劉滿超，劉玉梅，張家俊，胡美忠，郁建生

(1.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院國家民委中獸藥重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，貴州 銅仁 554300；2.貴州健康職業(yè)學(xué)院健康管理系，貴州 銅仁 554300)

銀翹散出自清代名醫(yī)吳塘的《溫病條辨》，主要功效為辛涼透表、清熱解毒，主要用于外感風(fēng)寒、發(fā)熱頭痛、口干咳嗽、咽喉疼痛、小便短赤等病癥[1]。基于綠色養(yǎng)殖的理念，加上養(yǎng)殖界的禁抗運(yùn)動，近年來有不少動物養(yǎng)殖機(jī)構(gòu)將銀翹散用于預(yù)防和治療養(yǎng)殖動物的高熱[2]、禽流感[3-4]、大腸桿菌感染[5-6]、保胎[7]等，且效果良好。其配方中有金銀花、連翹、桔梗、薄荷、淡豆豉、淡竹葉、牛蒡子、荊芥、蘆根和甘草共10味中藥材[1]?！吨腥A人民共和國藥典》中銀翹散的含量測定項(xiàng)下只對牛蒡苷的含量進(jìn)行了規(guī)定，但銀翹散中有10味中草藥，且每種藥材中的化學(xué)成分都非常復(fù)雜，這就使得對銀翹散的質(zhì)量控制(如果只測定牛蒡苷)是不夠的。中藥指紋圖譜技術(shù)基于其能從整體上把控中藥的質(zhì)量，該技術(shù)在中藥質(zhì)量控制中的地位日漸上升[8-9]。本研究主要應(yīng)用UPLC技術(shù)對不同廠家的27批次銀翹散進(jìn)行指紋圖譜分析，建立了該條件下銀翹散的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，并對所得譜圖數(shù)據(jù)進(jìn)行相似度分析，主成分分析和聚類分析，為更為合理的評價銀翹散的質(zhì)量提供了一定的實(shí)驗(yàn)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Agilent 1290 UPLC 分析儀 ( 檢測器為 DAD，配置自動進(jìn)樣器，Agilent LC 色譜工作站)，流動相所用乙腈為色譜純，產(chǎn)自德國默克公司；超純水；其余試劑均為分析純。27批次銀翹散均采購自自由市場，編號從S1到S9，產(chǎn)自廠家1；編號S10-S18產(chǎn)自廠家2；編號S19-S27產(chǎn)自廠家3。

1.2 UPLC采集條件

Agilent ZORBAX SB-C18(3.0 mm×100 mm，1.8 μm) 色譜柱，檢測波長 230 nm，柱溫 30 ℃，進(jìn)樣量為 1 μL，以0.02% 磷酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～3 min，80% A; 3～3.1 min，80%～70% A; 3.1～6 min，70% A; 6～6.1 min，70%～60% A; 6.1～9 min，60% A；9～9.1 min，60%～50% A; 9.1～12 min，50% A; 12～12.1 min，50%～40% A; 12.1～15 min，40% A；15～15.1 min，40%～30% A; 15.1～18 min，30% A；18～18.1 min，30%～20% A; 18.1～21 min，20% A；21～21.1 min，20%～10% A; 21.1～24 min，10% A。流速 0. 3 mL/min)。

1.3 供試品溶液的制備

取銀翹散 5 g，研缽研細(xì)，過100目篩，精密稱取 0.2000 g，置 10 mL 離心管中。精密加入50% 甲醇水 10.00 mL，稱定質(zhì)量。超聲提取 30 min (功率 300 W，溫度 50 ℃)，再稱定質(zhì)量。用50% 甲醇水補(bǔ)足失重，搖勻，靜置 10 min，微孔濾膜(0. 22 μm)過濾至UPLC進(jìn)樣瓶中，置 4 ℃ 冰箱中待測定。

1.4 UPLC譜圖采集

按照“1.3”項(xiàng)下方法制備所有的供試品溶液，按照“1.2”項(xiàng)下所列方法，對所有樣品進(jìn)行UPLC色譜圖采集。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 精密度試驗(yàn)

取同一批次銀翹散1份，按照“1.3”項(xiàng)下所描述的方法制備供試品試液，然后按照“1.2”項(xiàng)下描述的方法進(jìn)行UPLC色譜圖采集，連續(xù)進(jìn)樣6次?？疾熘笜?biāo)為共有峰的保留時間、相對峰面積和各譜圖之間的相似度。經(jīng)計(jì)算，結(jié)果顯示，各共有峰的相對保留時間RSD值小于1.2%；各共有峰的相對峰面積值的RSD值小于1.3%。應(yīng)用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012，以第一次進(jìn)樣所得UPLC指紋圖譜為參照譜計(jì)算6次進(jìn)樣所得UPLC譜圖的相似度，結(jié)果顯示相似度均大于0.99，符合指紋圖譜分析的要求。表明該儀器及方法的精密度良好。

2.1.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次銀翹散6份，按照“1.3”項(xiàng)下所描述的方法制備供試品試液，然后按照“1.2”項(xiàng)下描述的方法進(jìn)行UPLC色譜圖采集?？疾熘笜?biāo)為共有峰的保留時間、相對峰面積和各譜圖之間的相似度。經(jīng)計(jì)算，結(jié)果顯示，各共有峰的相對保留時間RSD值小于1.4%；各共有峰的相對峰面積值的RSD值小于1.5%。應(yīng)用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012，以第一次進(jìn)樣所得UPLC指紋圖譜為參照譜計(jì)算6份銀翹散樣品的UPLC譜圖的相似度，結(jié)果顯示，相似度均大于0.99，符合指紋圖譜分析的要求，表明該儀器及方法的重復(fù)性良好。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批次銀翹散1份，按照“1.3”項(xiàng)下所描述的方法制備供試品試液，然后按照“1.2”項(xiàng)下描述的方法于供試品溶液制備好的時間開始 0 h， 5 h， 10 h， 15 h， 20 h， 25 h 進(jìn)行6次UPLC色譜圖采集?？疾熘笜?biāo)為共有峰的保留時間、相對峰面積和各譜圖之間的相似度。經(jīng)計(jì)算，結(jié)果顯示，各共有峰的相對保留時間RSD值小于1.2%；各共有峰的相對峰面積值的RSD值小于1.3%。應(yīng)用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012，以第一次進(jìn)樣所得UPLC指紋圖譜為參照譜計(jì)算6次進(jìn)樣所得UPLC譜圖的相似度，結(jié)果顯示，相似度均大于0.99，符合指紋圖譜分析的要求。表明供試品溶液在 25 h 內(nèi)其化學(xué)成分是穩(wěn)定的。

2.2 銀翹散指紋圖譜的建立及相似度分析

分別取27批次銀翹散按照“1.3”項(xiàng)下描述的方法制備供試品試液，按照“1.2”項(xiàng)下描述的的方法進(jìn)行UPLC指紋圖譜采集。將所得27個UPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)以AIA文件的格式導(dǎo)出，再將所導(dǎo)出的AIA文件導(dǎo)入到中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012。以1號樣品所得UPLC色譜圖為參照譜，先對所有UPLC色譜圖進(jìn)行多點(diǎn)校正，再進(jìn)行自動匹配，然后生成對照指紋圖譜，對照指紋圖譜為圖1中的R，最后進(jìn)行相似度計(jì)算。如圖2所示，27批次銀翹散在該條件下UPLC指紋圖譜有20個共有峰。各批次銀翹散樣品UPLC指紋圖譜與對照指紋圖譜比較，相似度在0.906～0.996之間。

2.3 共有峰峰面積主成分分析

應(yīng)用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)對UPLC指紋圖譜進(jìn)行相似度計(jì)算時，其著重點(diǎn)在于計(jì)算各譜圖間的相似程度。該算法中共有峰的峰面積越大，其權(quán)重也越大，那么計(jì)算出來的相似度結(jié)果很大程度上是由那些含量高的成分決定的。但是，不同廠家不同批次之間樣品質(zhì)量間存在的差異大多數(shù)時候是由一些含量不高的成分的不同而產(chǎn)生的，而這些細(xì)微的差別相似度評價系統(tǒng)就不能對其進(jìn)行很好的評估。而主成分分析則可以對各樣品間存在的細(xì)微差別進(jìn)行有效的評估。本研究應(yīng)用27批次銀翹散UPLC指紋圖譜的20個共有峰的相對峰面積數(shù)據(jù)為評價參數(shù)，應(yīng)用SPSS 23 軟件進(jìn)行主成分分析。結(jié)果顯示，累積載荷平方和取前3個主成分的話，其值為83.46%，能夠很好的反應(yīng)銀翹散20個共有峰數(shù)據(jù)的基本信息。于是，取前三個主成分做因子得分圖和因子載荷圖。27批次銀翹散所得數(shù)據(jù)的因子得分圖(圖3A)顯示，3個不同廠家的銀翹散能明顯區(qū)分開來，說明不同廠家銀翹散可能因?yàn)樵牧系漠a(chǎn)地不同，其品質(zhì)是存在差異的。因子載荷圖(圖3B)解釋了產(chǎn)生銀翹散品質(zhì)差異的原因，20個共有峰對此都有一定的貢獻(xiàn)。其中，貢較大的有離原點(diǎn)較遠(yuǎn)的共有峰4、共有峰10、共有峰11等，貢獻(xiàn)較小的是離原點(diǎn)最近的共有峰7、共有峰5等。該結(jié)果顯示，引起銀翹散品質(zhì)差異的原因主要是不同廠家產(chǎn)品中各共有峰代表的化合物在產(chǎn)品中含量的差異，該差異最可能的產(chǎn)生原因是不同廠家原材料生產(chǎn)地的不同。

2.4 共有峰峰面積聚類分析

為印證主成分分析結(jié)果的可靠性，將27批次銀翹散指紋圖譜的20個共有峰峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入到SPSS 23 軟件中，進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。分析結(jié)果顯示，與主成分分析結(jié)果相呼應(yīng)，三個不同廠家的產(chǎn)品是能夠明顯區(qū)分開來的。除此之外，聚類分析還可以得到更加詳細(xì)的組間及組內(nèi)信息。從圖4看出，廠家3和廠家1產(chǎn)品之間的相似度更高一些，而廠家2的產(chǎn)品與以上兩家產(chǎn)品之間的差異要大一些。還能看出同一廠家不同批次產(chǎn)品之間存在的細(xì)微差異，如廠家3的產(chǎn)品23號與24號之間幾乎沒有差異，而它們與19號、20號、22號產(chǎn)品之間就有一定的差異。

3 結(jié)論

本研究考察了5種不同型號的色譜柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)Agilent ZORBAX SB-C18(3.0 mm×100 mm，1.8 μm) 色譜柱的分離效能最好，能將樣品中的特征峰都洗脫出來且分離度良好，于是后續(xù)試驗(yàn)都是用該色譜柱進(jìn)行指紋圖譜采集的。

在流動相的選擇時，本研究考察了不同的流動相系統(tǒng)，最后采用了分離效能最好的0.02% 磷酸水(A)-乙腈(B)系統(tǒng)，進(jìn)行梯度洗脫。該系統(tǒng)能將樣品中所有特征峰在 24 min 內(nèi)全部洗脫出來，且基本能達(dá)到有效分離。

因銀翹散是由10味中草藥組成的中成藥，其中化學(xué)成分的復(fù)雜是不言而喻的，為了讓UPLC指紋圖譜能最大程度的反映出銀翹散中的各種化學(xué)成分，本研究應(yīng)用DAD檢測器先對樣品進(jìn)行全掃描，對比各峰在不同波長下的吸收強(qiáng)度，經(jīng)綜合比較得出在 230 nm 處，各峰都能顯示出來且能達(dá)到有效分離效果，所以最終確定UPLC指紋圖譜的采集波長為 230 nm。

在對最終采集的UPLC圖譜進(jìn)行分析的時候，本研究采用了三種方法。方法一為傳統(tǒng)的相似度法，應(yīng)用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)對所得譜圖進(jìn)行多點(diǎn)校正、自動匹配后再進(jìn)行相似度計(jì)算。結(jié)果顯示，產(chǎn)自3個廠家的27批次銀翹散相似度在0.906～0.996之間，相似度良好。該方法對于確定一個未知樣品到底是不是某一類物質(zhì)有很好的辨識度，但是對于同一類物質(zhì)之間存在的細(xì)微差異卻是無能為力的。而主成分分析結(jié)果顯示，來自不同廠家的樣品可以完全區(qū)分開來，該方法能夠?qū)⑼愇镔|(zhì)間存在的細(xì)微差異顯示出來，且還能根據(jù)載荷圖找到引起這些差異的原因，聚類分析的結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了主成分分析的結(jié)果。如此，在對中藥材進(jìn)行質(zhì)量評估的實(shí)際工作中，可以將三種分析方法結(jié)合起來，相似度法可以簡單有效的確定某一樣品到底是不是目標(biāo)物，主成分分析法和聚類分析法可以用來辨別同類物質(zhì)之間是否存在系統(tǒng)性差異。這樣就能在實(shí)際工作中有效的辨別中藥材的類別和品質(zhì)。