林媚， 何風杰， 徐小菊， 馮先桔， 王天玉， 姚周麟

(1.浙江省柑橘研究所，浙江 臺州 318026； 2.臺州市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江 臺州 318000；3.溫嶺市農(nóng)業(yè)農(nóng)村和水利局，浙江 臺州 317500)

葡萄為我國的主產(chǎn)水果之一，味美可口，營養(yǎng)豐富，深受消費者喜愛。2016年全國葡萄總產(chǎn)量達1 374.5×104t，較2000年增加4.2倍[1]。我國的葡萄品種豐富，以歐美葡萄(巨峰、夏黑等)和歐亞葡萄(紅地球、無核白、玫瑰香、維多利亞等)占比最多，近幾年，一些新品種(陽光玫瑰、金手指等)也獲得大面積發(fā)展[2]。2018年浙江溫嶺葡萄種植面積達4 000 hm2，主栽品種為維多利亞，因該品種比較古老，同時生產(chǎn)過程中存在農(nóng)戶片面追求產(chǎn)量、栽培措施不到位等問題，導致葡萄品質(zhì)下降，價格下滑，效益不佳。為改變現(xiàn)狀，適應(yīng)市場的需求，通過引種新品種晨香進行結(jié)構(gòu)調(diào)整，以提高農(nóng)民收益[3]。

果樹生產(chǎn)過程中有機肥的應(yīng)用較多，有機肥具有肥效長、補充土壤肥力等優(yōu)點[4]。近年有關(guān)施用有機肥對葡萄產(chǎn)量和品質(zhì)影響的相關(guān)研究較多[5-7]，合理施用有機肥有助于提高葡萄的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前生產(chǎn)上應(yīng)用的有機肥來源廣泛，種類很多，常用的有羊糞、豬糞、雞糞、碳基生物肥、菜餅肥、生物菌肥、腐殖酸等，也有一些新型的有機復(fù)混肥在不斷開發(fā)應(yīng)用[8]。魚肥是一種由菜餅肥、谷殼及魚罐頭深加工的固廢物按一定比例配制后腐熟而成的有機肥，目前在臺州沿海各地逐步推廣應(yīng)用，在改土提質(zhì)上效果明顯。

果實品質(zhì)是決定市場競爭力的重要因素。關(guān)于葡萄的品質(zhì)研究主要為單粒重、穗重、可溶性固形物、總酸和維生素等[9]，還有少數(shù)關(guān)于葡萄果實中氨基酸含量方面的研究報道[10-11]。氨基酸作為營養(yǎng)物質(zhì)被人體吸收利用，是葡萄品質(zhì)的重要組成部分，同時參與果實其他組分的形成及風味物質(zhì)的合成[12]，其存在形式主要以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)2種形式[13]。結(jié)合態(tài)氨基酸在食用過程中不能立即水解，對滋味影響不大；游離氨基酸是一類重要的味道活性成分[14-15]，可呈現(xiàn)各種獨特的滋味，其含量會直接影響風味[16-18]。同時，果實中氨基酸的含量和種類對果實品質(zhì)有重要影響，可作為評價果實品質(zhì)的重要指標。因此，葡萄中的氨基酸特別是呈味氨基酸對果實的滋味具有重要貢獻[19]。同時，葡萄中氨基酸的含量會受品種、氣候、種植條件等因素的影響。因此，研究氨基酸組分含量對提高葡萄品質(zhì)具有重要意義[20]。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以當?shù)貍鹘y(tǒng)葡萄品種維多利亞和新引種的3年生貝達砧的晨香葡萄為供試品種。試驗于2020年在溫嶺市陳菊蓮家庭農(nóng)場進行，亞熱帶季風氣候，四季分明，氣候溫和，溫濕適中，雨量充沛，光照適宜，無霜期約250 d。土壤pH 5.82，為自培土(土壤∶有機質(zhì)∶有機物1∶1∶1)。采用鋼架大棚、寬行起壟，H形架式種植，株行距為3.4 m×3.0 m，南北行向。采用雙頂膜覆蓋促早栽培，覆膜時間為2019年12月20日。

復(fù)合肥含N 15%、P2O515%、K2O 15%(湖北三寧化工)；魚肥為溫嶺本地自產(chǎn)，以水產(chǎn)品深加工中無法收回的魚肉等雜質(zhì)為主要原料，與谷殼或蘑菇泥等生物質(zhì)混合，在其中添加生物菌種，經(jīng)過10 d左右的高溫發(fā)酵而成。

儀器與試劑：RIGOL L3000高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技)；C18-H(250 mm×4.6 mm，5 μm；賽分Amethyst)；Thermo Micro CL 17R高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技)；KQ2200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；PAL-1數(shù)字手持折糖儀(日本愛拓公司)；AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；AR1502CN電子天平(奧豪斯儀器有限公司)；旋渦混合器MS3(德國IKA公司)。

天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、絲氨酸(Ser)、組氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、蘇氨酸(Thr)、精氨酸(Arg)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、胱氨酸(Cys)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、賴氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)和脯氨酸(Pro)共18種氨基酸標準品(Sigma，純度≥99.9%)；HPLC級乙腈(J&K CHEMICAL LTD，純度≥99.9%)；正亮氨酸，三乙胺(國藥集團化學試劑有限公司，純度≥99.0%，優(yōu)級純)；異硫氰酸苯酯(Sigma，純度≥99.9%)；正己烷(國藥集團化學試劑有限公司，純度≥97.0%，優(yōu)級純)；無水乙酸鈉(國藥集團化學試劑有限公司，純度≥99%，優(yōu)級純)；鹽酸(國藥集團化學試劑有限公司，36.0%～38.0%，優(yōu)級純)；冰醋酸(生工，純度≥98%)。

1.2 處理設(shè)計

以正常施用的復(fù)合肥為對照(CK)，以增施當?shù)厣a(chǎn)的魚肥為處理，對維多利亞和晨香成熟果實的品質(zhì)指標及游離氨基酸各組分含量進行檢測分析，再結(jié)合味道強度值(taste active value，TAV)分析各組分對風味的影響，最終對施肥前后葡萄果實各指標的變化進行綜合評估。

1.3 檢測項目與方法

1.3.1 理化品質(zhì)指標

隨機選取100粒果實用于測定果粒質(zhì)量，以及可溶性固形物(TSS)和可滴定酸(TA)含量，重復(fù)3次。果粒質(zhì)量采用電子天平測量；TSS含量用數(shù)顯手持糖度計測量；TA含量使用酸堿滴定法測定；固酸比為TSS與TA的比值。

1.3.2 游離氨基酸

參考衛(wèi)陽飛等[21]的方法，略作改進。隨機稱取葡萄樣品約300 g，去除果皮和種子，將果肉勻漿，取適量果汁離心，取上清液200 μL，分別置于2 mL EP管中，每個離心管中準確加入正亮氨酸內(nèi)標液20 μL；再依次向每個EP管中加入三乙胺乙腈溶液100 μL(確保pH>7)和異硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL，混勻后于25 ℃下放置1 h，然后加入正己烷400 μL至每個EP管中，搖晃后放置10 min，取下層溶液，采用0.22 μm針式過濾器過濾后上機檢測。

分離柱為賽分Amethyst C18-H(250 mm×4.6 mm，5 μm)，紫外檢測器波長254 nm，柱溫40 ℃，流速1 mL·min-1，進樣體積10 μL。洗脫液A為乙酸鈉-乙腈溶液，B為80%乙腈水溶液，采用梯度洗脫，根據(jù)外標和保留時間進行氨基酸定性和定量測定，每樣品重復(fù)測定3次，取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，使用Duncan’s法進行差異顯著性分析(P<0.05)，采用Excel 2017軟件制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚肥對葡萄果實品質(zhì)的影響

由表1可見，施用魚肥后，2種葡萄的單粒重均有顯著降低，晨香和維多利亞分別較CK下降4.81%和5.79%；晨香和維多利亞的可溶性固形物含量(TSS)顯著高于CK，分別較CK增加12.27%和32.67%；可滴定酸(TA)含量在2個品種上表現(xiàn)不一致，施用魚肥后，晨香的TA含量顯著低于CK，而維多利亞的TA含量與CK差異不顯著。

表1 施用魚肥對葡萄果實品質(zhì)的影響

生產(chǎn)上常以固酸比作為果實風味的評價指標。施用魚肥后，晨香和維多利亞的固酸比均顯著高于CK，分別提高51.93%和22.22%。綜合來看，雖然施魚肥后果實單粒重有所降低，但TSS含量和固酸比顯著提高，果實口味等綜合品質(zhì)得到顯著提升。

2.2 魚肥對葡萄果實游離氨基酸的影響

表2顯示了2種葡萄果實的18種游離氨基酸(FAA)組分檢測結(jié)果，包括8種必需氨基酸(EAA)、2種半必需氨基酸(CEAA)和8種非必需氨基酸(NEAA)。藥效氨基酸(MAA)則是通過氨基酸具有藥用功效進行分類[22]。由表可見，施用魚肥前2種葡萄的總游離氨基酸(TFAA)含量整體較低，而施肥后TFAA的含量均顯著增加，晨香和維多利亞果實的TFAA含量分別較CK增加116.49%和220.15%。NEAA、CEAA、MAA含量均表現(xiàn)為施用魚肥后顯著增加，其中，晨香葡萄分別較CK增加41.07%、306.99%、190.38%，維多利亞則分別增加79.42%、376.60%、314.61%，且2個品種均以CEAA增幅最大，MAA次之。2種葡萄的必需氨基酸(EAA)含量很低，且試驗效果不一致，晨香顯著降低，維多利亞顯著增加。

表2 魚肥對葡萄中游離氨基酸組分含量的影響 單位：mg·L-1

比較EAA、NEAA、CEAA及MAA在TFAA中的比例顯示，2種葡萄在施肥前后的EAA/TFAA、NEAA/TFAA均顯著下降，盡管2個品種的NEAA值較CK顯著增加，但由于施用魚肥的TFAA較CK增幅更大，造成NEAA/TFAA最終較CK下降；CEAA/TFAA和MAA/TFAA均顯著增加，其中，晨香較CK分別增加29.73和18.01百分點，維多利亞分別增加23.33和17.19百分點。由上可知，增施魚肥后，2個葡萄品種的TFAA、NEAA、CEAA、MAA以及CEAA/TFAA、MAA/TFAA均為增加。

2.3 果實游離氨基酸各組分含量的比較

由表2可見，晨香葡萄CK果實的18種FAA各組分含量排序為Arg>Ala>Glu>His>Ser>Pro>Asp>Thr>Ile>Phe>Leu>Val>Tyr>Trp>Met>Lys>Gly>Cys，含量最高Arg為150.05 mg·L-1，相對較高的為Ala和Glu，分別為54.81和46.19 mg·L-1，Thr、Asp、Pro、Ser、His幾種含量為39.21～44.46 mg·L-1，其余均處于較低或極低水平；而該品種對應(yīng)的處理果的游離氨基酸各組分含量排序為Arg>Pro>Ala>Asp>Thr>Ser>Glu>His>Ile>Val>Leu>Phe>Tyr>Gly>Trp>Lys>Cys>Met，最高為Arg，達766.45 mg·L-1，較對照增加410.80%，Arg/TFAA為61.48%，第二和第三的為Pro和Ala，分別較對照增加268.10%和32.37%。維多利亞葡萄中，CK果實游離氨基酸各組分含量排序為Arg>Pro>Ala>Asp>Ile>Thr>His>Ser>Phe>Val>Leu>Glu>Gly>Tyr>Trp>Cys>Lys>Met，而其處理果含量排序為Arg>Ala>Pro>Ser>Thr>Asp>His>Ile>Phe>Val>Leu>Glu>Tyr>Gly>Trp>Lys>Met>Cys，其中Arg、Ala和Pro分別較對照增加401.54%、97.28%、46.24%，且處理果中Arg/TFAA高達68.89%。另外，維多利亞葡萄處理果中含量相對較高的還有Ser，較對照果增加269.10%?？傊?種葡萄的FAA組分以Arg為主，其次為Pro和Ala，均較CK顯著增加。

2.4 不同呈味氨基酸的比較分析

葡萄中檢測出的18種FAA均為呈味氨基酸，根據(jù)其呈味特點分為4類，主要為鮮味氨基酸(delicious amino acid，DAA)、甜味氨基酸(sweet amino acid，SAA)、苦味氨基酸(bitter amino acid，BAA)和芳香族氨基酸(Aromatic amino acid，AAA)[22]。其中，DAA包括Glu、Asp、Lys，SAA包括Thr、His、Ser、Pro、Gly、Ala，BAA包括Val、Met、Leu、Ile、Arg、Trp，AAA包括Cys、Tyr、Phe。

由圖1可見，無論是試驗還是CK，2種葡萄各呈味氨基酸組分含量由高到低的排序為BAA>SAA>DAA>AAA，且2種葡萄增施魚肥處理均以BAA增幅為最大，晨香和維多利亞分別較CK增加268.26%和335.11%。同時，SAA也較CK有明顯增加，晨香和維多利亞葡萄分別較CK增加43.94%和104.40%。DAA在2種葡萄處理中含量均較低，且變化趨勢不一致。其中，晨香處理較CK減少，而維多利亞則略有增加。AAA在2種葡萄呈味氨基酸中含量均為最低，最大值為晨香葡萄的CK，其變化趨勢與DAA一致。

圖1 葡萄各呈味氨基酸的比較

2.5 不同呈味氨基酸的TAV值比較

由于各類呈味氨基酸的味覺閾值不同，意味著當某種氨基酸含量較高時，對果實的風味不一定產(chǎn)生影響，故采用TAV值進行判定，每種呈味氨基酸的TAV值為其含量測定值與對應(yīng)味覺閾值的比值。一般情況下，當TAV>1時，表示該物質(zhì)對樣品的呈味有影響，數(shù)值越大影響越大；當TAV<1時，則該物質(zhì)對呈味貢獻不大[23]。

對比2種葡萄的試驗果和CK果中18種FAA TAV值與其味覺閾值，由表3可見，各呈味氨基酸的TAV值均較小，只有晨香和維多利亞試驗果中呈苦味的Arg的TAV值分別為1.53和1.94，表示該類氨基酸對葡萄的呈味有影響，其余各氨基酸組分對呈味的影響不大。

表3 葡萄游離氨基酸的TAV值

3 小結(jié)與討論

葡萄生產(chǎn)中大量化肥的不當使用及大棚設(shè)施栽培等會帶來果實品質(zhì)下降和土壤板結(jié)、養(yǎng)分失調(diào)、酸化、鹽漬化等諸多問題[24]，為此，近年出現(xiàn)不少關(guān)于施用有機肥對葡萄產(chǎn)量和品質(zhì)影響的相關(guān)研究報道。韓建等[5]認為，有機肥可顯著增加葡萄的產(chǎn)量和品質(zhì)，且隨著施用年份的增加，有機肥對葡萄產(chǎn)量和品質(zhì)的提升趨勢會越來越明顯；陳青英等[6]開展施用不同有機肥對土壤特性及紅地球葡萄生長和品質(zhì)的影響，試驗表明，冬季基肥中增施不同的有機肥，可提高果實品質(zhì)，其中以施用菜餅肥的果實綜合品質(zhì)最高；范曉暉等[7]研究認為，減施化肥、增施有機肥不僅使得葡萄產(chǎn)量和品質(zhì)得到提高，還能有效減少土壤大量元素的累積。這些關(guān)于葡萄施用有機肥的研究結(jié)果基本認為有機肥的合理施用會有效增加土壤有機質(zhì)含量，緩解土壤板結(jié)及酸化，改善土壤微生態(tài)環(huán)境，提高肥料的利用率，使得果園土壤養(yǎng)分更加豐富，有助于提高葡萄的產(chǎn)量和品質(zhì)。本研究選擇當?shù)赜写硇缘木S多利亞葡萄和新引種的晨香葡萄2個品種，研究冬季基肥施入本地生產(chǎn)的魚肥對葡萄品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，2個品種的單粒果重均有所下降，但品質(zhì)指標中可溶性固形物含量分別增加12.27%和32.67%，固酸比分別增加51.93%和22.22%，且差異顯著，綜合理化品質(zhì)明顯提高。

游離氨基酸作為人體維生素E、葉酸等營養(yǎng)素的良好來源[25]，也是果實中重要營養(yǎng)物質(zhì)和相關(guān)風味物質(zhì)的合成前體[26]，葡萄中氨基酸含量占總氮量的30%～40%[27]，游離氨基酸特別是呈味氨基酸對果實的滋味具有重要貢獻[19]。本試驗中，晨香和維多利亞葡萄對照果的總游離氨基酸含量分別為575.81和439.24 mg·L-1，低于黃艷[28]研究的3個葡萄品種中含量最低的紅玫瑰葡萄；而施用魚肥后總游離氨基酸分別達到1 246.57和1 406.24 mg·L-1，較對照增加116.49%和220.15%，說明可通過施肥的改變調(diào)控葡萄中游離氨基酸含量。Jogaiah等[29]研究認為，Arg和Pro是所有鮮食和釀酒葡萄中的主要氨基酸，Bell等[30]也認為，Arg是葡萄中的含量最高氨基酸，其次是Pro和Leu，且Arg是氮的主要儲存形式。本研究的結(jié)果為2種葡萄的試驗果及CK果的Arg為各組分氨基酸中含量最高，且2種葡萄經(jīng)施魚肥后Arg大幅增加，分別為18種游離氨基酸總量的61.48%和68.89%。同時，含量相對較高的還有Pro和Ala，該研究結(jié)果與前人結(jié)論[29-30]相一致。對于游離氨基酸對食品風味的影響，目前較多采用TAV值進行判斷[22,31-32]。本研究結(jié)果顯示，只有晨香和維多利亞試驗果中呈苦味的Arg的TAV值>1，說明其對葡萄的風味有貢獻。作為兒童必需氨基酸的Arg呈苦味，有助于增加呈味復(fù)雜性和提高鮮度[28,32]。另外，對柑橘中的苦味物質(zhì)風味的相關(guān)研究[33-34]表明，少量苦味能賦予特定的風味，使果汁風味品質(zhì)更好。基于上述研究理論，結(jié)合Arg的呈味特點及其對葡萄的風味影響，可以解釋在對這2種葡萄進行口感評價時，增施魚肥的試驗果除了較對照糖度高外，還會略帶鮮味，且口感風味更好。

本研究結(jié)果表明，施用魚肥可以顯著提高晨香和維多利亞葡萄的可溶性固形物含量、固酸比、游離氨基酸總量，以及精氨酸、脯氨酸等組分，其中試驗果的精氨酸對果實風味有貢獻，使果實綜合品質(zhì)得以提高，風味更好，值得在沿海地區(qū)推廣應(yīng)用。