王 慧，崔瑩瑩，唐祎依，呂明月，黨光輝，崔子寅，曹 俊，宋寧寧，劉思國*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/動物細菌病創(chuàng)新團隊，黑龍江 哈爾濱 150069；2. 濰坊醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東 濰坊 261053）

結(jié)核?。═uberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的一種嚴重危害人類健康的重要傳染病，根據(jù)2020 年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計結(jié)果顯示，2019 年全球新發(fā)TB 患者約1 000萬人，其中我國新發(fā)TB 患者排名全球第二位[1]，而與艾滋病的雙重感染及耐藥結(jié)核菌的出現(xiàn)也是造成人類TB 死亡的重要原因。MTB 能夠在宿主體內(nèi)進入休眠狀態(tài)，并通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白實現(xiàn)對活性氧（ROS）、金屬離子以及藥物殺滅等不利因素的適應(yīng)，從而維持自身穩(wěn)定和生存，因此MTB 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白具有成為藥物靶標(biāo)的潛在可能。

Rv0827c（KmtR）屬于ArsR/SmtB 家族轉(zhuǎn)錄因子中的一員，具有保守的DNA 識別基序，即螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（helix-turn-helix）結(jié)構(gòu)，通常形成同源二聚體結(jié)合到自身基因啟動子區(qū)域[2]。在缺乏金屬離子的情況下，ArsR/SmtB 家族轉(zhuǎn)錄抑制因子與編碼蛋白質(zhì)基因的啟動子結(jié)合，而這些蛋白質(zhì)參與過量金屬離子的流出或者螯合反應(yīng)[3]。如果環(huán)境中重金屬離子達到有毒濃度閾值時則能夠釋放操縱子，使生物體能夠在有毒環(huán)境中生存。然而，目前受調(diào)控蛋白Rv0827c調(diào)控的靶基因及其影響調(diào)控作用的輔助因子尚不清楚。Rv3616c（EspA）是ESX-1 分泌系統(tǒng)成員之一，EspA 的缺失導(dǎo)致細菌細胞壁的完整性受到破壞[4]，進而影響MTB 的毒力[5]。但是，EspA 的表達受到哪些轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的調(diào)控尚不清楚。

Rv0827c 轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白是否能夠與預(yù)測的23 種啟動子結(jié)合，以及rv3616c是否為轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白Rv0827c 新的調(diào)控靶點？金屬離子等小分子是否會影響Rv0827c與rv3616c的結(jié)合？本研究對這幾個問題深入研究，為了解Rv0827c的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體、實驗動物及主要試劑MTB H37Ra 株基因組和pET-22b 載體由本實驗室保存；E. coliDH5α 和E. coliBL21（DE3）感受態(tài)細胞購自南京諾唯贊（Vazyme）生物科技有限公司；新西蘭大白兔購自坤達養(yǎng)殖場；7H9 和LB 液體培養(yǎng)基/固體培養(yǎng)基均購自美國BD 公司；PrimeSTAR Premix 購自大連TaKaRa 公司；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自O(shè)MEGA 公司；親和層析樹脂購自美國GE 公司；BCA 蛋白定量檢測試劑盒、Protein A/G Magnetic Beads、M-280 山羊抗兔IgG 免疫磁珠以及EMSA（Electrophoretic Mobility-Shift Assay）試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；i-Pure DNA 提取試劑盒購自Diagenode 公司；SA 芯片以及10×HBS-EP 緩沖液購自美國思拓凡公司；放線菌素-D 購自Alphabio 公司；弗氏不完全佐劑和甲基綠均購自Sigma-ALDRICH 公司；小鼠抗His 單克隆抗體（MAb）購自天根生化科技（北京）有限公司；山羊抗鼠IDDye 熒光素IgG 購自LI-COR 公司。

1.2 重組Rv0827c 蛋白（rRv0827c）的表達與純化參照GenBank 中MTB H37Ra 標(biāo)準株中23 種基因序列，以其上游350 bp 左右作為啟動子片段，利用Primer 6.0 軟件設(shè)計引物（表1），引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。以MTB H37Ra 基因組為模板，采用特異性引物（表1）通過PCR 擴增rv0827c基因，經(jīng)BamH I與NdeI雙酶切后克隆至pET-22b載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-22b-rv0827c并經(jīng)酶切與測序鑒定。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細胞后在37 ℃180 r/min 條件下培養(yǎng)至OD600nm=0.8，加入終濃度1 mmol/L IPTG 37 ℃誘導(dǎo)表達4 h，8 000 r/min 離心收集菌體。超聲破碎后離心，收集沉淀，經(jīng)0.5%SKL變性以及復(fù)性后，利用Ni-NTA 親和樹脂純化。重組蛋白經(jīng)200 mmol/L、500 mmol/L 咪唑洗脫液洗脫并濃縮除鹽，經(jīng)BCA 蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白濃度。以小鼠抗His MAb（1∶5 000）為一抗，山羊抗鼠IDDye 熒光素IgG（1∶10 000）為二抗，經(jīng)western blot 鑒定正確后，-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 PCR引物序列Table 1 The primers sequence of PCR

1.3 rRv0827c 多克隆抗體的制備與純化 選取2 只體重約2.0 kg 的新西蘭大白兔，先取少量耳靜脈血作為陰性對照，隨后將純化的rRv0827c 與弗式不完全佐劑按照1∶1 的體積比乳化，將其背部多點皮下注射免疫兔子，400 μg/只，每隔12 d 免疫1 次，免疫3 次后經(jīng)頸動脈采血，分離血清并保存于-80 ℃。將獲得的免疫血清結(jié)合于protein G 親和層析柱介質(zhì)，利用Elution buffer 依次洗脫，得到rRv0827c 多克隆抗體，采用ELISA 方法檢測多克隆抗體的效價[6]，以免疫前血清作為陰性對照，用于后續(xù)試驗。

1.4 rRv0827c 與啟動子DNA 體外結(jié)合的凝膠遷移（EMSA）試驗 根據(jù)細菌單雜交數(shù)據(jù)的預(yù)測，rRv0827c具有廣泛的調(diào)控作用，能夠與多個基因的啟動子結(jié)合。以MTB H37Ra 株基因組為模板，采用特異性引物（表1），通過PCR 分別擴增23 個基因的啟動子，按照EMSA 方法，配制20 μL EMSA 反應(yīng)體系：2 μL 30 ng/μL 啟動子DNA；3 μL 10.04 μmol/L rRv0827c；4 μL 5×binding buffer，ddH2O 補足，以未加蛋白的體系作為對照，將rRv0827c 與上述23 個基因啟動子37 ℃孵育30 min，后經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠分析，驗證體外條件下rRv0827c 與23 種啟動子的結(jié)合情況。

1.5 rRv0827c 與啟動子DNA 菌體內(nèi)結(jié)合的免疫共沉淀（ChIP）試驗 根據(jù)染色質(zhì)ChIP 試驗方法，將200 mL MTB H37Ra 株菌液培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600nm=0.8），加入終濃度1%的甲醛交聯(lián)10 min，隨后加入終濃度125 mmol/L甘氨酸終止交聯(lián)，3 500 r/min離心15 min 收集菌體沉淀，并用預(yù)冷的PBS 洗滌2 次，用3 mL 裂解液重懸沉淀后經(jīng)超聲破碎，13 000 r/min離心收集上清，轉(zhuǎn)移至新的EP 管中。取上清100 μL進行反交聯(lián)，通過酚氯仿法提取菌體中的基因組后，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確?；蚪M片段破碎后分布在100 bp～700 bp；取上述1.3 方法中制備的rRv0827c 多克隆抗體100 μL，4 ℃包被M-280 山羊抗兔IgG 免疫磁珠90 min，后取1.2 mL 超聲后上清與已包被磁珠于4 ℃過夜孵育，洗滌磁珠后，利用i-Pure DNA 提取試劑盒收集磁珠上多克隆抗體富集的rRv0827c-DNA 復(fù)合物，純化并分離出復(fù)合物中的DNA，通過乙醇沉淀得到DNA。將收集的DNA 100倍稀釋后作為模板，采用表1 中的引物對23 種啟動子進行PCR 擴增，驗證體內(nèi)條件下rRv0827c 與23 種啟動子的結(jié)合情況。

1.6 rRv0827c 與rv3616c啟 動 子DNA 特 異 性 結(jié) 合及大溝小溝結(jié)合試驗 以MTB H37Ra 基因組為模板，采用5′端Cy5 標(biāo)記引物Rv3616c-F/R（表1），PCR 擴增得到Cy5 標(biāo)記的rv3616c啟動子，分別將終濃度為40 nmol/L、60 nmol/L、80 nmol/L未標(biāo)記Cy5的rv3616c啟動子加入到終濃度36.1 nmol/L Cy5 標(biāo)記的rv3616c啟動子與rRv0827 蛋白的反應(yīng)體系中，進行EMSA，使未標(biāo)記的rv3616c競爭結(jié)合蛋白；甲基綠和放線菌素-D 已被報道能夠分別結(jié)合于DNA 的大溝以及小溝[7]，將rRv0827c 和Cy5 標(biāo)記的rv3616c啟動子DNA 分 別 與0.05 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1.25 mmol/L 的放線菌素-D，及分別與20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L、50 μmol/L 的甲基綠混合，進行EMSA，37 ℃孵育30 min，經(jīng)8 %非變性聚丙烯酰胺凝膠在200 V 下電泳3 h，結(jié)束后用Typhoon 掃描儀對結(jié)果進行掃描分析，檢測rRv0827c 與rv3616c啟動子的特異性結(jié)合及結(jié)合區(qū)域。

1.7 金屬離子對rRv0827c 與rv3616c啟動子DNA結(jié)合影響的檢測 利用EMSA 方法檢測10 種常見金屬離子（Cu2+、Mn2+、Co2+、Pb2+、Cr3+、Fe3+、Ni2+、Zn2+、Mg2+、Cd2+）對rRv0827c 與rv3616c啟動子結(jié)合的影響。如上述方法1.4 中的EMSA 方法所述，加入啟動子rv3616c及rRv0827c 后，分別加入終濃度為20 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L 的10種金屬離子，37 ℃孵育30 min后經(jīng)凝膠成像分析金屬離子對rRv0827c與rv3616c啟動子結(jié)合的影響。

1.8 rRv0827c 與rv3616c啟動子DNA 結(jié)合的表面等離子共振（SPR）試驗 以MTB H37Ra 基因組為模板，用生物素化的Rv3616c 引物（表1）擴增rv3616c啟動子片段，使得rv3616c啟動子3′端帶有生物素標(biāo)簽。采用SPR 試驗檢測rRv0827c 和rv3616c啟動子之間的相互作用，將生物素標(biāo)記的rv3616c啟動子片段用HBS-EP 緩沖液稀釋至0.125 ng/μL，打開Biacore 8K Control Software 中的偶聯(lián)（Immobilization）程序，選擇芯片種類為SA 芯片，設(shè)置流速為10 μL/min，進樣時間為20 s，將生物素標(biāo)記的rv3616c啟動子偶聯(lián)至SA 芯片表面，隨后使100 nmol/L～1 000 nmol/L 的rRv0827c流經(jīng)芯片表面，設(shè)置結(jié)合時間為300 s，解離時間為600 s，緩沖液為HBS-EP，通過Biacore Evaluation 軟件，進一步分析rRv0827c 和rv3616c啟動子的特異性結(jié)合。

1.9 啟動子DNA 保守核苷酸位點的確定 根據(jù)rRv0827c 與23 種啟動子DNA 的結(jié)合特性，將與rRv0827c 結(jié)合的啟動子DNA 序列利用MEME 軟件，分析保守的核苷酸位點并繪制Sequence logo 圖。

2 結(jié) 果

2.1 rRv0827c 的表達、純化及多克隆抗體的鑒定結(jié)果將經(jīng)酶切和測序鑒定構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒pET-22b-rv0827c轉(zhuǎn) 化E. coliBL21（DE3）感 受 態(tài) 細胞，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達親和層析純化后，利用western blot 鑒定。結(jié)果顯示在18.7 ku 處有目的條帶，與預(yù)期蛋白大小相符（圖1），表明rRv0827c 正確表達。將純化的rRv0827c 3 次免疫新西蘭大白兔后，對獲得的血清進行親和純化，經(jīng)SDS-PAGE 檢測結(jié)果顯示，在50 ku 以及20 ku 處出現(xiàn)重鏈以及輕鏈目的條帶（圖2），表明獲得純化的rRv0827c 多克隆抗體。

圖1 rRv0827c的western blot鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of the recombinant protein rRv0827c by western blot

圖2 抗rRv0827c多克隆抗體的SDS-PAGE鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of anti-rRv0827c polyclonal antibody by SDS-PAGE

2.2 rRv0827c 與啟動子DNA 體外結(jié)合的EMSA 試驗結(jié)果利用EMSA 試驗在體外驗證rRv0827c 與預(yù)測的23 個基因或基因簇的啟動子結(jié)合情況，啟動子片段經(jīng)PCR 擴增并純化后與rRv0827c 37 ℃孵育30 min 后進行凝膠成像分析。結(jié)果顯示23 種啟動子均能夠與rRv0827c 形成復(fù)合物，與未加入蛋白的游離啟動子DNA 對照相比，加入蛋白后可以觀察到明顯的蛋白-DNA 滯后帶（圖3），表明rRv0827c 在體外條件下能夠與這23 種啟動子結(jié)合。

圖3 rRv0827c與23種啟動子在體外結(jié)合的EMSA檢測結(jié)果Fig.3 The EMSA results of rRv0827c binding to 23 promoters in vitro

2.3 rRv0827c 與啟動子DNA 菌體內(nèi)結(jié)合的ChIP 試驗結(jié)果利用ChIP 試驗檢測rRv0827c 在菌體內(nèi)與預(yù)測的23 種啟動子的結(jié)合情況，以多克隆抗體富集的rRv0827c-DNA 復(fù)合物作為模板，利用相應(yīng)的引物（表1）通過PCR 分別擴增23 種啟動子片段，并設(shè)置MTB H37Ra 基因組DNA 及免疫前血清作為陽性及陰性對照。經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示加入rRv0827c 多克隆抗體富集的DNA 及MTB H37Ra 基因組DNA 均能夠擴增出明暗一致的條帶，而免疫前血清對照組未出現(xiàn)明顯條帶（圖4），表明rRv0827c在體內(nèi)也能夠與這23 種啟動子結(jié)合。

圖4 rRv0827c與23種啟動子在菌體內(nèi)結(jié)合的ChIP檢測結(jié)果Fig.4 The ChIP results of rRv0827c binding to 23 promoters in vivo

2.4 rRv0827c 與rv3616c啟動子DNA 的特異性結(jié)合及大溝小溝結(jié)合試驗結(jié)果為探究rRv0827c 與rv3616c啟動子DNA 能否特異性結(jié)合，本研究將高濃度的rv3616c啟動子DNA 分別與低濃度Cy5 標(biāo)記的rv3616c啟動子DNA 共同孵育，以競爭結(jié)合rRv0827c。結(jié)果顯示，隨著未標(biāo)記啟動子DNA 的濃度逐漸升高，rRv0827c 與Cy5 標(biāo)記的rv3616c啟動子DNA 的結(jié)合復(fù)合物減少，游離Cy5 標(biāo)記的rv3616c啟動子DNA逐漸增多，表明rRv0827c 能夠特異性結(jié)合rv3616c啟動子DNA（圖5）。為進一步探究rRv0827c 是結(jié)合在rv3616c的大溝還是小溝，將不同濃度的甲基綠與放線菌素-D 加入反應(yīng)體系后分析，結(jié)果顯示隨著甲基綠濃度的增加，rRv0827c 與Cy5 標(biāo)記的rv3616c啟動子DNA 的復(fù)合物逐漸減少，出現(xiàn)了更多的游離DNA；相反，增加放線菌素-D的濃度對該蛋白-DNA復(fù)合物的形成并未產(chǎn)生明顯的影響（圖6），表明rRv0827c 結(jié)合在rv3616c啟動子DNA 的大溝。

圖5 體外EMSA驗證rRv0827c特異性結(jié)合p/o rv3616c DNA Fig.5 EMSA identification of specific binding of rRv0827c to p/o rv3616c

圖6 rRv0827c與p/o rv3616c DNA大溝的結(jié)合試驗Fig.6 rRv0827c binds to the major groove of p/o rv3616c

2.5 金屬離子對rRv0827c 與rv3616c啟動子結(jié)合影響的EMSA 結(jié)果本研究利用EMSA 從10 種常見金屬離子中篩選影響rRv0827c 與rv3616c啟動子DNA 結(jié)合的金屬離子。結(jié)果顯示，Mn2+、Co2+、Pb2+、Cr3+、Fe3+、Ni2+、Mg2+在200 μmol/L 濃度下能夠影響二者的結(jié)合。其中Co2+、Ni2+、Cr3+影響較為顯著，進一步驗證發(fā)現(xiàn)，隨著Co2+、Ni2+濃度由20 μmol/L 提高至200 μmol/L 時，能夠明顯抑制rRv0827c 與rv3616c啟動子復(fù)合物的形成，游離DNA 逐漸增加；相反，隨著Cr3+濃度的逐漸增加，該蛋白-DNA 復(fù)合物更加穩(wěn)定，游離DNA 濃度逐漸減少至無（圖7）。結(jié)果表明Co2+、Ni2+能夠抑制rRv0827c 與rv3616c啟動子的結(jié)合，而Cr3+則能夠促進rRv0827c與rv3616c啟動子的結(jié)合。

圖7 金屬離子對rRv0827c與p/o rv3616c DNA結(jié)合的影響Fig.7 The effect of metal ion on rRv0827c binding to p/o rv3616c

2.6 rRv0827c 和rv3616c啟動子DNA 結(jié)合的SPR試驗結(jié)果將rRv0827c 經(jīng)SPR 檢測，分析rRv0827c與rv3616c啟動子DNA 之間的相互作用。結(jié)果顯示，由上到下的曲線依次是濃度由高到低的rRv0827c 在rv3616c啟動子DNA 表面流過的響應(yīng)值，隨著蛋白濃度由100 nmol/L 升高至1 000 nmol/L，響應(yīng)值由0.23 RU 逐漸上升至3.58 RU（圖8），響應(yīng)值的變化表明rRv0827c 能夠特異性結(jié)合rv3616c啟動子DNA。

圖8 rRv0827c與rv3616c啟動子DNA結(jié)合的SPR試驗結(jié)果Fig.8 SPR analysis of rRv0827c binding to rv3616c promoter

2.7 保守核苷酸位點的確定利用MEME 軟件分析23 種啟動子DNA 序列，繪制了Sequence logo，確定了長11 bp 的堿基序列，橫坐標(biāo)代表核苷酸的位置，縱坐標(biāo)代表該堿基在該位置的保守性。結(jié)果顯示，G4 和G10 非常保守，T2 和G7 相對保守（圖9），表明4G 和10G 為rv3616c啟 動 子DNA 與rRv0827c 互 作 的關(guān)鍵核苷酸位點。

圖9 保守核苷酸位點的確定Fig.9 Determination of conserved nucleotide sites

3 討 論

ArsR/SmtB 家族為目前研究的較為廣泛的金屬離子感應(yīng)蛋白，盡管ArsR/SmtB 家族成員具有許多共同的特征，但該家族成員間卻表現(xiàn)出對不同金屬離子的適應(yīng)性，如SmtB 蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制作用能夠被Zn2+緩解[8]，CzrA 介導(dǎo)的抑制作用能夠被Co2+以及Zn2+緩解[9]。Rv0827c（KmtR）屬于ArsR/SmtB 家族轉(zhuǎn)錄因子中的一員。本研究首先通過EMSA 試驗與ChIP試驗證實發(fā)現(xiàn)Rv0827c 能夠與細菌單雜交預(yù)測的與氧化還原及金屬離子轉(zhuǎn)運等功能相關(guān)的23 種啟動子發(fā)生結(jié)合，表明Rv0827c 能夠參與菌體內(nèi)各種重要的生理過程，對維持菌體內(nèi)金屬離子環(huán)境穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著不可忽視的作用，具有極其廣泛的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能與潛在的研究價值。

MTB 作為胞內(nèi)寄生菌給人類的健康造成了嚴重的危害，但目前對MTB 的致病機制仍知之甚少。MTB 的ESX-1 分泌系統(tǒng)對其毒力以及與宿主之間的相互作用是必需的，同時ESX-1 對ESAT-6 以及CFP-10 的分泌同樣至關(guān)重要，ESAT-6 是一種主要的毒力因子[10]，與多種宿主病原體相互作用有關(guān)[11]，包括宿主細胞裂解[12]、T 細胞抑制[13]和巨噬細胞炎性體激活[14]。Rv3616c（EspA）作為ESX-1 分泌系統(tǒng)的新成員之一受到越來越多的關(guān)注，EspA 和ESAT-6 的分泌相互依賴，EspA 的缺失導(dǎo)致ESAT-6 分泌的降低甚至喪失[15]。EspA 中二硫鍵形成的破壞雖然保留了ESX-1 的功能，但產(chǎn)生了大量的弱毒株，表明EspA 本身是一種主要的毒力因子[16]。細菌單雜交預(yù)測EspA 為Rv0827c 的潛在靶點，通過EMSA 試驗、ChIP試驗以及SPR 試驗證實Rv0827c 能夠特異性地結(jié)合rv3616c啟動子，這表明Rv0827c 能夠直接調(diào)控rv3616c的表達，影響MTB 的毒力。

金屬離子是生物體生存所必需的，過高濃度的金屬離子會產(chǎn)生毒性，在本研究中，Ni2+、Co2+能夠抑制Rv0827c 與rv3616c啟動子DNA 的結(jié)合，Cr3+則促進二者的結(jié)合，表明Rv0827c 蛋白表現(xiàn)出不同的金屬離子適應(yīng)性，但這種差異產(chǎn)生的原因尚不清楚，原因之一可能是不同的金屬離子與蛋白結(jié)合后會帶來Rv0827c 蛋白構(gòu)象的變化進而導(dǎo)致結(jié)合能力發(fā)生改變。通過分析23 個基因的啟動子序列結(jié)果顯示G4 以及G10 在大多數(shù)的DNA 序列中均非常保守，Rv0827c蛋白與啟動子的結(jié)合很大程度上依賴這兩個核苷酸位點發(fā)生相互作用。

本研究首次解析了MTB ArsR/SmtB 轉(zhuǎn)錄抑制因子家族中Rv0827c 潛在的23 個調(diào)控靶點，并對Rv0827c與毒力因子rv3616c調(diào)控靶點的相互作用進行了更進一步的研究，Rv0827c 能夠直接結(jié)合rv3616c啟動子DNA，推測其可能參與EspA 轉(zhuǎn)錄的調(diào)控甚至影響ESX-1 分泌系統(tǒng)的功能，表明Rv0827c 不僅在金屬離子轉(zhuǎn)運方面具有一定的調(diào)控作用，對MTB 毒力也有著重要的影響。綜上，本研究為深入解析Rv0827c的調(diào)控功能及完善Rv0827c 的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究奠定了實驗基礎(chǔ)，也為開發(fā)新的抗MTB 藥物提供了參考。