王安生，王祖義，鄭傳明，陳娜娜，李 偉，洪海寧,4 ，桑海威 ，王康武 ，李其才，陳力維，朱浩楠,5

(1．蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胸外科，安徽 蚌埠 233004；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院急診外科，安徽 蚌埠 233004；3.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸病科，安徽 蚌埠 233004；4.蚌埠醫(yī)學(xué)院研究生院，安徽 蚌埠 233030；5.阜陽(yáng)市人民醫(yī)院胸外科，安徽 阜陽(yáng) 236012)

肺癌作為全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其病死率一直位于腫瘤相關(guān)病死率的首位。據(jù)報(bào)道，2018年肺癌的發(fā)生率占全部惡性腫瘤的15%左右，肺癌的死亡比例占全部惡性腫瘤死亡病例的25%左右[1]。盡管靶向治療和免疫治療相關(guān)的新藥研發(fā)提高了肺癌的總體生存期(overall survival,OS)，但2012～2015年中國(guó)的肺癌患者5 a存活率仍?xún)H為19.7%，其中農(nóng)村地區(qū)患者5 a生存率僅為15.4%[2]，而預(yù)計(jì)肺癌仍會(huì)是未來(lái)10年病死率最高的腫瘤之一。有研究報(bào)道，肺癌的發(fā)生是由眾多基因的突變引起的，包括上皮生長(zhǎng)因子細(xì)胞增殖和信號(hào)傳導(dǎo)的受體基因、鼠類(lèi)肉瘤病毒癌基因、p53和磷酸酯酶與張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)基因等基因，但肺癌發(fā)生的具體機(jī)制尚不完全清楚，值得深入探討[3]。

原始干細(xì)胞或成體干細(xì)胞在體外3D環(huán)境下培養(yǎng)形成類(lèi)器官模型，是最近新興起來(lái)的體外模型，其在結(jié)構(gòu)和功能上與成體組織高度接近[4]。類(lèi)器官模型彌補(bǔ)了細(xì)胞系和小鼠品系等傳統(tǒng)模型存在細(xì)胞系細(xì)胞類(lèi)型單一和某些小鼠品系胚胎容易致死等問(wèn)題[5]。肺癌類(lèi)器官是收集患者手術(shù)切除的癌組織，然后進(jìn)行消化分離出腫瘤細(xì)胞，緊接著進(jìn)行3D細(xì)胞培養(yǎng)，使得腫瘤細(xì)胞形成“微器官”。與傳統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞系相比，該模型的優(yōu)點(diǎn)是具有更高的臨床相關(guān)性和個(gè)體多樣性。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β調(diào)節(jié)子4(transforming growth factor β regulator 4，TBRG4)是編碼轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)的調(diào)節(jié)子。近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，TBRG4的異常高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[6]，但其在肺癌中的作用尚未闡明。因此，本研究采用沉默TBRG4的慢病毒轉(zhuǎn)染人肺鱗狀細(xì)胞癌類(lèi)器官觀察TBRG4是否通過(guò)PTEN/磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)信號(hào)通路調(diào)節(jié)人肺鱗狀細(xì)胞癌類(lèi)器官增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)行為，為初步探討TBRG4基因作為治療肺鱗狀細(xì)胞癌的可能潛在靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器TBRG4沉默慢病毒購(gòu)自漢恒生物科技(上海)有限公司,細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)購(gòu)自上海貝博生物有限公司,小鼠抗β-actin抗體、兔抗增殖細(xì)胞核抗體(proliferating cell nuclear antibody,PCNA)、兔抗PTEN抗體、兔抗磷酸化PI3K (phosphorylated PI3K，p-PI3K)抗體以及兔抗磷酸化AKT(phosphorylated PI3K，p-AKT)抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，所有抗體稀釋比例均為11 000；雙面超凈操作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司,冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Beckman公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)自重慶光電儀器廠,電熱恒溫水浴鍋購(gòu)自北京醫(yī)療設(shè)備廠,低速大容量離心機(jī)購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠,小型固定轉(zhuǎn)速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)SCILOGEX公司,立式壓力蒸汽滅菌器購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠,電熱鼓風(fēng)干燥箱購(gòu)自上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠,Millipore實(shí)驗(yàn)室純水機(jī)購(gòu)自美國(guó)Pall公司,-80 ℃超低溫冰箱購(gòu)自日本三洋公司,CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司,恒溫多功能振蕩器購(gòu)自美國(guó)HRYSTAL公司,旋渦混合器購(gòu)自邯鄲天儀電子儀表有限公司,電子分析天平購(gòu)自上海精科天平廠,移液器購(gòu)自法國(guó)PIPETMAN公司,PowerPac TM Basic電泳儀電源、垂直電泳槽購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司,化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自北京天倫生物科技有限公司。

1.2 Western blot法檢測(cè)人肺鱗狀細(xì)胞癌患者癌組織和癌旁組織中TBRG4蛋白表達(dá)收集2020年1月至2021年1月蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院手術(shù)切除的早期肺鱗狀細(xì)胞癌患者癌組織和癌旁組織(距病灶>5 cm以上的正常肺組織)，置于-80 ℃ 冰箱凍存以供后續(xù)研究使用。取1 g凍存的癌組織和癌旁組織加入1 mL裂解液[苯甲基磺酰氟/RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)]，使用前加入2 μL蛋白酶抑制劑與5 μL磷酸酶抑制劑Cocktail(2×)混合，用研磨器充分研磨組織，置于冰盒上，震搖裂解約15 min后，于4 ℃下14 000×g離心15 min，用移液器吸出上清液保存于新的離心管中，將其置入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。緊接著用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度。取30 μg等量蛋白上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳分析細(xì)胞蛋白后，進(jìn)行常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜。用50 g·L-1脫脂牛奶在室溫條件下封閉膜 1 h，然后加入一抗稀釋液4 ℃ 孵育過(guò)夜。用含吐溫-20的 Tris緩沖鹽溶液(Tris-buffered saline and Tween-20，TBST)洗膜后，加入二抗稀釋液室溫孵育1 h。洗膜后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色。以β-actin作為內(nèi)參對(duì)照，應(yīng)用Image J軟件對(duì)目的蛋白的表達(dá)進(jìn)行量化。

1.3 人肺鱗狀細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞的分離及體外類(lèi)器官培養(yǎng)將收集的癌組織標(biāo)本冰上切割成直徑約4 mm的組織塊，用提前預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)沖洗干凈。然后用膠原酶消化組織1 h，用胰蛋白酶TrypLE Express在37 ℃條件下輕微振蕩消化10 min，最后形成的單細(xì)胞懸液既分離得到的腫瘤細(xì)胞。用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對(duì)單細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×107L-1，然后將細(xì)胞和基質(zhì)膠均勻混合后重懸，最后按照每孔 50 μL 細(xì)胞接種于24孔板中形成基質(zhì)膠凝固液滴，將其放置于37 ℃培養(yǎng)箱中固化10～20 min。每孔中加入500 μL肺鱗狀細(xì)胞癌類(lèi)器官條件培養(yǎng)基，使其完全淹沒(méi)基質(zhì)膠凝固液滴，最后置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。所有與獲取人肺鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本相關(guān)的實(shí)驗(yàn)程序均在蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的監(jiān)督和指導(dǎo)下完成，符合醫(yī)學(xué)倫理要求。獲取人肺鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本已獲得患者知情同意。

1.4 慢病毒轉(zhuǎn)染人肺鱗狀細(xì)胞癌類(lèi)器官將培養(yǎng)的人肺鱗狀細(xì)胞癌類(lèi)器官分為對(duì)照組和TBRG4沉默組。對(duì)照組類(lèi)器官轉(zhuǎn)染空載體慢病毒，TBRG4沉默組類(lèi)器官轉(zhuǎn)染TBRG4沉默慢病毒，具體方法為：將含有慢病毒的肺癌類(lèi)器官培養(yǎng)基與人肺鱗狀細(xì)胞癌組織單細(xì)胞懸液均勻混合，然后將其接種于48孔板中，用封口膜密封48孔板，32 ℃下2 000 r·min-1離心1 h，然后繼續(xù)培養(yǎng)6 h。最后按照“1.3”項(xiàng)所述方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行肺鱗狀細(xì)胞癌類(lèi)器官培養(yǎng)。72 h后用熒光顯微鏡觀察TBRG4在肺鱗狀細(xì)胞癌類(lèi)器官中的沉默效率，培養(yǎng)2代后即可獲得穩(wěn)定沉默目的基因的肺鱗狀細(xì)胞癌類(lèi)器官。

1.5 CCK-8法檢測(cè)人肺鱗狀細(xì)胞癌類(lèi)器官增殖活力取對(duì)照組和TBRG4沉默組類(lèi)器官消化制備單細(xì)胞懸液，按每孔1 500個(gè)細(xì)胞接種到96孔板進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)照組和TBRG4沉默組各鋪9個(gè)孔。分別在轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h時(shí)，每孔加10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度值，繪制細(xì)胞活力曲線(xiàn)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.6 Transwell法檢測(cè)人肺鱗狀細(xì)胞癌類(lèi)器官的遷移和侵襲能力取2組轉(zhuǎn)染慢病毒后的人肺鱗癌類(lèi)器官，消化制備單細(xì)胞懸液。將Transwell小室置于24孔板中。侵襲實(shí)驗(yàn)前，取50 μL(18稀釋)基質(zhì)膠鋪于小室內(nèi)，4 ℃凝固后備用。遷移實(shí)驗(yàn)無(wú)需鋪膠。收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，消化后制成3×108L-1的細(xì)胞懸液。向小室上室內(nèi)加入200 μL的細(xì)胞懸液，下室加入500 μL的含20%血清的培養(yǎng)基,將含有小室的24孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24 h。取出小室，擦去上室面未過(guò)膜細(xì)胞，甲醇固定下室面15 min，結(jié)晶紫染色后置于顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Western blot法檢測(cè)人肺鱗癌類(lèi)器官TBRG4、PCNA、PTEN、p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)取2組轉(zhuǎn)染慢病毒后的人肺鱗癌類(lèi)器官，消化制備單細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞加入RIPA裂解15 min后提取細(xì)胞蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度。取30 μg等量蛋白上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳分析細(xì)胞蛋白后，進(jìn)行常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜。50 g·L-1脫脂牛奶室溫下封閉膜1 h，然后加入TBRG4、PCNA、PTEN、p-PI3K、p-AKT一抗稀釋液4 ℃ 孵育過(guò)夜。用TBST緩沖液洗膜后，加入二抗稀釋液室溫孵育1 h。洗膜后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色。以β-actin作為內(nèi)參對(duì)照，應(yīng)用Image J軟件對(duì)目的蛋白進(jìn)行量化，分析其表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 肺鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁組織中TBRG4蛋白表達(dá)比較結(jié)果見(jiàn)圖1。肺鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁組織中TBRG4蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.98±0.04、0.50±0.12，肺鱗狀細(xì)胞癌組織中TBRG4蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.120，P<0.05)。

圖1 肺鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁組織中TBRG4蛋白的表達(dá)

2.2 對(duì)照組和TBRG4 沉默組人肺鱗狀細(xì)胞癌類(lèi)器官增殖活力比較結(jié)果見(jiàn)表1。 TBRG4沉默組人肺鱗狀細(xì)胞癌類(lèi)器官在轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h時(shí)的增殖活力均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 對(duì)照組和TBRG4 沉默組人肺鱗狀細(xì)胞癌類(lèi)器官增殖活力比較

2.3 對(duì)照組與TBRG4沉默組人肺鱗狀細(xì)胞癌類(lèi)器官的遷移和侵襲能力比較結(jié)果見(jiàn)圖2。TBRG4沉默組、對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(46.73±8.26)、(148.72±11.90)個(gè)，遷移細(xì)胞數(shù)分別為(38.64±7.92)、(178.53±10.87)個(gè)；TBRG4沉默組穿膜細(xì)胞和遷移細(xì)胞數(shù)均顯著少于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-8.220、-10.518，P<0.05)。

圖2 2組人肺鱗狀細(xì)胞癌類(lèi)器官的侵襲和遷移情況

2.4 對(duì)照組和TBRG4沉默組人肺鱗狀細(xì)胞癌類(lèi)器官中TBRG4和PCNA蛋白表達(dá)的比較結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。TBRG4沉默組和對(duì)照組人肺鱗狀細(xì)胞癌類(lèi)器官中TBRG4蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.16±0.12、0.63±0.02，PCNA蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.530±0.243、1.390±0.560；TBRG4沉默組人肺鱗狀細(xì)胞癌類(lèi)器官中TBRG4、PCNA蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.214、-4.324，P<0.05)。

圖3 對(duì)照組和TBRG4沉默組人肺鱗狀細(xì)胞癌類(lèi)器官中TBRG4蛋白的表達(dá)

圖4 對(duì)照組和TBRG4沉默組人肺鱗狀細(xì)胞癌類(lèi)器官中PCNA蛋白的表達(dá)

2.5 對(duì)照組與TBRG4沉默組人肺鱗狀細(xì)胞癌類(lèi)器官中 PTEN、p-PI3K、p-AKT相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見(jiàn)表2和圖5。TBRG4沉默組人肺鱗狀細(xì)胞癌類(lèi)器官中PTEN蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，p-PI3K、p-AKT蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 對(duì)照組和TBRG4沉默組人肺鱗狀細(xì)胞癌類(lèi)器官中PTEN、p-PI3K、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 討論

使用靶向藥物治療肺癌可以提高部分臨床患者的生存率[7]，但耐藥性和藥物不良反應(yīng)的存在仍然限制了其使用，患者的生存率仍較低，不超過(guò)15%[8]?；诖耍钊胙芯糠伟┌l(fā)生發(fā)展的新機(jī)制和關(guān)鍵分子具有重要意義。小干擾RNA沉默技術(shù)是一種主要通過(guò)外源性小分子干擾RNA或內(nèi)源性小分子RNA沉默靶基因的調(diào)控方法[9]。慢病毒載體具有低免疫原性，能轉(zhuǎn)染細(xì)胞并將攜帶的外源基因片段整合到宿主基因組中，因此，在基因工程中得到廣泛應(yīng)用[10-11]。

TBRG4是位于7號(hào)染色體上可以編碼TGF-β調(diào)節(jié)子的基因。有研究報(bào)道，TBRG4不僅可以參與細(xì)胞周期調(diào)控，還可以維持細(xì)胞的穩(wěn)定性[12]。張偉[13]研究表明，TBRG4可能通過(guò)調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體mRNA的穩(wěn)定性和細(xì)胞周期蛋白CLN1和CLN2的轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。此外，TBRG4蛋白在多發(fā)性骨髓瘤患者髓外腫瘤組織[14]、原代乳腺癌細(xì)胞中[15]異常高表達(dá)，且其表達(dá)水平與乳腺癌的惡性程度呈正相關(guān)[15]。目前，成體組織來(lái)源的干細(xì)胞培養(yǎng)的類(lèi)器官發(fā)展較為迅速，正逐漸成為研究疾病發(fā)生發(fā)展的良好模型?；诖耍狙芯坎捎贸聊琓BRG4基因的慢病毒對(duì)人肺鱗狀細(xì)胞癌類(lèi)器官進(jìn)行特異性干擾，以期探索TBRG4對(duì)肺癌生物學(xué)行為的影響。本研究結(jié)果顯示，沉默TBRG4基因能夠抑制人肺鱗狀細(xì)胞癌類(lèi)器官的增殖，這表明TBRG4可以在體外抑制肺癌增殖；此外，沉默TBRG4基因還能夠抑制人肺鱗狀細(xì)胞癌類(lèi)器官的侵襲和遷移能力。

PTEN具有脂質(zhì)和蛋白的雙重特異性磷酸酶活性，是繼p53之后第2個(gè)被發(fā)現(xiàn)的抑癌基因。PTEN發(fā)揮作用的主要方式是調(diào)控多種信號(hào)通路，以此達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、黏附，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化、凋亡等目的[16]。研究發(fā)現(xiàn)，PTEN低表達(dá)是促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的原因[17-18]。本研究結(jié)果表明，TBRG4基因敲低可能通過(guò)激活人肺鱗狀細(xì)胞癌類(lèi)器官中PTEN的表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)p-PI3K、p-AKT等下游基因的表達(dá)，從而發(fā)揮抑制人肺鱗狀細(xì)胞癌類(lèi)器官增殖、侵襲和遷移的作用。

綜上所述，TBRG4可能成為肺癌的潛在治療靶點(diǎn)，在調(diào)節(jié)肺癌的增殖、侵襲和遷移等方面發(fā)揮重要的作用，但其具體調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。