王吉平， 張野， 王瑾， 蘇天明， 謝育利，梁芷姮， 甘國(guó)勇， 楊振媚， 何鐵光*

(1.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西益譜檢測(cè)技術(shù)有限公司，廣西 南寧 530007)

中國(guó)是生豬養(yǎng)殖大國(guó)，2020年全國(guó)肉豬出欄頭數(shù)達(dá)5.27億頭，豬肉產(chǎn)量4 100多萬(wàn)噸，遠(yuǎn)超牛羊肉類(lèi)產(chǎn)量[1]。每年因疫病導(dǎo)致的生豬死亡率約為8%～12%[2]。2018年8月以來(lái)的非洲豬瘟，更是使生豬的死亡率大幅增加。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)每年病死豬數(shù)量高達(dá)6 000萬(wàn)頭，未經(jīng)無(wú)害化處理，自食、出售、丟棄等不當(dāng)處理數(shù)量高達(dá)60%[3]。病死豬不當(dāng)處理不僅會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染，病原體的擴(kuò)散也會(huì)威脅生豬養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，甚至增加人畜共患病的隱患[4]。當(dāng)前，病死豬無(wú)害化處理主要包括焚燒法、掩埋法、化制法和生物發(fā)酵法。其中生物發(fā)酵法由于成本低，污染小的特性，已被廣泛應(yīng)用于病死畜禽無(wú)害化處理[5-7]。

病死畜禽生物發(fā)酵法無(wú)害化處理主要是通過(guò)添加微生物菌劑進(jìn)行發(fā)酵。微生物菌劑是無(wú)害化發(fā)酵處理的重要部分[8-10]。當(dāng)前，通過(guò)環(huán)境樣品或堆肥樣品篩選病死豬降解菌的研究較多。李海龍等[11]通過(guò)對(duì)鋸末和病死豬的發(fā)酵堆肥樣品中篩選得到兩株芽孢桿菌N-3和Y-3，能高效降解蛋白質(zhì)和脂肪，且接種后病死豬降解率超過(guò)96%，顯著高于對(duì)照；肖翰等[12]從受油脂污染的樣品中篩選分離得到6株具有降解油脂的菌株，其中黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)對(duì)油脂的降解率達(dá)到57.21%，能顯著降低病死豬堆肥后的油脂含量，加快物料腐熟。這些研究均為在未確定目標(biāo)菌株的情況下，分離培養(yǎng)盡可能多的微生物再進(jìn)行功能篩選，工作量大且效率不高。當(dāng)前，已有許多市售商品級(jí)的微生物發(fā)酵菌劑，但對(duì)不同的物料類(lèi)型和發(fā)酵工藝，其效果差異很大。因此，針對(duì)特定工藝對(duì)廣適應(yīng)型微生物菌劑進(jìn)行進(jìn)一步復(fù)配優(yōu)化，對(duì)提高病死豬生物發(fā)酵法無(wú)害化降解處理效率和降低生產(chǎn)成本等具有重要意義。

隨著當(dāng)前生物信息學(xué)及高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，利用測(cè)序來(lái)研究環(huán)境或堆體中微生物群落組成已成為主流方法[13-14]。其中，細(xì)菌微生物群落多樣性主要通過(guò)擴(kuò)增16s rRNA基因的保守序列，再利用Illumina或Pacbio測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序和分析[15-16]。通過(guò)對(duì)已有的發(fā)酵體系進(jìn)行微生物群落多樣性測(cè)序，充分探明發(fā)酵過(guò)程中微生物群落變化，確定發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)微生物菌群，有針對(duì)性地培養(yǎng)分離目標(biāo)菌株，將能有效提高菌株的篩選效率，對(duì)通用型微生物菌劑的再?gòu)?fù)配具有重要的指導(dǎo)作用。本研究將通過(guò)對(duì)已有的病死豬生物發(fā)酵無(wú)害化處理過(guò)程進(jìn)行微生物群落多樣性分析，研究不同發(fā)酵時(shí)期行使主要功能的微生物種類(lèi)，找出特定工藝下病死豬降解的關(guān)鍵微生物，為病死豬無(wú)害化輔熱發(fā)酵過(guò)程機(jī)理解析、發(fā)酵工藝和菌劑復(fù)配優(yōu)化提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)病死豬由廣西潔源動(dòng)物無(wú)害化處理有限公司提供，輔料及其主要參數(shù)特性見(jiàn)表1。病死豬破碎后與蔗渣(鮮重)進(jìn)行1∶1混合。使用的微生物發(fā)酵菌劑為多種嗜熱好氧微生物復(fù)合菌劑。無(wú)害化處理發(fā)酵罐為臥式機(jī)械攪拌發(fā)酵罐，并配備完善的尾氣廢氣處理設(shè)備。

表1 原料主要參數(shù)特性Table 1 Main characteristics of raw materials

1.2 試驗(yàn)方法

輔熱發(fā)酵無(wú)害化工藝流程如圖1所示(發(fā)酵6 h后添加蔗渣充分可吸收血水)，發(fā)酵前期溫度控制在55 ℃，攪拌速率為6～10 r/min，保持17 h，后升溫至85 ℃并保持約4 h，出料后進(jìn)行后腐熟或作為原料與其他廢棄物配比后堆制成生物有機(jī)肥。發(fā)酵過(guò)程中，初步混勻(約1 h)取樣，升溫至55 ℃后(約3 h)間隔1 h取樣一次，采集的樣品迅速保存在液氮中，用于提取DNA進(jìn)行16s rDNA測(cè)序分析。

圖1 病死豬生物發(fā)酵法無(wú)害化簡(jiǎn)要工藝流程Figure 1 Brief process of harmless biological fermentation of dead pigs

1.2.1 細(xì)菌群落多樣性檢測(cè)

將收集的樣品進(jìn)行總DNA提取，二代高通量測(cè)序采用引物341F:CCTACGGGNGGCWGCAG；806R:GGACTACHVGGGTATCTAAT擴(kuò)增16S rDNA的V3+V4區(qū)(約466 bp)，使用Illumina平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序策略為PE250。三代全長(zhǎng)測(cè)序采用引物27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；1492R:CRGYTACCTTGTTACGACTT擴(kuò)增16s rDNA全長(zhǎng)V1-V9區(qū)(約1 500 bp)，并采用Pacbio平臺(tái)進(jìn)行全長(zhǎng)測(cè)序。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序原始數(shù)據(jù)下機(jī)后，使用DADA2軟件對(duì)Reads進(jìn)行過(guò)濾、校正，并輸出非冗余的Reads和對(duì)應(yīng)的豐度信息，然后將Reads拼接為T(mén)ag，去除嵌合體Tag，獲得用于后續(xù)分析的Tag序列和豐度，即ASV序列和ASV豐度信息，再對(duì)ASV序列進(jìn)行注釋，得到物種注釋信息。比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)為Silva數(shù)據(jù)庫(kù)(Silva Release 138.1，http://www.arb-silva.de)。數(shù)據(jù)處理及作圖使用Microsoft office 2016軟件。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 二代測(cè)序下的微生物群落結(jié)構(gòu)隨發(fā)酵時(shí)間變化情況

在基于Illumina平臺(tái)的二代測(cè)序結(jié)果中，數(shù)據(jù)過(guò)濾后質(zhì)量良好，Tags的N90長(zhǎng)度約為430 bp，進(jìn)行聚類(lèi)和序列比對(duì)后，進(jìn)行不同分類(lèi)水平下微生物群落結(jié)構(gòu)分析。通過(guò)α多樣性分析表明，細(xì)菌群落的多樣性隨發(fā)酵時(shí)間呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)(見(jiàn)圖2)，說(shuō)明發(fā)酵過(guò)程中，微生物群落的物種數(shù)目在發(fā)酵中期(11～17 h)最低，發(fā)酵中期的微生物菌群存在著優(yōu)勢(shì)微生物菌群。對(duì)各樣本的細(xì)菌群落相對(duì)豐度進(jìn)行分析，其中綱水平下不同綱的細(xì)菌相對(duì)豐度如圖3所示，桿菌綱(Bacilli)的微生物相對(duì)豐度呈現(xiàn)先升高后降低的態(tài)勢(shì)(7 h樣品微生物群落組成發(fā)生較大變化，主要由于6 h取樣后添加了1份蔗渣所致)，且在發(fā)酵中期(10～17 h)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)(接近90%)。此外，發(fā)酵前期γ-變形桿菌綱(Gammaproteobacteria)為主要優(yōu)勢(shì)菌群，說(shuō)明初始物料中含有較豐富的γ-變形桿菌綱的微生物；發(fā)酵前期放線菌綱(Actinobacteria)、梭菌綱(Clostridia)和α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)的微生物相對(duì)豐度也較高，但隨著發(fā)酵進(jìn)程的進(jìn)行，其相對(duì)含量不斷降低。17 h后發(fā)酵罐升溫至85 ℃時(shí)，Bacilli綱的微生物相對(duì)豐度出現(xiàn)下降態(tài)勢(shì)，說(shuō)明高溫處理會(huì)使得發(fā)酵中期的優(yōu)勢(shì)菌群減少，從而導(dǎo)致其他菌群相對(duì)豐度上升。

圖2 微生物群落豐富度指數(shù)隨發(fā)酵時(shí)間變化Figure 2 Microbial community richness index changed with fermentation time

圖3 綱水平下細(xì)菌群落相對(duì)豐度隨發(fā)酵時(shí)間的變化Figure 3 Variation of relative abundance of bacterial community with fermentation time at class level

屬水平下，發(fā)酵前期未分類(lèi)和其他屬的細(xì)菌相對(duì)豐度超過(guò)50%(見(jiàn)圖4)。發(fā)酵初期，埃希氏-志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)的微生物相對(duì)含量為21.62%，為單一屬含量最高的細(xì)菌群落，這主要是病死豬腸道內(nèi)攜帶的微生物。假交替單胞菌屬(Pseudoxanthomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和叢毛單胞菌屬(Comamonas)，7 h和8 h的樣品分析結(jié)果表明，輔料蔗渣中主要攜帶的是假交替單胞菌屬、其他屬和未分類(lèi)屬的微生物。在發(fā)酵中期，芽孢桿菌屬(Bacillus)的微生物相對(duì)豐度呈現(xiàn)先升高后降低的態(tài)勢(shì)，且在發(fā)酵中期占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)(接近90%)。綜合綱水平和屬水平下的分析結(jié)果表明，發(fā)酵過(guò)程中桿菌綱下芽孢桿菌屬在降解病死豬的過(guò)程中起主要作用。

圖4 屬水平下細(xì)菌群落相對(duì)豐度隨發(fā)酵時(shí)間的變化Figure 4 Variation of relative abundance of bacterial community with fermentation time at genus level

2.2 基于不同測(cè)序平臺(tái)和策略下種水平的微生物群落結(jié)構(gòu)分布和差異

在二代測(cè)序結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇1 h、6 h、14 h和21 h的DNA樣品進(jìn)行16s rDNA全長(zhǎng)序列擴(kuò)增，并采用Pacbio平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行注釋分析得到種水平下的物種組成。與二代測(cè)序的結(jié)果相比，三代測(cè)序鑒定到種水平的物種更多，且精細(xì)化程度更高。其中，二代測(cè)序結(jié)果中，14 h的樣品中凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)占比達(dá)89.50%，具有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)(見(jiàn)圖5A)；在三代測(cè)序結(jié)果中，芽孢桿菌屬下種水平下鑒定到凝結(jié)芽孢桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌A(B.coagulansA)，分別占比61.21%和36.90%(見(jiàn)圖5B)。另外，在發(fā)酵時(shí)間為1 h的樣品中，二代測(cè)序結(jié)果豐度最高的為埃希氏-志賀氏菌屬下的宋內(nèi)志賀氏菌(S.sonnei)，而三代測(cè)序結(jié)果豐度最高為大腸埃希氏桿菌(Escherichiacoli)和大腸桿菌福氏志賀菌(E.flexneri)，說(shuō)明三代測(cè)序由于其能測(cè)定16s rDNA的全長(zhǎng)，在菌種鑒定，尤其是種水平上的鑒定具有更高的質(zhì)量和準(zhǔn)確度。同時(shí)，兩次測(cè)序的結(jié)果在總體上是一致的，這為后續(xù)病死豬發(fā)酵菌株的篩選提供了可靠的研究基礎(chǔ)。

圖5 不同測(cè)序策略的種水平下細(xì)菌群落相對(duì)豐度隨發(fā)酵時(shí)間的變化Figure 5 Changes of relative abundance of bacterial community with fermentation time at species level of different sequencing strategies

2.3 微生物群落功能預(yù)測(cè)

對(duì)二代測(cè)序結(jié)果的微生物群落功能進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，利用PICRUSt2軟件結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的功能分類(lèi)層級(jí)，分析代謝水平(Metabolism level)下的不同類(lèi)型化合物代謝功能途徑的豐度(用count值表示)。結(jié)果表明，發(fā)酵過(guò)程中，總代謝功能豐度隨時(shí)間先增高后降低，其中碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔因子和維生素代謝、其他氨基酸代謝及脂質(zhì)代謝等的功能豐度較高(見(jiàn)圖6)。病死豬無(wú)害化發(fā)酵過(guò)程中，主要的代謝功能包括碳水化合物代謝、氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝。綜合分析芽孢桿菌屬的相對(duì)豐度和與病死豬無(wú)害化發(fā)酵降解有關(guān)的代謝途徑的功能豐度，發(fā)現(xiàn)二者之間存在著較強(qiáng)的一致性，均呈現(xiàn)出隨著發(fā)酵時(shí)間先增加后減少的趨勢(shì)(見(jiàn)圖7)。因此，綜合發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌群和功能預(yù)測(cè)，我們判斷在整個(gè)病死豬無(wú)害化過(guò)程中，起關(guān)鍵性重要作用的微生物種類(lèi)為芽孢桿菌屬，尤其是該屬中占比約90%的凝結(jié)芽孢桿菌。

圖6 微生物群落代謝功能豐度隨發(fā)酵時(shí)間的變化Figure 6 Changes of metabolic function abundance of microbial community with fermentation time

圖7 病死豬降解主要代謝功能豐度與Bacillus細(xì)菌群落相對(duì)豐度隨發(fā)酵時(shí)間變化Figure 7 The main metabolic functions abundance and the relative abundance of Bacillus bacterial community changed with fermentation time of degradation in dead pigs

3 討論與結(jié)論

病死豬生物發(fā)酵無(wú)害化處理過(guò)程中，微生物菌劑是提高處理效率的關(guān)鍵因素[17-19]。但不同的物料配方和處理工藝下最優(yōu)微生物菌劑的復(fù)配有著較大差異。因此，針對(duì)不同物料配比和處理工藝，對(duì)添加復(fù)合菌劑發(fā)酵過(guò)程中關(guān)鍵功能微生物菌株進(jìn)行分析，是指導(dǎo)菌劑優(yōu)化復(fù)配、提高菌劑專一性和發(fā)酵降解效率的重要策略。通過(guò)對(duì)蔗渣和病死豬高溫輔熱好氧生物發(fā)酵無(wú)害化過(guò)程進(jìn)行微生物群落多樣性分析，我們發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過(guò)程中微生物群落的豐富度指數(shù)呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)，這與戶青青[20]接種微生物強(qiáng)化好氧堆肥微生物α多樣性在發(fā)酵中期降低的研究結(jié)果一致。且微生物多樣性結(jié)果表明，綱水平下桿菌綱和屬水平下芽孢桿菌屬微生物在發(fā)酵中期占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，是發(fā)酵降解病死豬等原料的主要功能微生物菌株。

綜合二代和三代測(cè)序分析，相同分析策略下種水平微生物三代測(cè)序數(shù)據(jù)能鑒定得到的微生物種類(lèi)更多，這是由于三代測(cè)序具有更長(zhǎng)的讀長(zhǎng)，從而使其注釋更為準(zhǔn)確。兩種測(cè)序結(jié)果均表明在種水平下，發(fā)酵中期(14 h)凝結(jié)芽孢桿菌類(lèi)微生物為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的微生物種群。

對(duì)微生物群落功能的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，發(fā)酵過(guò)程中代謝通路的功能豐度集中在病死豬和蔗渣降解的代謝途徑上，且碳水化合物代謝、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝等通路的代謝功能豐度與芽孢桿菌屬的微生物相對(duì)豐度變化趨勢(shì)一致。該結(jié)果充分表明在病死豬生物發(fā)酵法無(wú)害化處理過(guò)程中，凝結(jié)芽孢桿菌是其關(guān)鍵微生物，是后續(xù)菌劑優(yōu)化復(fù)配的主要部分。下一步研究將通過(guò)增加凝結(jié)芽孢桿菌在微生物發(fā)酵菌劑的含量，加快優(yōu)勢(shì)菌群的形成速度，提高病死豬降解效率，降低菌劑生產(chǎn)成本。本研究為病死豬無(wú)害化處理過(guò)程機(jī)理解析、發(fā)酵工藝和菌劑復(fù)配優(yōu)化提供了重要參考依據(jù)。