章鵬廷，秦東升，閆守財，劉頁申，肖海波

（上海師范大學化學與材料科學學院，上海 200234）

0 引言

在水處理過程中，消毒是保證水質(zhì)安全的一個極其重要的環(huán)節(jié).天然水體經(jīng)過相關(guān)的水處理工藝及消毒處理后才可以成為飲用水，污水經(jīng)過相應的水處理工藝及消毒處理后才能循環(huán)利用.在眾多消毒方法中，處理效率高、費用較低、操作方便的氯化消毒法仍然是目前城市飲用水和污水處理中普遍采用的消毒方式.因此，眾多水體中不可避免地會殘留一定量的次氯酸（HClO）.研究表明：高濃度的HClO溶液易與水中有機物反應生成氯仿、四氯化碳等致癌物質(zhì)，而且HClO溶液刺激性強，會傷害呼吸系統(tǒng)，引起眼睛或鼻子過敏，對人體健康存在著潛在危害［1-2］.內(nèi)源性HClO是一種重要的活性氧（ROS）物種，在生物體內(nèi)具有重要的生理功能，參與眾多生理過程，尤其是在免疫系統(tǒng)抵制外侵的細菌中起著極其重要的作用.然而，由于HClO的高反應性和擴散性，使它在吞噬細胞時會不受控制的產(chǎn)生，與多種人類疾病的產(chǎn)生有著密切的聯(lián)系.如果生命體內(nèi)的HClO含量不能維持在正常的生理水平范圍內(nèi)，將會破壞宿主組織，引起一系列的疾病，如：炎癥性疾病、神經(jīng)衰弱、腎臟疾病、心血管疾病和某些癌癥等［3-4］.

隨著研究技術(shù)的不斷發(fā)展，熒光探針已經(jīng)成為環(huán)境分析和生物檢測必不可少的研究工具，結(jié)合顯微技術(shù)可以實時并直觀地檢測和監(jiān)控被測物含量水平.近些年來，檢測HClO與次氯酸根（ClO-）的熒光探針發(fā)展很快，都是基于HClO的強氧化特性.2016年，TIAN等［5］報道了以花菁為熒光母體、苯硫醚為檢測基團的HClO熒光探針.2018年，ZHANG等［6］報道了以熒光素為母體、對苯氨基醚為檢測基團的熒光探針，可以很好地識別內(nèi)源性HClO.2020年，WANG等［7］報道了以四苯乙烯為熒光母體、烯基嘧啶酮為檢測基團的HClO熒光探針，并將其應用于生物體內(nèi)HClO的識別.

單光子熒光探針能對一些化合物進行有效的檢測，但有以下缺點：由于單光子激發(fā)波長處于紫外可見光區(qū)，光漂白、光損傷較大；生物組織自發(fā)熒光物質(zhì)的激發(fā)波長也在350～560 nm，采用單光子激發(fā)會有背景干擾，影響檢測的效果與精準度.而雙光子熒光材料激發(fā)波長一般在700～900 nm，能有效地避免紫外光損傷和細胞組織自發(fā)熒光的干擾，不發(fā)生光漂白和光毒化，并能進行生物細胞的深層成像；同時，雙光子熒光激發(fā)的熒光強度是入射光強度的二次方，熒光激發(fā)只發(fā)生在聚集點，能實現(xiàn)局域檢測［8-11］.由于螺二芴分子的剛性三維結(jié)構(gòu)和易修飾的特點，可以通過在螺二芴的不同活性位點連接探測受體和發(fā)光團.本課題組創(chuàng)新設計合成了一系列具有不同檢測功能和高熒光量子產(chǎn)率的螺二芴類雙光子熒光探針［12-18］，以典型的ROS物種ClO-為檢測目標物，充分利用了螺二芴型雙光子熒光探針優(yōu)越的光化學性能，構(gòu)建了一種新型的雙光子熒光探針（SPF），如圖1所示，對于ClO-的檢測具有潛在的應用價值.

圖1 目標化合物SPF的合成路線

1 實驗部分

1.1 主要儀器和試劑

主要儀器：顯微熔點測定儀（XT4A，控溫型，北京市科儀電光儀器廠）；核磁共振儀（Bruker AVANCEIII 400 MHz，德國Bruker）；紫外分光光度計（ZF-1型，上海顧村電光儀器廠）；熒光光譜儀（Cray Eclipse 500，美國瓦里安）.

主要試劑：乙酸乙酯（EA，分析純，上?？v承化工科技有限公司）；石油醚（分析純，上?？v承化工科技有限公司）；二氯甲烷（分析純，上海縱承化工科技有限公司）；無水乙醇（分析純，上?？v承化工科技有限公司）；乙酸（分析純，國藥集團化學試劑公司）；二氨基馬來腈（分析純，上海邁瑞爾化學科學技術(shù)有限公司）；15%（質(zhì)量分數(shù)）次氯酸鈉（上海阿拉丁生化有限公司）；碳酸氫鈉（分析純，上海泰坦科技公司）；柱層析硅膠（200-300目）（分析純，煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司）；柱層析硅膠（300～400目）（分析純，煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司）.中間體2，7-二（4-三苯胺基）-2'，7'-二醛基-9，9'-螺二芴根據(jù)先前報道的方法制備［13］.

光譜測試條件：紫外吸收光譜測試電壓350 V，狹縫寬度為0.5 nm，掃描速度為1 200 nm·min-1，四面透光比色皿（1 cm×1 cm）；熒光發(fā)射光譜測試電壓350 V，狹縫寬度為10/10，掃描速度為1 200 nm·min-1，四面透光比色皿（1 cm×1 cm），激發(fā)波長為372 nm.

1.2 SPF的制備

依次稱取430 mg的2，7-二（4-三苯胺基）-2'，7'-二醛基-9，9'-螺二芴和130 mg的馬來腈置于50 mL圓底燒瓶中，加入15 mL無水乙醇、10 mL EA作為溶劑，再滴加3滴催化量的乙酸.將圓底燒瓶放入80℃油浴中，攪拌回流過夜.待反應結(jié)束后，停止加熱，冷卻到室溫.將沉降在瓶底的固體物質(zhì)抽濾，濾渣用少量冷無水乙醇洗滌，濾液倒入到100 mL飽和碳酸氫鈉溶液中，用二氯甲烷萃取2～3次，收集合并有機相并加入柱層析硅膠拌樣，通過柱層析分離、提純，洗脫劑體積比為V（石油醚）∶V（EA）=2∶1，烘干得到黃色固體，稱重得295 mg，產(chǎn)率53%.1H NMR（400 MHz，Chloroform-d）δ8.19～8.01（m，5H），7.96（d，J=7.9 Hz，1H），7.80（d，J=8.3 Hz，3H），7.63（d，J=8.3 Hz，2H），7.59～7.50（m，6H），7.46（td，J=8.0，7.2，2.7 Hz，4H），7.30（s，1H），7.28（s，2H），7.25（d，J=2.7 Hz，1H），7.15（dt，J=11.7，7.5 Hz，6H），6.92（t，J=7.3 Hz，3H），6.90～6.84（m，5H），6.83～6.76（m，5H），6.73（s，1H），6.67（d，J=8.9 Hz，1H）.13C NMR（100 MHz，Chloroform-d）δ163.7，145.9，144.8，143.3，142.4，142.0，141.1，139.9，135.2，133.1，130.5，129.6，129.1，128.9，128.8，128.5，127.2，126.8，125.7，124.7，123.2，121.1，120.2，119.2，110.1，63.5.

2 結(jié)果與討論

2.1 光譜性能研究

把SPF分別溶解在不同極性溶劑中，并配置成物質(zhì)的量濃度為1×10-5mol·L-1溶液，所使用的溶劑有：甲苯（toluenen）、1，4-二氧六環(huán)（1，4-dioxane）、二甲亞砜（DMSO）、四氫呋喃（THF）、乙酸乙酯（EA）、丙酮（acetone）、乙腈（acetonitrile）、乙醇（ethanol）.分別測定SPF在不同有機溶劑中的紫外吸收光譜（圖2）和熒光吸收光譜（圖3）.由圖2和圖3可以觀察到溶劑極性對SPF的光譜性質(zhì)有較明顯的影響.隨著溶劑的極性增強，化合物SPF的紫外吸收光譜發(fā)生了微弱的紅移，而熒光光譜發(fā)生了較大的紅移.在相同測試條件下，加入ClO-前后SPF的熒光強度變化在丙酮溶劑中最大，如圖3所示.從圖4可以發(fā)現(xiàn)，在丙酮水溶液體系中，隨著水的比例逐漸增大，加入ClO-前后SPF的熒光增強幅度逐漸下降，由此選擇V（丙酮）∶V（水）=9∶1作為后續(xù)測試的溶劑體系.

圖2 SPF在不同溶劑中的紫外吸收光譜圖

圖3 SPF在不同溶劑中的熒光發(fā)射光譜圖（激發(fā)波長372 nm）

圖4 SPF在丙酮與水不同體積比中的熒光發(fā)射光譜圖（激發(fā)波長372 nm）

2.2 SPF對ClO-探測性能的研究

2.2.1 SPF紫外和熒光光譜對ClO-的響應

為了探究在自然和生理條件下ClO-對化合物SPF紫外和熒光光譜的影響，向一定物質(zhì)的量濃度的SPF溶液（1×10-5mol·L-1，V（丙酮）∶V（水）=9∶1）中加入相同物質(zhì)的量濃度（1×10-5mol·L-1）的ClO-，待其反應完畢后進行紫外和熒光光譜測試.從圖5可以看出，加入ClO-前后探針SPF的紫外可見吸收圖中波形發(fā)生明顯變化，并在350 nm處出現(xiàn)了等位點，說明有新的物種出現(xiàn).圖6顯示加入ClO-后探針SPF的熒光強度明顯增強.從圖7可以看到，將ClO-加入到SPF溶液，溶液顏色由黃色褪為無色；在365 nm的紫外燈下，熒光顯著增亮，表明SPF可以作為裸眼識別ClO-的探針.

圖5 SPF在加入相同物質(zhì)的量濃度的ClO-（反應時間為60 s）前后的紫外可見吸收圖

圖6 SPF在加入10 μmol·L-1 ClO-（反應時間為60 s）前后的熒光發(fā)射光譜圖（激發(fā)波長372 nm）

圖7 SPF在加入相同物質(zhì)的量濃度的ClO-

2.2.2 SPF熒光光譜對不同金屬離子和陰離子的響應

為了探究自然和生理條件下常見的金屬離子對化合物SPF熒光的影響，向一定物質(zhì)的量濃度的SPF溶液（1×10-5mol·L-1，V（丙酮）∶V（水）=9∶1）中分別加入物質(zhì)的量濃度相同（1×10-5mol·L-1）的不同金屬離子，包括鈉離子（Na+）、鉀離子（K+）、銅離子（Cu2+）、銀離子（Ag+）、鎂離子（Mg2+）、鋇離子（Ba2+）、三價鐵離子（Fe3+）、鎳離子（Ni2+）、鋰離子（Li+）和鈷離子（Co2+）離子，待其反應完畢后進行熒光光譜測試.從圖8可以看出，向SPF溶液中分別加入不同的金屬離子后，熒光強度幾乎沒有變化，但加入ClO-后，熒光強度明顯增強，表明SPF對其他金屬離子沒有響應，對ClO-有特異性識別作用.

圖8 SPF在加入相同物質(zhì)的量濃度的不同金屬陽離子后的熒光發(fā)射光譜圖（激發(fā)波長372 nm）

探究了常見的陰離子對化合物SPF熒光光譜的影響，向物質(zhì)的量濃度為1×10-5mol·L-1的SPF溶液（V（丙酮）∶V（水）=9∶1）中分別加入相同物質(zhì)的量濃度的不同陰離子，包括硝酸根離子（NO3-）、碳酸根離子（CO32-）、碳酸氫根離子（HCO3-）、硫酸根離子（SO42-）、氯離子（Cl-）、溴離子（Br-）、磷酸根離子（PO43-）和醋酸根離子（CHCOO-），待其反應完畢后進行熒光光譜測試.從圖9可以看出，分別加入不同的陰離子后，熒光強度幾乎沒有變化，當加入ClO-后，熒光強度明顯增強，表明探針SPF對其他陰離子沒有響應，而對ClO-有特異性識別作用.

圖9 SPF在加入相同物質(zhì)的量濃度的不同陰離子后的熒光發(fā)射光譜圖（激發(fā)波長372 nm）

為了探究常見的干擾物對化合物SPF識別ClO-的影響，先向一定物質(zhì)的量濃度的SPF溶液（1×10-5mol·L-1）中分別加入物質(zhì)的量濃度相同（1×10-5mol·L-1）的不同干擾物，包括金屬離子Na+，K+，Cu2+，Ag+，鋁離子（Al3+），Mg2+，Ba2+，F(xiàn)e3+，Ni+，Li+，Co2+，陰離子NO3-，CO32-，HCO3-，SO42-，CH3COO-，Cl-，Br-，PO43-，亞硝酸根離子（NO2-），以及常見ROS物種一氧化氮（NO·），羥自由基（OH·），過氧化氫（H2O2），然后進行熒光光譜測試，再加入ClO-，待其反應完畢后再次進行熒光光譜測試.從圖10可以看出，將其他干擾物加入到SPF溶液中時，探針的熒光強度變化微弱，當接著將ClO（-10 μmol·L-1）加入時，熒光強度明顯增強，可以看出溶液的熒光強度變化與ClO-的加入密切相關(guān)，并且其響應不受其他干擾物存在的影響，表明探針SPF對ClO-有很好的選擇性.

圖10 SPF在干擾離子與ClO-共存條件下的相對熒光強度分布圖（圖中1—23分別是：Na+，K+，Cu2+，Ag+，Al3+，Mg2+，Ba2+，F(xiàn)e3+，Ni+，Li+，Co2+，NO3-，CO32-，HCO3-，SO42-，CH3COO-，Cl-，Br-，PO43-，NO2-，NO·，OH·，H2O2）

2.2.3 不同pH環(huán)境對SPF熒光的影響

為了探究SPF的酸堿穩(wěn)定性及不同pH值環(huán)境是否影響探針對ClO-的響應，進行了如下測試：選擇V（丙酮）∶V（水）=9∶1的體系將探針配置成1×10-5mol·L-1溶液，通過鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)體系的pH值，測試探針熒光，然后再加入ClO-（10 μmol·L-1），待其反應完畢后再次進行熒光光譜測試，測試結(jié)果如圖11所示.在pH為3～11范圍內(nèi)探針的熒光強度基本不變，表明在廣泛的pH范圍內(nèi)探針具有很好的穩(wěn)定性.在加入ClO-條件下，隨著pH值增大，熒光強度逐漸升高，在6～10的pH值范圍內(nèi)熒光強度比較穩(wěn)定，繼續(xù)增大體系pH值，熒光強度急劇增強.可以得出SPF是一個適宜在pH值在6～10范圍內(nèi)檢測ClO-的熒光探針.

圖11 SPF在有或無ClO-存在條件下的熒光強度隨pH值的變化

2.2.4 SPF對不同濃度ClO-的響應測試

為了進一步研究不同濃度的ClO-對SPF的影響，設計了如下方案進行測試：首先選擇V（丙酮）∶V（水）=9∶1的體系將探針配置成1×10-5mol·L-1，然后從小到大依次滴加不同物質(zhì)的量濃度的ClO-溶液，形成一系列的濃度梯度，并待其反應完畢后進行熒光光譜測試，如圖12所示.從圖12中的熒光強度與HClO濃度的散點圖可以看出，當向SPF溶液中加入不同濃度的ClO-時，隨著ClO-濃度的增加，化合物的熒光強度逐漸升高，并表現(xiàn)出一定的劑量濃度依賴性.從散點圖可以看出，在ClO-濃度超過20 μmol·L-1以后，隨著ClO-濃度持續(xù)增加，SPF熒光強度還是不斷增強，并沒有達到飽和現(xiàn)象，可能跟測試時間較短（60 s），SPF與ClO-未完全充分反應有關(guān).

圖12 SPF對不同物質(zhì)的量濃度ClO-響應（濃度依次為0，0.5×10-5，1.0×10-5，1.5×10-5，2.0×10-5，2.5×10-5，3.0×10-5，3.5×10-5，4.0×10-5，4.5×10-5，5.0×10-5 mol·L-1，反應時間為60 s）的熒光發(fā)射光譜圖（激發(fā)波長372 nm）

為了進一步確定SPF的熒光強度變化與ClO-的濃度關(guān)系，以ClO-的濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標，做一個擬合曲線，如圖12內(nèi)插圖所示.從擬合曲線可以看出，在ClO-濃度為0～20 μmol·L-1，熒光強度（Y）與ClO-濃度（X）存在一定的線性相關(guān)性，其擬合方程為Y=7.142 41X+65.675 57，根據(jù)3σ/k準則，計算出該探針對ClO-的檢測限為2 μmol·L-1.因此，探針SPF對ClO-有很好的靈敏性且可以在一定濃度范圍內(nèi)進行定量檢測.

2.2.5 SPF對ClO-響應的機理探究

圖5中出現(xiàn)了等位點，表明在SPF溶液中加入ClO-后反應生成了新的物質(zhì).為了進一步探究SPF對ClO-響應的機理，進行了核磁滴定實驗.發(fā)現(xiàn)在加入ClO-后的核磁共振圖上出現(xiàn)了化學位移值為9.8的醛基峰，如圖13所示.結(jié)合文獻資料［19-21］，可確定加入ClO-后SPF的席夫堿結(jié)構(gòu)被氧化斷鍵，產(chǎn)生了醛基，具體機理如圖14所示.

圖13 SPF在加入ClO-前后的核磁滴定圖

圖14 SPF對ClO-檢測機理圖

2.2.6 雙光子性能的測試

通過開孔Z-掃描實驗測得SPF在THF中波長為800 nm的雙光子吸收截面值為300 GM，如圖15所示.SPF表現(xiàn)出良好的雙光子吸收性能，預示著能在生物細胞雙光子熒光成像方面得到較好的應用.

圖15 在THF中SPF的開孔Z-掃描數(shù)據(jù)

3 結(jié)論

本文設計并合成了一種新型的螺二芴類雙光子熒光探針，可以用于裸眼檢測ClO-.熒光強度與ClO-濃度存在較好的線性相關(guān)性，可以用于ClO-的定量檢測.探針對ClO-有很好的靈敏性和選擇性，具有較好的雙光子吸收性能，對環(huán)境和生物中ClO-的檢測以及在生物細胞雙光子熒光成像方面具有很好的應用前景.