[15-16]。

（1）色譜條件：Hypersll GOLD HILIC色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.9 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～3 min，95% B；3～4 min，95%～8% B；4～9 min，8%～5% B；9～10 min，5%～2% B；10～11 min，2%～95% B；11～12 min，95% B。體積流量0.3 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；柱溫35 ℃。

（2）質(zhì)譜條件：以正離子多反應(yīng)檢測（MRM）模式進(jìn)行掃描。神經(jīng)遞質(zhì)檢測離子對及質(zhì)譜離子化條件見表1。

（3）方法學(xué)考察：①專屬性：精密量取GABA、Glu、5-HT、5-HIAA對照品分別配制成500 ng/mL的溶液，按色譜條件進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖1。②線性范圍：精密吸取上述對照品溶液，稀釋至500、250、125、50、25、10、5、2.5、1 ng/mL的系列溶液后進(jìn)行LC-MS/MS檢測，結(jié)果見表2。③精密度：取上述線性范圍內(nèi)的對照品溶液低、中、高的對照品溶液各3份，進(jìn)行LC-MS/MS分析，在同一天內(nèi)每個樣品重復(fù)進(jìn)樣3次，計算精密度，見表3，均符合生物樣品的分析要求。

2.3 統(tǒng)計學(xué)分析

表1 質(zhì)譜條件

Table 1 Mass spectrometry conditions

神經(jīng)遞質(zhì)Q1→Q3(m/z)去簇電壓/V入口電壓/V碰撞能/eV碰撞室出口電壓/V GABA104.1→87.12610154 Glu148.0→84.32610214 5HT177.2→160.01610154 5HIAA192.2→146.02410354 DHBA140.1→123.11010174

圖1 各神經(jīng)遞質(zhì)對照品(A) 與腦樣品(B) 的LC-MS/MS分析

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

Table 2 Standard curve and linear range

神經(jīng)遞質(zhì)線性范圍/(ng·mL?1)回歸方程R2 GABA5.0～250.0y＝7.66×104x＋5.24×1050.992 9 GLU2.5～500.0y＝0.95×103x＋1.48×1040.999 2 5-HT5.0～500.0y＝2.9×104x＋2.32×1050.995 3 5-HIAA5.0～250.0y＝239 x＋3.96×1030.990 6

3 結(jié)果

3.1 蓽澄茄素對正常小鼠的作用

3.1.1 戊巴比妥鈉協(xié)同實驗 閾下實驗結(jié)果（表4）表明，與對照組比較，地西泮組和蓽澄茄素中、高劑量組均能顯著增加入睡動物數(shù)（＜0.01），且蓽澄茄素誘導(dǎo)小鼠入睡率呈劑量相關(guān)性。閾上實驗結(jié)果（表5）表明，與對照組比較，地西泮可以明顯縮短動物入睡潛伏期時間（＜0.01），蓽澄茄素各劑量組均能顯著延長小鼠睡眠時間（＜0.01），且呈劑量相關(guān)性。

表3 準(zhǔn)確度及精密度

Table 3 Accuracy and precision

神經(jīng)遞質(zhì)質(zhì)量濃度/(ng·mL?1)準(zhǔn)確度RSD/%精密度RSD/% GABA50.857.81 500.802.31 2501.341.30 GLU2.50.562.86 504.053.38 5002.442.52 5-HT50.075.06 500.324.62 5000.431.84 5-HIAA50.146.60 500.572.48 2500.751.15

表4 蓽澄茄素聯(lián)合戊巴比妥鈉閾下劑量 (30 mg·kg) 對小鼠睡眠的影響( = 12)

Table 4 Effects of cubebin combined with pentobarbital sodium subthreshold dose (30 mg·kg) on sleep of mice ( = 12)

組別劑量/(mg·kg?1)入睡率/% 對照—10 地西泮290** 蓽澄茄素2550 5080** 10090**

與對照組比較：**＜0.01，下表同

**< 0.01control group, same as below tables

3.1.2 免疫組化實驗 如圖2所示，蓽澄茄素和地西泮顯著增加小鼠皮層GABAAα1蛋白表達(dá)（＜0.05、0.01），而對海馬組織GABAAα1表達(dá)無明顯影響，表明蓽澄茄素可能是通過作用于皮層GABAAα1發(fā)揮作用。

表5 蓽澄茄素聯(lián)合戊巴比妥鈉閾上劑量(45 mg·kg?1) 對小鼠睡眠的影響(, n = 12)

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

3.2 蓽澄茄素對失眠小鼠的作用

3.2.1 曠場實驗 如圖4所示，與對照組比較，模型組小鼠總路程、平均速度和中央路程、中央平均速度均顯著增加（＜0.05）；與模型組比較，蓽澄茄素各劑量組均能顯著降低小鼠的總路程、平均速度、中央路程、中央平均速度、活動時間（＜0.05、0.01），顯著增加小鼠的活動次數(shù)（＜0.05、0.01）。

3.2.2 qRT-PCR檢測小鼠海馬和皮層組織中mRNA表達(dá) 如圖5所示，與對照組比較，模型組小鼠海馬和皮層組織中mRNA表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01）；與模型組比較，蓽澄茄素中劑量組海馬組織中mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.05），各給藥組小鼠皮層mRNA表達(dá)均顯著升高（＜0.05、0.01）。

圖3 氟馬西尼聯(lián)合戊巴比妥鈉閾下劑量誘導(dǎo)各組小鼠的入睡率(n = 8)

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.05，下圖同

圖5 蓽澄茄素對睡眠剝奪小鼠海馬組織和皮層中GABAAα1基因表達(dá)的影響(, n = 6)

3.2.3 免疫組化檢測小鼠海馬和皮層組織中GABAAα1蛋白表達(dá) 如圖6所示，與對照組比較，模型組小鼠海馬和皮層組織中GABAAα1蛋白表達(dá)均顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，蓽澄茄素低、高劑量組小鼠皮層組織中GABAAα1蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.05），蓽澄茄素高劑量組小鼠海馬組織中GABAAα1蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.05），地西泮組海馬和皮層組織中GABAAα1蛋白表達(dá)均顯著升高（＜0.05）。

3.2.4 LC-MS/MS檢測小鼠海馬和皮層組織中神經(jīng)遞質(zhì)含量 如圖7所示，與對照組比較，模型組小鼠海馬組織中GABA、Glu、5-HT及5-HIAA水平無顯著變化；與模型組比較，蓽澄茄素高劑量組海馬組織中Glu水平顯著降低（＜0.05），蓽澄茄素中、高劑量組海馬組織中GABA水平顯著升高（＜0.05、0.01）。如圖8所示，與對照組比較，模型組小鼠皮層組織中GABA、5-HT、Glu水平均顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，蓽澄茄素低、高劑量可顯著升高皮層組織中GABA、Glu水平（＜0.05、0.01），蓽澄茄素中、高劑量組皮層組織中代謝產(chǎn)物5-HIAA水平顯著升高（＜0.05），地西泮組皮層組織中Glu水平顯著降低（＜0.01）。

圖6 蓽澄茄素對睡眠剝奪小鼠海馬組織和皮層組織中GABAAα1蛋白表達(dá)的影響(, n = 6)

圖7 蓽澄茄素對睡眠剝奪小鼠海馬組織中神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響(, n = 6)

圖8 蓽澄茄素對睡眠剝奪小鼠皮層中神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響(, n = 6)

4. 討論

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Efficacy and related mechanism of cubebin in treatment of insomnia

WANG Wei1, YANG Shi-lin1, 2, PENG Wan-qian1, ZHANG Zhuang1, OUYANG Hui1, 3, FENG Yu-lin1, 2, LUO Ying-ying1, HE Ming-zhen1, 2

1. National Engineering Center of Solid Preparation of Chinese Materia Medical Manufacturing Technology, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330006, China 2. State Key Laboratory of Innovative Drug and Efficient Energy-Saving Pharmaceutical Equipment, Nanchang 330006, China 3. Nanchang Key Laboratory of Active Ingredients of Traditional Chinese Medicine and Natural Medicine, Nanchang 330006, China

To explore the efficacy and potential mechanism of cubebin in sleep deprived mice.Firstly, sleep promoting effect of cubebin on normal mice was investigated: Mice were randomly divided into control group, diazepam (2 mg/kg) group, cubebin low-, medium- and high-dose (25, 50, 100 mg/kg) group, each administration group was ig corresponding drugs, sleep rate and sleep duration of rats in each group were recorded; Immunohistochemical staining was used to detect γ-aminobutyric acid A receptor α1 (GABAAα1) protein expression in brain tissue of mice; Flumazenil antagonism experiment was used to verify whether the effects of cubebin are related to benzodiazepine receptors. Secondly, effect of cubebin on sleep deprived mice was observed: Mice were divided into control group, model group, diazepam (2 mg/kg) group, cubebin low-, medium-and high-dose (10, 20, 40 mg/kg) group, drugs were given for intervention, open field test was used for behavioral testing; LC-MS/MS was used to detect the content of neurotransmitters [GABA,-glutamic acid (Glu), 5-hydroxytryptamine (5-HT) and 5-hydroxyindoleacetic acid (5-HIAA)] in brain tissue; Immunohistochemical staining and qRT-PCR were used to detect GABAAα1 expression in brain tissue.The results of study on sleep promoting effect of cubebin on normal mice showed that, cubebin significantly increased the sleep rate of normal mice (< 0.01), significantly prolonged the sleep duration of mice (< 0.01), and significantly increased GABAAα1 expression in cerebral cortex (< 0.05); Flumazenil could antagonize the sleep-promoting effect of cubebin. The results of study on effect of cubebin on sleep deprived mice showed that, compared with control group, activity of mice in model group was significantly increased (< 0.05), GABAAα1 expression and GABA, Glu, 5-HIAA contents in brain tissue were significantly reduced (< 0.05, 0.01); Compared with model group, activity of mice in cubebin group was significantly reduced (< 0.05, 0.01), GABAAα1 expression and GABA, Glu, 5-HIAA contents in brain tissue were significantly increased (< 0.05, 0.01).Cubebin has a sleep-promoting effect on both normal and sleep deprived mice, and may exert its effect by regulating the content of GABAAα1 and neurotransmitters GABA, Glu and 5-HIAA in brain.

cubebin;insomnia; sleep deprivation; neurotransmitter; γ-aminobutyric acid Areceptor α1

R285.5

A

0253 - 2670(2022)21 - 6750 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.21.012

2022-07-23

國家重點研發(fā)計劃課題（2019YFC1712302）；中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展專項項目（20192ZDD02002）；江西省教育廳科技計劃（201222）；中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展資金項目（20221ZDD02007）；江西省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（S202210412081）

王 瑋（1996—），女，碩士研究生，研究方向為中藥學(xué)與中藥藥理學(xué)。Tel: 15222817652 E-mail: 15222817652@163.com

羅穎穎（1982—），女，碩士生導(dǎo)師，研究方向為中藥藥效評價及作用機制。Tel: 13576133107 E-mail: luoying0302@163.com

何明珍（1977—），女，碩士生導(dǎo)師，研究方向為中藥活性成分及其體內(nèi)代謝。Tel: 13755757218 E-mail: hmz07@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]