袁凱旋， 歐陽(yáng)峰， 劉泓伶， 胡雪姣， 趙云虎， 陳曉麗， 葉 龍， 顧 兵

近年來，隨著免疫抑制人群的增加，侵襲性曲霉病(invasive aspergillosis，IA)發(fā)病率有所上升。IA臨床表現(xiàn)復(fù)雜、診治困難，具有感染率高、漏診率高、死亡率高的特點(diǎn)，且不同曲霉存在耐藥性差異，因此實(shí)現(xiàn)曲霉的快速鑒定仍是難題與挑戰(zhàn)[1]。目前，曲霉的實(shí)驗(yàn)室鑒定主要依賴于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)，耗時(shí)較長(zhǎng)，易出現(xiàn)鑒定錯(cuò)誤或無(wú)法鑒定的情況[2]。此外，血清學(xué)檢測(cè)中的G(1-3-β-D glucan)試驗(yàn)、GM(galactomannan)試驗(yàn)或曲霉抗原抗體試驗(yàn)雖能夠提示曲霉感染的可能，但易受多種因素影響呈現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性，且真菌血清學(xué)檢測(cè)存在交叉反應(yīng)，難以判斷真菌種屬[3]。分子診斷對(duì)場(chǎng)地、設(shè)備及技術(shù)人員的要求均較高，且檢測(cè)成本高、操作繁瑣，技術(shù)不成熟或未標(biāo)準(zhǔn)化，導(dǎo)致其臨床應(yīng)用受限?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometer，MALDI-TOF MS)在微生物檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)展迅速，能夠識(shí)別多種醫(yī)學(xué)上重要的真菌，包括念珠菌、隱球菌，以及部分絲狀真菌等[4]。然而，絲狀真菌細(xì)胞壁較厚，破壁困難，蛋白不易提取從而影響質(zhì)譜蛋白圖譜質(zhì)量，導(dǎo)致鑒定效果不佳[5]。目前，MALDI-TOF MS技術(shù)在絲狀真菌鑒定領(lǐng)域仍然處于探索階段，曲霉為臨床上引起IA的最常見絲狀真菌，對(duì)于其蛋白質(zhì)提取方法，尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化的破壁操作規(guī)范。提高曲霉破壁效果和質(zhì)譜鑒定效能，尋求高效的前處理方法為實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。基于以上現(xiàn)狀，為尋求最優(yōu)曲霉前處理方法，本研究將以VITEK MS為平臺(tái)，通過分析比較磁珠研磨法、冷凍研磨法和甲酸萃取法三種前處理方法對(duì)曲霉質(zhì)譜鑒定結(jié)果的差異，探討適合于曲霉質(zhì)譜鑒定的最佳前處理方法，實(shí)現(xiàn)曲霉質(zhì)譜快速鑒定，及時(shí)為臨床提供病原學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2021年1月至2021年12月由廣東省人民醫(yī)院臨床分離的非重復(fù)曲霉114株，其中煙曲霉20株，黑曲霉14株，黃曲霉20株，土曲霉20株，聚多曲霉20株，構(gòu)巢曲霉20株，均經(jīng)基因檢測(cè)鑒定。標(biāo)準(zhǔn)菌株3株，包括黃曲霉ATCC3631、煙曲霉ATCC MYA 3626、土曲霉ATCC MYA 3633，購(gòu)自中國(guó)真菌保藏中心。所納入的曲霉菌株為臨床常見引起IA的種類，并排除同一患者分離的重復(fù)菌株。

1.2試劑與儀器 VITEK MS質(zhì)譜儀(法國(guó)生物梅里埃公司，型號(hào)VITEK MS)，冷凍研磨儀(廣州露卡測(cè)序儀器有限公司，型號(hào)LUKYM-11)，磁珠(廣州露卡測(cè)序儀器有限公司，規(guī)格?3和?5)，光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司，型號(hào)BX53)，霉菌培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)MJ-150F-1)，無(wú)菌預(yù)裝提取管(湖北新縱科公司，型號(hào)NZK-M16018-02)，一次性靶板(法國(guó)生物梅里埃公司，型號(hào)1111281BM)，基質(zhì)液(法國(guó)生物梅里埃公司，批號(hào)1009271920)，大腸埃希菌ATCC 8739(法國(guó)生物梅里埃公司)，乙腈(上海阿拉丁公司，批號(hào)K2123013)，70%甲酸(上海阿拉丁公司，批號(hào)I2110247)，沙保葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Sabouraud dextrose agar，SDA；江門凱林公司，批號(hào)220701)。

1.3菌株培養(yǎng)及鑒定 將菌株轉(zhuǎn)種于SDA，在28 ℃霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d。采用透明膠帶法[6]在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲、孢子以及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等形態(tài)特征，進(jìn)行辨認(rèn)。對(duì)于部分產(chǎn)孢不良的菌株采用小培養(yǎng)法[7]進(jìn)行輔助鑒定。

1.4基因測(cè)序 根據(jù)Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取真菌DNA，應(yīng)用真菌通用引物對(duì)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。反應(yīng)總體積為50 μl：Taq PCR Master Mix 25 μl、DNA模板5 μl、0.2 μmol/L上、下游引物各2 μl、雙蒸水(double distilled water,ddH2O)16 μl。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 60 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。將PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司完成測(cè)序。使用Contig Express 9.1軟件將兩端序列進(jìn)行拼接和手動(dòng)矯正后，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和MYCOBANK數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.mycobank.org/)上進(jìn)行比對(duì)，種、屬信息鑒定原則參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[8]。

1.5MALDI-TOF MS前處理

1.5.1 磁珠研磨法 采用潮濕的拭子于菌落邊緣收集1～2 cm直徑的曲霉孢子和菌絲，將其懸于含900 μl 70%乙醇的2 ml的無(wú)菌預(yù)裝提取管，于渦旋振蕩器振蕩研磨10 min。研磨后將菌懸液全部轉(zhuǎn)移至新的2 ml EP管中，(10 000～14 000)×g離心2 min，棄上清，待乙醇完全揮發(fā)干后，加入40 μl新鮮配制的70%甲酸溶液，渦旋振蕩混勻(3 s)。加入40 μl乙腈，渦旋振蕩混勻(3 s)，(10 000～14 000)×g離心2 min，待測(cè)。

1.5.2 冷凍研磨法 取2 ml EP管，加入無(wú)菌磁珠3～4顆，用潮濕的拭子于菌落邊緣收集1～2 cm直徑的孢子和菌絲，將其懸于含900 μl 70%乙醇的EP管中滅活10 min。設(shè)置儀器研磨頻率為80 Hz/s，預(yù)冷溫度-35 ℃，設(shè)置每一研磨循環(huán)時(shí)間為60 s。將獲得的菌絲勻漿全部轉(zhuǎn)移至新的無(wú)菌EP管，(10 000～14 000)×g離心2 min，棄上清，待乙醇完全揮發(fā)后加入40 μl新鮮配制的70%甲酸，渦旋振蕩混勻(3 s)，加入40 μl乙腈渦旋振蕩混勻(3 s)，(10 000～14 000)×g離心2 min，待測(cè)。

1.5.3 甲酸萃取法 取2 ml EP管，加入40 μl新鮮配制的70%甲酸，使用200 μl TIP頭于菌落邊緣挑取少許孢子和菌絲，混勻其中，點(diǎn)振充分，待測(cè)。

1.6MALDI-TOF MS檢測(cè)與結(jié)果判讀 取1 μl上清液涂靶板，待干燥后覆以1 μl基質(zhì)液，自然干燥后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，采用RUO SARAMIS數(shù)據(jù)庫(kù)(版本4.14)進(jìn)行判斷。每株菌株重復(fù)檢測(cè)2次，若第1次無(wú)鑒定結(jié)果，則按照上述流程再次進(jìn)行檢測(cè)；若第2次仍無(wú)結(jié)果，則認(rèn)為鑒定失敗。根據(jù)RUO SARAMIS數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)為：深綠色提示鑒定分值≥1 000，置信度為99.9%；淺綠色提示鑒定分值900～999，置信度為90.0%～99.9%；黃色提示鑒定分值800～899，置信度為80.0%～89.9%；白色提示鑒定分值750～799或<750，置信度為75.0%～79.9%或無(wú)匹配結(jié)果；紅色提示結(jié)果有沖突或低分辨率。記錄不同前處理方法下的峰數(shù)目、置信度、鑒定結(jié)果和耗時(shí)。

2 結(jié)果

2.1三種前處理方法對(duì)曲霉質(zhì)譜鑒定率的比較 117株曲霉分別采用磁珠研磨法、冷凍研磨法和甲酸萃取法進(jìn)行前處理后獲得的質(zhì)譜鑒定率分別為90.60%(106/117)、61.54%(72/117)和57.26%(67/117)，磁珠研磨法的鑒定率與其他兩組比較有顯著差異(P<0.001)，提示磁珠研磨法鑒定率顯著優(yōu)于其他兩種方法。三種前處理方法對(duì)不同種曲霉的鑒定率的比較方面，磁珠研磨法和甲酸萃取法可將21株煙曲霉全部準(zhǔn)確鑒定(100.00%)，冷凍研磨法可將20株煙曲霉準(zhǔn)確鑒定(95.24%)，可見三種方法對(duì)煙曲霉鑒定效果較好(P>0.05)。磁珠研磨法對(duì)黃曲霉、黑曲霉、聚多曲霉和構(gòu)巢曲霉的鑒定率分別為90.48%(19/21)、64.29%(9/14)、85.00%(17/20)和100.00%(20/20)，顯著優(yōu)于其他兩種方法(P<0.05)，該方法除黑曲霉表現(xiàn)出較低鑒定率(64.28%)之外，其余鑒定率均在85%以上。見表1。

表1 三種前處理方法對(duì)曲霉的鑒定率比較[n(%)]

2.2三種前處理方法對(duì)曲霉質(zhì)譜鑒定的平均置信度、平均峰數(shù)量比較 117株曲霉分別采用磁珠研磨法、冷凍研磨法和甲酸萃取法進(jìn)行前處理后獲得的平均質(zhì)譜置信度為90.56%、51.31%和46.51%，三者比較有顯著性差異(P<0.001)。磁珠研磨法所獲得的結(jié)果置信度顯著高于其他兩種方法，且在不同曲霉種水平上的置信度均高于其他兩種方法(P<0.05)。三種前處理方法所獲得的平均峰數(shù)目分別為208、186和168，三者比較有顯著性差異(P<0.001)。磁珠研磨法較于其他兩種方法可獲得更高的峰數(shù)量，與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)中的圖譜匹配程度更高，且在不同曲霉種水平上的峰數(shù)量均顯著高于其他兩種方法(P<0.05)。見表2。

表2 三種前處理方法對(duì)曲霉質(zhì)譜鑒定的平均置信度、平均峰數(shù)量比較

2.3三種前處理方法對(duì)曲霉鑒定的耗時(shí)比較 以20株曲霉為一組，重復(fù)檢測(cè)2次，分別對(duì)三種前處理方法的菌株采集及滅活、研磨或萃取、加入甲酸乙腈/離心、涂靶板、滴加基質(zhì)液和質(zhì)譜分析6個(gè)步驟進(jìn)行計(jì)時(shí)，每完成一個(gè)步驟及時(shí)記錄計(jì)時(shí)器上時(shí)間讀數(shù)。采用冷凍研磨法完成一次質(zhì)譜鑒定流程耗時(shí)(90.00±1.05)min，磁珠研磨法耗時(shí)(73.87±0.32)min，甲酸萃取法耗時(shí)(35.33±0.61)min，在耗時(shí)上三種方法比較有顯著差異(F=4 474.992，P<0.001)。見表3。

表3 三種前處理方法對(duì)曲霉鑒定的耗時(shí)比較(min)

2.4三種前處理方法的質(zhì)譜圖譜分析結(jié)果 黃曲霉ATCC3631、煙曲霉ATCC MYA 3626、土曲霉ATCC MYA 3633經(jīng)上述3種方法前處理后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)獲取蛋白圖譜。對(duì)于黃曲霉，磁珠研磨法在質(zhì)荷比約4 424.40 m/z、6 819.59 m/z、8 423.08 m/z、10 292.33 m/z、11 949.76 m/z和13 639.24 m/z處均出現(xiàn)特征峰；冷凍研磨法在4 426.10 m/z、6 293.28 m/z和7 300.07 m/z出現(xiàn)特征峰；甲酸萃取法在4 425.29 m/z、6 291.06 m/z和7 296.58 m/z出現(xiàn)特征峰。磁珠研磨法相較于其他兩種方法所獲得的質(zhì)譜特征峰更復(fù)雜，數(shù)目更多，強(qiáng)度更高(見圖1?)。對(duì)于煙曲霉，磁珠研磨法在質(zhì)荷比約2 838.80 m/z、5 970.26 m/z、7 088.77 m/z和14 174.93 m/z處均出現(xiàn)特征峰，相較于其他兩種方法所獲得的特征峰數(shù)目更多(見圖1?)。對(duì)于土曲霉，三種方法圖譜較為相似，但甲酸萃取法在質(zhì)荷比約5 375.77處出現(xiàn)了峰的左移(見圖1?)。結(jié)果表明，磁珠研磨法所獲得的蛋白圖譜質(zhì)量?jī)?yōu)于其他兩種方法。

注：?黃曲霉ATCC3631；?煙曲霉ATCC MYA 3626；?土曲霉ATCC MYA 3633。①磁珠研磨法；②冷凍研磨法；③甲酸萃取法

3 討論

3.1臨床上曲霉感染形勢(shì)不容樂觀，其中煙曲霉、黃曲霉、土曲霉和黑曲霉仍是引起IA最為常見的種類，早期準(zhǔn)確的鑒定對(duì)于臨床診治具有重要意義[1-3]。目前，MALDI-TOF MS技術(shù)可實(shí)現(xiàn)部分曲霉的準(zhǔn)確鑒定，但曲霉細(xì)胞壁含有較多的幾丁質(zhì)成分，壁厚且堅(jiān)韌，需對(duì)其進(jìn)行前處理使細(xì)胞壁充分破裂，胞內(nèi)核糖體蛋白釋放溶出方可用于后續(xù)質(zhì)譜分析[9]。

3.2曲霉質(zhì)譜蛋白質(zhì)提取的方法大致分為完整細(xì)胞法和細(xì)胞裂解法[10-11]。本研究中磁珠研磨法和冷凍研磨法屬于細(xì)胞裂解法，甲酸萃取法為完整細(xì)胞法。國(guó)外Lau等[12]采用磁珠法對(duì)421株絲狀真菌進(jìn)行蛋白質(zhì)提取后質(zhì)譜鑒定，結(jié)果顯示，370株可鑒定到種的水平(88.9%)。國(guó)內(nèi)宗來斌和呂火烊[13]采用甲酸乙腈提取法和磁珠法對(duì)47株曲霉進(jìn)行前處理后，質(zhì)譜鑒定率分別為79.8%和77.5%；鄧穗燕等[14]研究發(fā)現(xiàn)液氮研磨法對(duì)35株曲霉種的鑒定率(71%)高于甲酸萃取法(54%)。本實(shí)驗(yàn)采用磁珠研磨法、冷凍研磨法和甲酸萃取法三種方法對(duì)117株曲霉進(jìn)行質(zhì)譜前處理后的總體鑒定率分別為90.60%、61.54%和57.26%，結(jié)果與相關(guān)報(bào)道相近[12，14]，可見磁珠研磨法鑒定率相較于其他兩種方法更高，冷凍研磨法與甲酸萃取法鑒定率一般，其中甲酸萃取法鑒定率最低。在鑒定效果方面，磁珠研磨法所獲得的平均置信度為90.56%，高于其他兩種方法，提示該方法獲得的鑒定結(jié)果可信程度更高，受試菌株質(zhì)譜蛋白圖譜與圖譜庫(kù)中的圖譜匹配程度相關(guān)更高。磁珠研磨法所獲得的平均峰數(shù)目為208，同樣高于其他兩種方法，可見經(jīng)該方法前處理后所獲得的曲霉蛋白圖譜與質(zhì)譜庫(kù)中圖譜相似度更高。磁珠研磨法對(duì)部分菌株所獲得的質(zhì)譜圖譜具有特征峰數(shù)量更多、強(qiáng)度更強(qiáng)的特點(diǎn)。究其原因，可能是：(1)磁珠研磨法加入了甲酸和乙腈，其中甲酸溶液起到破壞曲霉細(xì)胞壁的作用，乙腈則有助于曲霉胞內(nèi)核糖體蛋白進(jìn)一步釋出[15]；(2)提取過程中加入一定數(shù)量的磁珠，磁珠與孢子或菌絲之間相互剪切、碰撞，促使曲霉孢子與菌絲充分研磨，從而達(dá)到破壁效果，使得蛋白釋放更為充分，一定程度上提高了難破壁菌株的蛋白圖譜質(zhì)量與鑒定效果[16]；(3)隨著曲霉的成熟，孢子細(xì)胞壁增厚，完整細(xì)胞法破壁效果較差，例如本研究中甲酸萃取法鑒定效能較差。本研究中冷凍研磨法與甲酸萃取法總體鑒定率低，鑒定效果差和圖譜質(zhì)量不佳，可能是由于冷凍研磨法中因儀器頻率、振蕩時(shí)間的設(shè)置、菌液濃度的差異，振蕩過程中未能使孢子、菌絲與磁珠充分混勻，導(dǎo)致破壁效果不佳。甲酸萃取法亦存在破壁不充分的現(xiàn)象，蛋白無(wú)法充分釋出而影響圖譜質(zhì)量。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中還需繼續(xù)摸索和優(yōu)化曲霉質(zhì)譜鑒定的各種影響因素，以更好地提高曲霉質(zhì)譜鑒定率。

3.3絲狀真菌細(xì)胞壁成分和厚度受生長(zhǎng)時(shí)期和生長(zhǎng)速度影響[17]，不同曲霉生長(zhǎng)速度不同，導(dǎo)致細(xì)胞壁成分和厚度不同，從而影響破壁效果。本研究發(fā)現(xiàn)，不同前處理方法對(duì)曲霉的破壁效果存在部分種的差異，實(shí)驗(yàn)中三種前處理方法對(duì)煙曲霉的鑒定率均在90%以上，鑒定效果和圖譜質(zhì)量?jī)?yōu)，可見3種前處理方法對(duì)煙曲霉鑒定效能影響較小。對(duì)于土曲霉、黃曲霉、聚多曲霉和構(gòu)巢曲霉，只有磁珠研磨法表現(xiàn)出良好的鑒定效能。值得注意的是，磁珠研磨法對(duì)于黑曲霉的鑒定率僅為64.29%，平均置信度僅為78.52%，鑒定率相較于其他5種曲霉最低，可能是由于黑曲霉中的黑色素影響了電離作用，造成蛋白質(zhì)圖譜中某些臨床菌種特異度峰值的缺乏或峰數(shù)目不足，雖能得到蛋白質(zhì)圖譜，但是與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)圖譜相似度差，無(wú)法獲得鑒定結(jié)果[15，18]。

3.4操作安全、耗時(shí)較短的前處理方法是實(shí)驗(yàn)室需要考慮的問題。甲酸萃取法雖耗時(shí)最短，相較于磁珠研磨法、冷凍研磨法，省去了菌株滅活的步驟，但可能操作過程中產(chǎn)生的孢子氣溶膠會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生潛在的感染或者污染風(fēng)險(xiǎn)[19-20]，故質(zhì)譜操作過程必須在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行且必須對(duì)菌株進(jìn)行滅活。顯然，磁珠研磨法雖操作時(shí)間較長(zhǎng)，但保證了菌株的滅活，在生物安全方面優(yōu)于甲酸萃取法。

3.5本研究的局限性在于曲霉數(shù)量和種類偏少，在今后研究中將繼續(xù)收集保留菌株，豐富曲霉數(shù)量和種類并將其他種類的絲狀真菌納入研究。

綜上所述，結(jié)合鑒定效果、生物安全和圖譜質(zhì)量三個(gè)方面，磁珠研磨法在曲霉的質(zhì)譜鑒定方面表現(xiàn)較優(yōu)，鑒定效果較理想，適合于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室對(duì)曲霉的快速鑒定，可及時(shí)為臨床提供病原學(xué)依據(jù)。