劉夢(mèng)嬌，易航，蔡新忠,2*

（1.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)研究所/浙江省作物病蟲生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058；2.浙江大學(xué)海南研究院，海南 三亞 572025）

在病原物侵染過程中，細(xì)胞內(nèi)離子通量的變化是植物細(xì)胞最早的反應(yīng)之一[1]。其中，Ca2+在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及防御反應(yīng)啟動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用[2]。環(huán)核苷酸門控離子通道（cyclic nucleotide-gated ion channel,CNGC）是一類非選擇性陽離子通道，參與調(diào)控Ca2+內(nèi)流和病原侵染的防衛(wèi)反應(yīng)[3-4]。

植物CNGC 最早在大麥鈣調(diào)蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)體的篩選中被發(fā)現(xiàn)[5]。植物CNGC蛋白的結(jié)構(gòu)與動(dòng)物的類似，一般有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（S1～S6），在S5與S6跨膜結(jié)構(gòu)中間有一段含20～30 個(gè)氨基酸的離子傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)，稱為孔環(huán)結(jié)構(gòu)或者P 環(huán)，是CNGC 通道的離子選擇過濾器。在胞質(zhì)C 端有環(huán)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（cyclic nucleotide binding domain, CNBD）和鈣調(diào)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域（calmodulin binding domain,CaMBD）[6-7]。功能分析結(jié)果表明，植物CNGC 不僅在生長發(fā)育和維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)，而且在抵御病原物侵染和以分子模式觸發(fā)免疫等方面發(fā)揮著重要作用[8]。比如，AtCNGC2 和AtCNGC4 的功能缺失突變體，即dnd1（defense no death 1）和dnd2/hlm1（defense no death 2/hypersensitive response-like lesion mimic 1），表現(xiàn)出自發(fā)性細(xì)胞死亡和廣譜抗性[9-11]，兩者形成異源四聚體參與細(xì)菌分子模式flg22觸發(fā)免疫的調(diào)控[12]。擬南芥共有20個(gè)CNGC，分成4個(gè)群組，目前只對(duì)組Ⅳ中的AtCNGC2和AtCNGC4等個(gè)別成員對(duì)丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）等活體營養(yǎng)型病原物的抗性調(diào)控作用進(jìn)行了研究，其他成員的抗病調(diào)控作用，尤其是對(duì)死體營養(yǎng)型病原物的抗性調(diào)控作用研究甚少。AtCNGC3屬于組Ⅰ，在擬南芥的整個(gè)發(fā)育階段均有表達(dá)，具有Na+和K+通透性，在抵抗鹽脅迫中起顯著作用[13-14]，但其是否參與植物免疫調(diào)控尚無相關(guān)報(bào)道。

核盤菌［Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary］是典型的死體營養(yǎng)型病原真菌，為害植物并導(dǎo)致菌核病。核盤菌寄主非常廣泛，包括75個(gè)科278個(gè)屬408 個(gè)種的植物，并且對(duì)許多重要作物如油菜、大豆、花生和向日葵以及多種蔬菜造成重大威脅，是這些作物生產(chǎn)中危害最嚴(yán)重的病害之一，每年在全球造成重大經(jīng)濟(jì)損失，因此，該菌被稱為世界上最具毀滅性和分布最廣泛的植物病原物之一[15]。但植物抗核盤菌機(jī)制的研究還遠(yuǎn)不夠深入。已有的研究結(jié)果揭示，植物還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶基因RbohD/RbohF介導(dǎo)的活性氧（reactive oxygen species,ROS）快速積累是植物抗核盤菌的重要機(jī)制[16]，對(duì)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的控制是決定植物與病原物互作的最終結(jié)果是發(fā)病還是抗病的關(guān)鍵[17]。植物激發(fā)子肽（plant elicitor peptide,Pep）作為一類損傷相關(guān)分子模式（damageassociated molecular pattern,DAMP），能激發(fā)植物免疫反應(yīng)，使植物產(chǎn)生抗性。AtPep1是一個(gè)具有23個(gè)氨基酸的短肽DAMP，能夠激發(fā)植物合成ROS，激活防衛(wèi)基因防御素（PDF1.2）基因的轉(zhuǎn)錄[18]，并誘導(dǎo)擬南芥對(duì)核盤菌的抗性[19]。本實(shí)驗(yàn)室此前通過病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技術(shù)對(duì)番茄CNGC 基因的分析結(jié)果顯示，屬于組Ⅰ的SlCNGC1、SlCNGC6基因?qū)吮P菌的抗性具有正調(diào)控作用[20]，而屬于組Ⅳb 的SlCNGC16、SlCNGC17和SlCNGC18基因?qū)吮P菌的抗性具有負(fù)調(diào)控作用，但對(duì)AtPep1觸發(fā)的免疫反應(yīng)——ROS積累具有正調(diào)控作用[21]。然而，這些結(jié)果有待穩(wěn)定遺傳學(xué)證據(jù)的進(jìn)一步支持，且屬于組Ⅰ的CNGC對(duì)AtPep1 觸發(fā)的免疫反應(yīng)調(diào)控作用尚不明確。本研究利用擬南芥突變體和構(gòu)建的AtCNGC3超表達(dá)株系，分析明確了一個(gè)屬于組Ⅰ的CNGC基因AtCNGC3對(duì)核盤菌的抗性及對(duì)AtPep1 觸發(fā)的免疫反應(yīng)的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 植物材料

擬南芥野生型Columbia（Col-0）種子由本實(shí)驗(yàn)室保存，擬南芥cngc3（Atcngc3）突變體（SALK_066634C）種子購自中國AraShare公司，AtCNGC3超表達(dá)株系（AtCNGC3overexpression,AtCNGC3-OE）由本研究利用35S強(qiáng)啟動(dòng)子載體構(gòu)建獲得。擬南芥種子在播種前進(jìn)行春化處理［將種子放置于已滅菌的2 mL EP（Eppendorf）管中，加入適量雙蒸水（ddH2O），置于4 ℃冰箱中春化2 d］，然后用槍頭吸出并均勻播種于V（泥炭）∶V（蛭石）∶（珍珠巖）=4∶2∶1的基質(zhì)土中，覆膜保濕，置于22～23 ℃、14 h/10 h光/暗周期的植物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d后揭膜，10 d后移栽入單獨(dú)培養(yǎng)缽，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)。生長3周時(shí)進(jìn)行活性氧檢測(cè)，4～5周時(shí)進(jìn)行核盤菌接種實(shí)驗(yàn)。

1.2 供試菌株及載體

核盤菌UF-1 野生型菌株，由吉林大學(xué)張艷華教授提供；用于構(gòu)建AtCNGC3-OE植株的攜帶綠色熒光蛋白（green fluorescence protein,GFP）和35S強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)的載體pCambia1305-GFP，由浙江大學(xué)梁巖教授惠贈(zèng)；用于檢測(cè)亞細(xì)胞定位的攜帶GFP 的瞬時(shí)表達(dá)載體pCambia1300-GFP，由浙江大學(xué)宋鳳鳴教授惠贈(zèng)；膜系統(tǒng)標(biāo)志物PIP2A-DsRed農(nóng)桿菌，由浙江大學(xué)周雪平教授提供；大腸埃希菌（Escherichia coli）DH5α和 農(nóng) 桿 菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 供試試劑及培養(yǎng)基

cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript qRT Super Mix及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）試劑ChamQ SYBR qPCR Master Mix（high ROX Premixed），購自南京諾唯贊生物科技有限公司；Hlingene 高純度質(zhì)粒小量提取試劑盒和TRIpure 總RNA 提取試劑，購自上?；萘枭锛夹g(shù)有限公司；Hifair Ⅲ第1 鏈cDNA合成試劑盒、Hieff Clone?Plus一步克隆試劑盒和MolPure?瓊脂糖凝膠回收試劑盒，購自上海翊圣生物科技有限公司。培養(yǎng)基配制［核盤菌培養(yǎng)用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar,PDA）培養(yǎng)基，大腸埃希菌培養(yǎng)用LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基，農(nóng)桿菌培養(yǎng)用酵母提取物肉湯（yeast extract broth,YEB）培養(yǎng)基］的相關(guān)材料及氯仿、異丙醇等試劑購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司及英國Oxoid公司?；钚匝鯗y(cè)定相關(guān)試劑購于美國Sigma公司。本實(shí)驗(yàn)所使用的材料及其反應(yīng)條件均按照上述對(duì)應(yīng)公司的說明書進(jìn)行。PCR 引物合成和相關(guān)基因測(cè)序委托浙江有康生物科技有限公司完成。

1.4 亞細(xì)胞定位檢測(cè)

以Col-0 cDNA 質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)AtCNGC3 亞細(xì)胞定位引物（表1），擴(kuò)增開放閱讀框。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行膠回收，通過一步克隆法插入攜帶綠色熒光蛋白（GFP）的pCambia1300-GFP 載體。將重組載體pC1300-AtCNGC3-GFP 轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，對(duì)測(cè)序正確的陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取并轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101中。分別將pC1300-AtCNGC3-GFP 農(nóng)桿菌和膜系統(tǒng)標(biāo)志物PIP2A-DsRed 農(nóng)桿菌在含有50 μg/mL 卡納（Kana）和利福平（Rif）抗生素的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，然后置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。挑取單克隆至含同樣質(zhì)量濃度抗生素的液體YEB 培養(yǎng)基中，在28 ℃條件下，以230 r/min 搖動(dòng)培養(yǎng)至渾濁，然后轉(zhuǎn)移適量菌液至5 mL YEB 培養(yǎng)基中，繼續(xù)搖動(dòng)培養(yǎng)。待搖至菌液在600 nm 波長下吸光度值為0.8～1.0 時(shí)，離心收集菌體，用LUC 緩沖液（含10 mmol/L MES、10 mmol/L氯化鎂、150 μmol/LACS）重懸菌體，直至在600 nm波長下吸光度值為2.0時(shí)，將pC1300-AtCNGC3-GFP 農(nóng)桿菌和PIP2A-DsRed農(nóng)桿菌按1∶1混合，黑暗放置2～3 h后，用去掉針頭的無菌1 mL注射器浸潤4—6周齡本氏煙葉片，36 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察亞細(xì)胞定位情況。

1.5 AtCNGC3 基因表達(dá)檢測(cè)

1.5.1AtCNGC3在植株各組織中的組成性表達(dá)檢測(cè)

對(duì)Col-0植株的根、莖、葉、花、果莢等部位分別取樣，于液氮中冷凍。提取各樣品的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)表達(dá)量，以AtACTIN8為內(nèi)參基因，相關(guān)引物見表1。

1.5.2AtCNGC3的響應(yīng)表達(dá)檢測(cè)

對(duì)核盤菌的響應(yīng)表達(dá)檢測(cè)：在4～5 周Col-0 植株葉片上用直徑為3 mm 的核盤菌菌絲塊進(jìn)行接種，于接種后3、9、15、21 h 分別取樣。取樣時(shí)去除菌絲塊，并剪去壞死部分，將剩余組織置于液氮中速凍。

對(duì)AtPep1 的響應(yīng)表達(dá)檢測(cè)：將Col-0 種子消毒（70%乙醇1 min，15%次氯酸鈉5 min，ddH2O 清洗3次）后播至1/2 MS培養(yǎng)基中，12 d后將幼苗用鑷子小心放置于加有ddH2O的36孔板中，過夜恢復(fù)。用200 nmol/L AtPep1對(duì)幼苗進(jìn)行浸泡處理，分別在2、4 h時(shí)取樣，置于液氮中速凍。

提取上述樣品的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，用qRT-PCR 技術(shù)檢測(cè)表達(dá)量，以AtACTIN8作為內(nèi)參基因，相關(guān)引物見表1。

基因相對(duì)表達(dá)量以2－ΔΔCT計(jì)算，ΔΔCT=［（CT樣品－CT樣品內(nèi)參）－（CT對(duì)照－CT對(duì)照內(nèi)參）］，其中CT為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

1.6 Atcngc3 突變體檢測(cè)

根據(jù)Atcngc3突變體的SALK號(hào)（SALK_066634C），在擬南芥T-DNA 插入突變體引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站（http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html）上設(shè)計(jì)特異性引物（cngc3-LP，cngc3-RP）。以基因組DNA為模板，采用三引物法（LBb1.3+LP+RP）檢測(cè)突變體，引物序列見表1。

1.7 核盤菌接種分析

1.7.1 核盤菌的接種實(shí)驗(yàn)

選取飽滿的核盤菌菌核，用無菌刀片將菌核切開，然后將其切面朝下置于PDA 固體培養(yǎng)基上，在25 ℃黑暗條件下活化培養(yǎng)3 d。選用直徑5 mm 的打孔器打取菌落邊緣的菌絲塊，將菌絲塊面朝下接種到新的PDA 固體培養(yǎng)基上，在25 ℃條件下培養(yǎng)36 h后，用直徑3 mm的打孔器打取最邊緣的菌絲供植物葉片接種用。選取生長4～5周的擬南芥植株，以0.1%Tween-20 對(duì)葉片進(jìn)行噴霧處理后，將菌絲塊菌絲面朝下接種到葉片的中間位置，每株接種3個(gè)葉片，每個(gè)葉片接種1個(gè)菌絲塊，覆膜保濕，并置于25 ℃溫室內(nèi)培養(yǎng)，21 h后進(jìn)行拍照記錄。

1.7.2 菌量檢測(cè)

在拍照記錄葉片發(fā)病情況后，用針頭僅移除葉片上的菌絲塊，保留粘在菌絲塊上的壞死組織，然后用直徑大于壞死面積的打孔器打取植物壞死組織，保證每次取樣面積相同。將打取的壞死組織放入2 mL 離心管并快速置于液氮中冷凍。采用提取菌絲DNA 的方法提取所收集的壞死組織中的核盤菌DNA，經(jīng)凝膠回收試劑盒純化后進(jìn)行qRT-PCR分析。qRT-PCR 所用的內(nèi)參基因?yàn)锳tACTIN8，檢測(cè)核盤菌菌量的參照序列為SclerotiniaITS序列，相關(guān)引物見表1。

1.8 AtCNGC3 超表達(dá)植株的構(gòu)建

用一步克隆法構(gòu)建AtCNGC3超表達(dá)載體pC1305-AtCNGC3-GFP（引物見表1），通過農(nóng)桿菌蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥。將收獲的種子播在含50 μg/mL潮霉素的1/2 MS 固體培養(yǎng)基上，在第10 天時(shí)能看到陽性苗生根正常，并開始長出新葉。將陽性苗轉(zhuǎn)移到單獨(dú)培養(yǎng)缽中，收種后繼代培養(yǎng)，篩選得到2個(gè)株系純合子超表達(dá)植株，命名為AtCNGC3-OE-1和AtCNGC3-OE-2。分別用半定量PCR 和qRTPCR 技術(shù)檢測(cè)AtCNGC3的表達(dá)量，內(nèi)參基因?yàn)锳tACTIN8，引物見表1。

表1 用于本研究的PCR引物Table 1 PCR primers used in this study

1.9 AtPep1 誘導(dǎo)的活性氧檢測(cè)

植物材料采用直徑為3 mm 的擬南芥葉小圓片，將其置于含ddH2O的培養(yǎng)皿中，在光照條件下靜置過夜處理以穩(wěn)定背景值，消除干擾。靜置時(shí)和放入儀器進(jìn)行加樣檢測(cè)時(shí)均保證小圓片正面朝上。檢測(cè)液體系總體積為100 μL，其中，L012［8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶［3，4-d］噠嗪-1，4-（2H，3H）二酮鈉鹽］終濃度為12.5 nmol/L，辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase,HRP）終濃度為20 nmol/L，AtPep1終濃度為200 nmol/L。使用OrionL板式化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀（德國Berthold 公司）實(shí)時(shí)測(cè)定體系內(nèi)活性氧產(chǎn)生情況。

1.10 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

利用ImageJ 1.8.0軟件對(duì)病斑面積進(jìn)行測(cè)量，用GraphPad Prism 9.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析整理并作圖，用學(xué)生t檢驗(yàn)（Student’st-test）進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。亞細(xì)胞定位結(jié)果用ZEN 2012軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AtCNGC3 的亞細(xì)胞定位

通過分別表達(dá)帶綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)簽的目的蛋白（AtCNGC3-GFP）與細(xì)胞膜系統(tǒng)標(biāo)志物PIP2A-DsRed蛋白的農(nóng)桿菌共浸潤本氏煙36 h后，在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行熒光觀察。結(jié)果（圖1）表明：AtCNGC3-GFP 綠色熒光與膜系統(tǒng)標(biāo)志物紅色熒光在質(zhì)膜上重疊，說明AtCNGC3 定位于質(zhì)膜上；兩者在核膜上沒有重合，說明AtCNGC3在核膜上沒有表達(dá)。

圖1 AtCNGC3的亞細(xì)胞定位Fig.1 Subcellular localization of AtCNGC3

2.2 AtCNGC3 在植株各組織中的表達(dá)

為明確AtCNGC3的表達(dá)是否具有組織特異性，采用qRT-PCR 技術(shù)分別檢測(cè)了AtCNGC3在擬南芥野生型植株的根、莖、葉、花和果莢中的表達(dá)。結(jié)果（圖2）顯示，AtCNGC3在植株各組織中均有明顯表達(dá)，其中在果莢中的表達(dá)量最高，但與其余組織，包括根、莖、葉和花中的表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異。這說明AtCNGC3廣泛表達(dá)于各類組織中。

圖2 AtCNGC3在植株各組織中的表達(dá)Fig.2 Expression of AtCNGC3 in plant tissues

2.3 AtCNGC3 對(duì)S.sclerotiorum 侵染的表達(dá)響 應(yīng)

為了明確AtCNGC3是否對(duì)核盤菌的侵染有表達(dá)上的響應(yīng)，檢測(cè)了AtCNGC3在Col-0植株上接種核盤菌后的基因表達(dá)水平動(dòng)態(tài)。結(jié)果（圖3）表明，接種核盤菌能顯著誘導(dǎo)AtCNGC3的表達(dá)，且誘導(dǎo)程度隨時(shí)間持續(xù)加強(qiáng)。與對(duì)照處理相比，接種后3 h，AtCNGC3表達(dá)只略高于對(duì)照，但在接種后9、15、21 h，AtCNGC3的表達(dá)量分別升高至對(duì)照的3.8 倍、12.5 倍和18.1 倍。說明AtCNGC3對(duì)核盤菌侵染有持續(xù)強(qiáng)烈的表達(dá)響應(yīng)，可能參與擬南芥對(duì)核盤菌的抗病反應(yīng)。

圖3 AtCNGC3對(duì)核盤菌侵染的表達(dá)響應(yīng)Fig.3 Expression response of AtCNGC3 to Sclerotinia sclerotiorum infection

2.4 Atcngc3功能喪失突變體對(duì)核盤菌的抗性分析

2.4.1Atcngc3突變體植株的驗(yàn)證

利用三引物法檢測(cè)驗(yàn)證Atcngc3突變體（SALK_066634C），檢測(cè)原理按擬南芥T-DNA插入突變體引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站（http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html）上所示。其中，LP和RP為根據(jù)SALK號(hào)序列設(shè)計(jì)的特異性引物，LBb1.3 是T-DNA 插入序列的一段通用引物。因此，無T-DNA插入的野生型植株只有LP+RP 能擴(kuò)增出約1 000 bp 的條帶，而純合突變體只有LBb1.3+RP能擴(kuò)增出條帶，雜合突變體中這2 對(duì)引物均能擴(kuò)增出條帶。提取Atcngc3突變體不同植株的基因組DNA，以野生型作為對(duì)照，用上述2對(duì)引物分別進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，突變體中只有LBb1.3+RP擴(kuò)出約500 bp的條帶（圖4）。說明本實(shí)驗(yàn)中獲取的植株是Atcngc3純合突變體植株。這些突變體的生長發(fā)育與野生型植株沒有明顯區(qū)別。

圖4 Atcngc3突變體植株的驗(yàn)證Fig.4 Verification of Atcngc3 mutant plants

2.4.2Atcngc3突變體植株的接種分析

為明確AtCNGC3在擬南芥對(duì)核盤菌抗性中的調(diào)控作用，對(duì)其功能喪失突變體植株進(jìn)行核盤菌UF-1接種分析，結(jié)果如圖5所示。在接種UF-1 21 h后，Atcngc3突變體植株表現(xiàn)出比野生型植株Col-0更感病的表型（圖5A）。病斑面積分析結(jié)果顯示，Atcngc3突變體的發(fā)病面積達(dá)到了124.3 mm2，而野生型葉片的病斑面積只有97.8 mm2（圖5B），說明Atcngc3突變體的發(fā)病程度明顯重于Col-0。進(jìn)一步的菌量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在相同面積的壞死組織中，Atcngc3突變體葉片中的核盤菌生物量顯著多于Col-0，是Col-0的2.1倍（圖5C）。這說明AtCNGC3可能正調(diào)控?cái)M南芥對(duì)核盤菌的基礎(chǔ)抗性。

圖5 Atcngc3功能喪失突變體對(duì)核盤菌抗性的接種分析Fig.5 Inoculation analysis for resistance of Atcngc3 loss-of-function mutation plants to S.sclerotiorum

2.5 AtCNGC3 超表達(dá)植株對(duì)核盤菌的抗性分析

2.5.1 AtCNGC3-OE 植株的驗(yàn)證

為進(jìn)一步明確AtCNGC3 抗核盤菌的功能，用農(nóng)桿菌蘸花法構(gòu)建了AtCNGC3超表達(dá)（AtCNGC3-OE）載體pC1305-AtCNGC3-GFP，并篩到2 個(gè)株系純合子植株，命名為AtCNGC3-OE-1 和AtCNGC3-OE-2。半定量PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，超表達(dá)植株AtCNGC3的表達(dá)量明顯高于野生型植株Col-0（圖6A）。利用qRT-PCR 技術(shù)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，AtCNGC3-OE植株2個(gè)株系的AtCNGC3表達(dá)量分別約為Col-0的7.6倍和6.1倍（圖6B）。上述結(jié)果表明，2個(gè)純合株系的AtCNGC3超表達(dá)植株被成功構(gòu)建。

圖6 AtCNGC3超表達(dá)植株的驗(yàn)證Fig.6 Verification of AtCNGC3 overexpression plants

2.5.2 AtCNGC3-OE 植株的接種分析

對(duì)AtCNGC3-OE 植株進(jìn)行核盤菌UF-1 接種分析，結(jié)果如圖7 所示。在接種UF-1 21 h 后，AtCNGC3-OE 植株表現(xiàn)出比野生型植株Col-0 更抗病的表型（圖7A）。病斑面積分析結(jié)果顯示，野生型Col-0 葉片的病斑面積達(dá)到了101.7 mm2，而AtCNGC3-OE-1和AtCNGC3-OE-2植株分別只有75.8、78.9 mm2（圖7B），說明AtCNGC3-OE植株的抗病性明顯強(qiáng)于Col-0。菌量分析結(jié)果顯示，在相同面積的壞死組織中，AtCNGC3-OE植株葉片中的核盤菌生物量顯著少于Col-0，只有Col-0 的1/2 左右（圖7C）。綜合該結(jié)果以及2.4 節(jié)部分結(jié)果，可以確定AtCNGC3正調(diào)控?cái)M南芥對(duì)核盤菌的基礎(chǔ)抗性。

圖7 AtCNGC3超表達(dá)植株對(duì)核盤菌抗性的接種分析Fig.7 Inoculation analysis for resistance of AtCNGC3 overexpression plants to S.sclerotiorum

2.6 AtCNGC3 對(duì)AtPep1 的表達(dá)響應(yīng)及在AtPep1誘導(dǎo)的ROS 迸發(fā)中的作用

為明確AtCNGC3是否對(duì)AtPep1有表達(dá)響應(yīng)，采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)200 nmol/LAtPep1浸泡擬南芥幼苗處理后AtCNGC3的表達(dá)情況。結(jié)果（圖8A）表明：在AtPep1處理2 h后，AtCNGC3的表達(dá)量與水處理沒有顯著差異。但在處理4 h后，AtPep1處理強(qiáng)烈誘導(dǎo)AtCNGC3的表達(dá)，表達(dá)量為水處理的9.8倍。說明AtCNGC3能在表達(dá)水平上迅速響應(yīng)AtPep1處理。

已知AtPep1能誘導(dǎo)ROS迸發(fā)。為分析AtCNGC3是否在這個(gè)過程中有調(diào)控作用，在其突變體植株、超表達(dá)植株及野生型植株中分別檢測(cè)了200 nmol/L AtPep1 誘導(dǎo)的ROS 積累水平。結(jié)果（圖8B）顯示，AtPep1誘導(dǎo)Atcngc3突變體產(chǎn)生的ROS峰值明顯低于野生型，而AtPep1 誘導(dǎo)AtCNGC3-OE 植株產(chǎn)生的ROS峰值則顯著高于野生型。說明AtCNGC3能正調(diào)控AtPep1誘導(dǎo)的ROS迸發(fā)。

圖8 AtCNGC3對(duì)AtPep1的表達(dá)響應(yīng)及在AtPep1誘導(dǎo)的ROS迸發(fā)中的作用Fig.8 Expression response of AtCNGC3 to AtPep1 and its role in AtPep1-induced ROS burst

3 討論

CNGC 是植物重要的鈣離子通道。擬南芥CNGC家族共有20個(gè)成員，這些基因在植物抗病性中的作用，尤其是對(duì)死體營養(yǎng)型病原物的抗性調(diào)控作用的研究鮮有報(bào)道。本研究利用擬南芥突變體以及構(gòu)建的基因超表達(dá)株系，闡明了一個(gè)屬于組Ⅰ的CNGC 基因AtCNGC3對(duì)核盤菌的抗性以及對(duì)AtPep1觸發(fā)的免疫反應(yīng)的重要調(diào)控作用，并提供了遺傳學(xué)證據(jù)來證明CNGC 對(duì)死體營養(yǎng)型病原物抗性的重要作用。本研究結(jié)果增進(jìn)了對(duì)CNGC 抗病調(diào)控功能的認(rèn)識(shí)。

CNGC 通常被假設(shè)定位于質(zhì)膜上，但其亞細(xì)胞定位不是唯一的。已有研究證實(shí)多數(shù)CNGC 定位于質(zhì)膜上，如擬南芥AtCNGC2[22-23]、AtCNGC10[24]、AtCNGC12[25]、AtCNGC14[26]、AtCNGC17[27]、AtCNGC18[28]和AtCNGC20[29]。但AtCNGC19定位于液泡膜上[29]，苜蓿（Medicago truncatula）MtCNGC15a/b/c 定位于核膜上[30]。其中，MtCNGC15a/b/c 能促使核膜腔或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+跨越核膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜釋放到胞質(zhì)或核質(zhì)中。但CNGC 分布是否動(dòng)態(tài)響應(yīng)細(xì)胞刺激尚待明確[31]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，AtCNGC3在質(zhì)膜上表達(dá)，說明它可能參與由胞外到胞質(zhì)中的Ca2+內(nèi)流調(diào)控，但還需進(jìn)一步的電生理實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

在擬南芥中，CNGC2和CNGC4調(diào)控flg22和AtPep觸發(fā)的免疫以及對(duì)丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）的抗性[9-12,32-33]。CNGC11 和CNGC12 正調(diào)控?cái)M南芥對(duì)寄生霜霉（Peronospora parasitica）和細(xì)菌的抗性[34-36]。CNGC19 在印度梨形孢（Piriformospora indica）介導(dǎo)的對(duì)AtPep1 觸發(fā)的免疫抑制中起關(guān)鍵作用[37-38]。本研究發(fā)現(xiàn)，AtCNGC3對(duì)AtPep1 處理迅速強(qiáng)烈響應(yīng)，并介導(dǎo)由AtPep1 誘導(dǎo)的ROS迸發(fā)，正調(diào)控對(duì)核盤菌的抗性。徐雅靜[19]研究表明，AtPep1處理能誘導(dǎo)擬南芥對(duì)核盤菌的抗性。這說明AtCNGC3可能參與調(diào)控AtPep1介導(dǎo)的抗核盤菌免疫反應(yīng)。綜合以上結(jié)果，CNGC 家族的不同成員在植物免疫中存在功能冗余。但CNGC各成員在針對(duì)某一個(gè)具體病原物的抗性或某一種病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular pattern,PAMP）/DAMP觸發(fā)的免疫中的功能冗余詳情，有待各個(gè)CNGC 成員針對(duì)各病原物抗性及各PAMP/DAMP觸發(fā)的免疫的進(jìn)一步平行研究確定。

最近的研究結(jié)果表明，在flg22 觸發(fā)的免疫中，CNGC2 和CNGC4 形成異源四聚體復(fù)合物，由葡萄孢菌誘發(fā)的激酶1（Botrytis-induced kinase 1,BIK1）磷酸化能激活該CNGC 復(fù)合物，介導(dǎo)細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，啟動(dòng)下游Ca2+依賴的模式觸發(fā)免疫（patterntriggered immunity, PTI）反 應(yīng)，如ROS 迸 發(fā)[12]。AtCNGC3 介導(dǎo)的抗核盤菌免疫是否也有類似的作用機(jī)制，尤其是AtCNGC3 是否也與某一個(gè)CNGC形成四聚體，是否也受BIK1 或其他受體樣細(xì)胞質(zhì)激酶（receptor-like cytoplasmic kinases,RLCKs）磷酸化激活等機(jī)制，值得更深入研究探索。

4 結(jié)論

擬南芥CNGC3 定位于質(zhì)膜上，在所有檢測(cè)組織中均有較高水平表達(dá)。對(duì)突變體植株和超表達(dá)植株的分析結(jié)果表明，AtCNGC3正調(diào)控?cái)M南芥對(duì)核盤菌的抗性以及AtPep1 介導(dǎo)的ROS 迸發(fā)免疫反應(yīng)。本研究闡明了AtCNGC3的抗病和免疫調(diào)控作用，并為CNGC對(duì)死體營養(yǎng)型病原物抗性的重要調(diào)控作用提供了遺傳學(xué)證據(jù)。