朱 瀛 解茹越 張合虎 高 冰 劉 賢 韓魯佳

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院， 北京 100083)

0 引言

肉骨粉是對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物屠宰場(chǎng)、肉品加工廠產(chǎn)生的新鮮無(wú)變質(zhì)動(dòng)物骨骼及廢棄組織經(jīng)高溫高壓蒸煮、滅菌、脫膠、干燥粉碎后的一種重要的動(dòng)物蛋白產(chǎn)品，其粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般在40%～60%，氨基酸組分相對(duì)比較平衡，但品質(zhì)變異較大。瘋牛病，又稱為牛海綿狀腦病(Bovine Spongiform Encephalopathy，BSE)，屬一類人畜共患傳染病。科學(xué)研究表明，瘋牛病的引發(fā)和傳播是因食用攜帶朊病毒的牛羊源類動(dòng)物肉骨粉所致，自1985年英國(guó)首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)，受到瘋牛病牽連的國(guó)家多達(dá)100多個(gè)，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失和社會(huì)恐慌[1]。鑒于此，世界各國(guó)均嚴(yán)格禁止在反芻類動(dòng)物飼料中添加肉骨粉[2-4]。因此，飼料中肉骨粉的檢測(cè)方法學(xué)研究一直是世界各國(guó)飼料安全領(lǐng)域的重點(diǎn)任務(wù)之一。

目前，肉骨粉的檢測(cè)方法主要有：顯微鏡法[5]、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法[6]和近紅外光譜分析(NIRS)法等[7-11]，其中顯微鏡法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)在1998年由歐盟頒布實(shí)施并持續(xù)改進(jìn)至今，一直被用作確證檢測(cè)，應(yīng)用十分廣泛。肉骨粉顯微鏡檢測(cè)方法的基本原理是基于陸生和水生等不同來(lái)源肉骨粉顆粒腔隙等微觀結(jié)構(gòu)形態(tài)特征的不同進(jìn)行人工顯微鏡觀察和判別，其突出優(yōu)勢(shì)是檢測(cè)精度高，但肉骨粉顯微鏡檢測(cè)時(shí)待測(cè)樣品需經(jīng)嚴(yán)格干燥、粉碎、篩分、沉淀和懸浮物提取、染色、玻片制備等復(fù)雜、耗時(shí)的前處理，且顯微鏡肉眼觀察高度依賴檢測(cè)人員的專業(yè)技能水平。

顯微X射線計(jì)算機(jī)斷層成像(X-ray micro-computed tomography，Micro-CT)是一種先進(jìn)的、非破壞性的3D成像技術(shù)，其成像原理是微焦點(diǎn)X射線球管發(fā)出的錐形X射線束透過(guò)樣本時(shí)，樣本各部位密度差異導(dǎo)致對(duì)X-射線吸收率不同從而在X-射線檢測(cè)器上呈現(xiàn)出不同的結(jié)構(gòu)信息，對(duì)樣本進(jìn)行360°成像后通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件將每個(gè)角度的圖像進(jìn)行重構(gòu)還原成計(jì)算機(jī)可分析的3D圖像。與普通CT不同，Micro-CT空間分辨率極高，通常達(dá)到微米級(jí)，因而具有良好的“顯微”效果。 Micro-CT在無(wú)需對(duì)樣本進(jìn)行破壞性預(yù)處理的情況下，原位、三維可視化地表征樣本的內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)，已在醫(yī)學(xué)[12-14]、地質(zhì)[15-18]、材料[19-21]和農(nóng)業(yè)[22-25]等多個(gè)領(lǐng)域得到研究與應(yīng)用。

研究表明，Micro-CT的X射線被吸收的總量取決于它穿透物質(zhì)的密度、原子組成以及X射線束的光能頻譜，在X射線能量一定的情況下，密度大的物質(zhì)對(duì)射線的衰減更大[26-28]。骨與骨腔隙因構(gòu)成不同存在一定的密度差異，骨與其腔隙Micro-CT的X射線吸收或衰減也會(huì)有所不同，理論而言，使用Micro-CT進(jìn)行肉骨粉骨顆粒微觀形貌的分析是可行的。然而，骨顆粒腔隙通常會(huì)附著一些脂肪、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，這些物質(zhì)的密度介于骨與骨腔隙之間，因此在使用Micro-CT進(jìn)行分析時(shí)，需輔以機(jī)器學(xué)習(xí)算法進(jìn)行圖像閾值分割處理才能準(zhǔn)確獲取骨顆粒內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)特征信息。

為了探究使用Micro-CT原位、三維、可視化表征肉骨粉中骨顆粒顯微結(jié)構(gòu)特征信息的可行性，本文以水生(魚骨)和陸生(牛、豬、雞)動(dòng)物源骨顆粒為對(duì)象，開(kāi)展基于Micro-CT的水生和陸生動(dòng)物源肉骨粉顆粒的顯微結(jié)構(gòu)分析研究，以期為建立飼料中不同動(dòng)物源成分的快速分析方法提供技術(shù)支撐。

1 表征方法

1.1 不同動(dòng)物源肉骨粉及其骨顆粒樣品

研究所用不同動(dòng)物源肉骨粉源于筆者所在實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物源飼料樣品庫(kù)，樣品均為避光密封4℃恒溫保存。其中，魚粉、牛骨粉、豬骨粉和雞骨粉分別采自黑龍江省、山東省、江蘇省和河北省相關(guān)企業(yè)。

從上述每種肉骨粉樣品中分別隨機(jī)選取10個(gè)骨顆粒用于Micro-CT掃描和重構(gòu)條件優(yōu)化，隨后再?gòu)闹懈麟S機(jī)選取3個(gè)骨顆粒用于圖像分割方法的比較和原位三維可視化和斷層結(jié)構(gòu)表征。

1.2 分析儀器

德國(guó)徠卡公司DM 2500型生物顯微鏡，配備DFC420C型CCD攝像頭和Leica Application Suite V3.30專用圖像分析軟件。

比利時(shí)Bruker公司Skyscan 1275型Micro-CT，電壓范圍20～100 kV，最大功率為10 W，360°掃描，空間分辨率6～50 μm，配置3MP(1 944像素×1 536像素)有源像素平板探測(cè)器。

1.3 不同動(dòng)物源肉骨粉樣品的顯微鏡分析

按照飼料中動(dòng)物源性成分檢測(cè)顯微鏡法[29]，對(duì)不同動(dòng)物源肉骨粉樣品進(jìn)行沉淀、脫脂、染色、風(fēng)干、制片預(yù)處理，然后顯微鏡觀察，獲取不同動(dòng)物源骨顆粒樣品的顯微鏡圖譜，用作不同種屬肉骨粉骨顆粒樣品顯微結(jié)構(gòu)基準(zhǔn)。

1.4 基于Micro-CT的不同動(dòng)物源肉骨粉骨顆粒顯微結(jié)構(gòu)的原位、三維可視化表征方法

1.4.1Micro-CT掃描條件優(yōu)化

使用Bruker Skyscan 1275型Micro-CT，對(duì)上述不同動(dòng)物源肉骨粉樣品進(jìn)行掃描。掃描前，無(wú)需任何預(yù)處理，直接用石蠟將樣品固定在儀器圓形載物臺(tái)上，避免掃描過(guò)程中晃動(dòng)。

鑒于電壓和電流是影響掃描圖像質(zhì)量的重要因素，將顆粒樣品分別在50 kV/200 μA、80 kV/125 μA和100 kV/100 μA的條件下進(jìn)行掃描，根據(jù)掃描時(shí)X射線透過(guò)率的最大、最小和平均值，確定最優(yōu)掃描電壓和電流為80 kV、125 μA。

1.4.2Micro-CT數(shù)據(jù)采集及數(shù)據(jù)去噪

Micro-CT數(shù)據(jù)采集采用360°掃描、圖像分辨率8 μm、旋轉(zhuǎn)步長(zhǎng)0.20°、圖像2幀取平均(即掃描過(guò)程中樣品每旋轉(zhuǎn)0.20°獲取2幀圖像取平均計(jì)算)、曝光時(shí)間46 ms。

通過(guò)調(diào)整軟件Ring-Artifacts值(分別設(shè)置為1、2、3、4和5后進(jìn)行圖像預(yù)覽)進(jìn)行環(huán)形偽影消除，使用軟件Beam-hardening Artifacts進(jìn)行杯狀偽影校正(分別設(shè)置為10%、20%、30%、40%和50%后進(jìn)行圖像預(yù)覽)。調(diào)整軟件Smoothing值(分別設(shè)定為0、1、2、3和4后預(yù)覽圖像)和Post-Alignment值(分別設(shè)定為-1.0、-0.5、0、0.5和1.0后預(yù)覽圖像)以減少掃描過(guò)程中樣品輕微晃動(dòng)可能導(dǎo)致的重構(gòu)圖像出現(xiàn)偏差。通過(guò)預(yù)覽比較獲取的圖像效果，Micro-CT圖像重構(gòu)條件確定為：Ring-Artifacts 3，Beam-hardening 30%，Smoothing 1和Post-Alignment 0。

1.4.3Micro-CT圖像三維重構(gòu)算法

使用Skyscan NRecon軟件(Bruker Skyscan,比利時(shí))對(duì)Micro-CT圖像進(jìn)行三維重構(gòu)。所有樣品圖像均在X射線吸收系數(shù)為0～0.062的范圍內(nèi)進(jìn)行重構(gòu)，得到的灰階為0到255的8位BMP圖像。

分別采用簡(jiǎn)單全局分割法(Global)[30-31]、自適應(yīng)全局分割法(Otsu)[32]、K-means全局聚類分割法(K-means)以及局部均值自適應(yīng)均值分割法(Adaptive mean-C)和局部中值自適應(yīng)分割法(Adaptive median-C)[33]進(jìn)行圖像分割與參數(shù)優(yōu)化。

經(jīng)預(yù)試驗(yàn)，采用Global計(jì)算時(shí)，將樣品所有重構(gòu)圖像(80幅)閾值統(tǒng)一設(shè)定為100進(jìn)行二值化處理；Otsu算法則據(jù)每幅圖像分別進(jìn)行計(jì)算自動(dòng)獲取閾值，閾值變化范圍為94～103。

使用Matlab 2019軟件中的自適應(yīng)閾值(Adaptive threshold)函數(shù)對(duì)樣品圖像進(jìn)行計(jì)算。采用控制變量法對(duì)自適應(yīng)分割法函數(shù)中的局部運(yùn)算區(qū)域(WS)和修正值(C)的選取進(jìn)行優(yōu)化，具體如下：固定WS為5，分別設(shè)定C為-2、-1、0、1、2對(duì)各樣品重構(gòu)后的圖像進(jìn)行處理，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，同理固定C為0，分別設(shè)定WS為1、3、5、7、9對(duì)圖像進(jìn)行處理并分析。

1.4.4骨顆粒顯微結(jié)構(gòu)原位可視化

采用優(yōu)化后的閾值分割參數(shù)對(duì)各樣品重構(gòu)圖像進(jìn)行二值化處理，將獲取的二值化圖像導(dǎo)入CT Vox軟件和DataViewer軟件中，分別獲取三維顯微結(jié)構(gòu)圖像和顯微斷層結(jié)構(gòu)圖像。圖像中骨結(jié)構(gòu)渲染為紅色、腔隙結(jié)構(gòu)渲染為黑色。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同動(dòng)物源肉骨粉的顯微鏡圖譜

經(jīng)顯微鏡檢測(cè)獲得的不同種屬肉骨粉骨顆粒顯微鏡圖像如圖1所示。

圖1 不同動(dòng)物源骨顆粒顯微鏡檢測(cè)成像結(jié)果Fig.1 Microscopic imaging results of bone particles from different animals

由圖1可以看出，魚骨顆粒呈細(xì)長(zhǎng)管狀，邊角銳利，黑色骨腔隙呈細(xì)長(zhǎng)型分布于骨顆粒中間。牛骨、豬骨、雞骨顆粒為不規(guī)則多邊體，黑色腔隙呈橢圓形。由此可知，魚骨與牛骨、豬骨和雞骨在整體輪廓和骨腔隙形狀上有明顯差異，這也是可通過(guò)顯微鏡檢測(cè)的方法進(jìn)行水生和陸生動(dòng)物源肉骨粉判別的主要依據(jù)。

2.2 基于不同圖像閾值分割方法的Micro-CT圖像比較

圖2為經(jīng)不同閾值分割方法處理不同動(dòng)物源骨顆粒樣品的Micro-CT斷層成像變化，其中Global法閾值設(shè)定為100，Otsu法閾值根據(jù)每幅圖像自動(dòng)獲取，Adaptive median-C法預(yù)設(shè)WS為5、C為0，K-means法設(shè)置分類數(shù)為3。

圖2 經(jīng)不同閾值分割算法處理不同動(dòng)物源骨顆粒的Micro-CT斷層圖像Fig.2 Micro-CT tomographies of different bone particles processed by different threshold segmentation algorithms

由圖2可知，采用2種全局閾值分割法(Global和Otsu)獲取的二值化圖像結(jié)果較為相近，其結(jié)果僅呈現(xiàn)出了骨顆粒的基本輪廓，并無(wú)任何腔隙結(jié)構(gòu)信息。采用K-means法獲取的灰度圖像是依據(jù)原始圖像各像素點(diǎn)的灰度將圖像分為3類，分別為背景、骨顆粒外輪廓和骨顆粒內(nèi)部，但骨顆粒內(nèi)部圖像無(wú)腔隙結(jié)構(gòu)特征。由此可知，骨顆粒內(nèi)部由于有骨腔隙結(jié)構(gòu)存在的整體灰度低于外輪廓，但顆粒內(nèi)部區(qū)域灰度較為相近，僅通過(guò)設(shè)定單一的全局閾值無(wú)法獲取骨腔隙的結(jié)構(gòu)特征。而經(jīng)2種局部閾值分割法處理的成像中則呈現(xiàn)出了較多的骨腔隙信息，這是由于該類方法是基于樣品圖像中每個(gè)像素點(diǎn)周圍的區(qū)域進(jìn)行計(jì)算，故這類被脂肪等物質(zhì)包裹的體積較小的骨腔隙，由于其平均密度小于區(qū)域內(nèi)的骨結(jié)構(gòu)密度，依然會(huì)被定義為腔隙結(jié)構(gòu)。對(duì)比2種局部自適應(yīng)分割法結(jié)果，可以看出采用Adaptive mean-C法獲取的圖像與原始圖像中的部分腔隙結(jié)構(gòu)差距較大，且結(jié)果圖像中骨顆粒的邊緣出現(xiàn)多處開(kāi)口現(xiàn)象，這也與顆粒實(shí)際情況不符，而Adaptive median-C法處理的圖像結(jié)果與原始圖較為相近，適合作為骨顆粒腔隙特征的表征方法。同時(shí)需要進(jìn)一步討論該方法中的WS和C 2個(gè)參數(shù)對(duì)圖像結(jié)果的影響。

采用Adaptive mean-C法的參數(shù)優(yōu)化結(jié)果如圖3所示(從上到下4幅圖像依次為魚骨、牛骨、豬骨、雞骨)。由圖3可知，Adaptive mean-C函數(shù)中C修正的是骨腔隙半徑，當(dāng)C由0逐漸減小時(shí)部分體積較小的腔隙會(huì)消失，而當(dāng)C逐漸增大時(shí)，部分距離相近的腔隙會(huì)發(fā)生連通現(xiàn)象。同時(shí)，函數(shù)中的WS影響的是局部閾值計(jì)算區(qū)域的尺寸。可以看出，當(dāng)WS值過(guò)小時(shí)，結(jié)果逐漸趨近于全局閾值分割的圖像，當(dāng)WS值過(guò)大時(shí)，骨腔隙的半徑會(huì)偏大，甚至一些距離較近的腔隙會(huì)連接在一起。對(duì)照?qǐng)D1，優(yōu)化的Adaptive mean-C法表征骨顆粒腔隙特征的參數(shù)WS為5，C為0。

圖3 基于Adaptive mean-C閾值分割算法的不同動(dòng)物源骨顆粒成像結(jié)果比較Fig.3 Results of different bone particles pictures dealt with different parameters of Adaptive mean-C method

2.3 不同動(dòng)物源骨顆粒顯微結(jié)構(gòu)的Micro-CT原位三維可視化表征結(jié)果

圖4～7所示為4種不同動(dòng)物源骨顆粒顯微結(jié)構(gòu)的Micro-CT原位三維可視化表征和沿z軸由下至上的5個(gè)x-y斷層圖像結(jié)果。

由圖4可以看出，魚骨樣品呈細(xì)長(zhǎng)管狀，斷層魚骨的黑色骨腔隙均沿骨顆粒中間呈細(xì)長(zhǎng)狀分布，此為中國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 3002—2016[29]以及圖1顯微鏡圖像所示的魚骨的典型結(jié)構(gòu)特征。由圖5～7可知，牛、豬和雞骨顆粒樣品斷層均呈現(xiàn)為不規(guī)則多邊體，其腔隙結(jié)構(gòu)多呈不規(guī)則分布于骨顆粒內(nèi)部，這也與相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和顯微鏡圖像所呈現(xiàn)的骨顆粒及其腔隙結(jié)構(gòu)和分布具有較好的一致性。上述結(jié)果表明，采用Micro-CT方法，無(wú)需進(jìn)行顯微鏡檢測(cè)所需的繁瑣的樣品預(yù)處理，直接通過(guò)觀察樣品腔隙結(jié)構(gòu)特征的不同，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)水生和陸生動(dòng)物源肉骨粉的有效鑒別。

圖4 魚骨顆粒顯微結(jié)構(gòu)的Micro-CT原位三維斷層可視化表征結(jié)果Fig.4 Micro-CT 3D in-situ visualization of fish bone particles

由圖5～7還可看出，牛、豬和雞骨腔隙結(jié)構(gòu)分割精度還有待進(jìn)一步提高。下一步研究將采用其它深度學(xué)習(xí)算法，以期實(shí)現(xiàn)對(duì)不同動(dòng)物源骨顆粒腔隙結(jié)構(gòu)的精準(zhǔn)分割，提高不同種屬骨顆粒腔隙形態(tài)結(jié)構(gòu)的Micro-CT原位三維可視化表征的精度。

圖5 牛骨顆粒顯微結(jié)構(gòu)的Micro-CT原位三維斷層可視化表征結(jié)果Fig.5 Micro-CT 3D in-situ visualization of bovine bone particles

圖6 豬骨顆粒顯微結(jié)構(gòu)的Micro-CT原位三維斷層可視化表征結(jié)果Fig.6 Micro-CT 3D in-situ visualization of porcine bone particles

圖7 雞骨顆粒顯微結(jié)構(gòu)的Micro-CT原位三維斷層可視化表征結(jié)果Fig.7 Micro-CT 3D in-situ visualization of chicken bone particles

3 結(jié)論

(1)建立了一種基于Micro-CT和Adaptive mean-C圖像分割算法的不同種屬肉骨粉骨顆粒腔隙結(jié)構(gòu)三維原位可視化表征方法。

(2)優(yōu)化掃描條件為電壓80 kV、電流125 μA、圖像分辨率8 μm、旋轉(zhuǎn)步長(zhǎng)0.20°、曝光時(shí)間46 ms和360°掃描；優(yōu)化圖像三維重構(gòu)條件為Smoothing 1、Post-Alignment 0、Ring-Artifacts 3和Beam-hardening 30%。

(3)優(yōu)化Adaptive mean-C函數(shù)參數(shù)為WS為5，C為0?；贛icro-CT的骨顆粒顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)表征結(jié)果與顯微鏡檢測(cè)結(jié)果較為一致。研究結(jié)果為豐富水生和陸生動(dòng)物源飼料的快速、無(wú)損判別分析提供了技術(shù)支撐。