李 鑫，李夢菡，余紅偉，武雅嫻,3，張 蘭，韓文炎

1. 中國農業(yè)科學院 茶葉研究所，浙江 杭州 310008；2. 建德市農業(yè)農村局，浙江 建德 230036；3. 河北農業(yè)大學 園藝學院，河北 保定 071000

茶樹[Camellia sinensis(L.) O. Ktze.]是多年生常綠喬木，具有喜溫畏寒的生長特性[1]。近年來，隨著全球氣候變化的不斷加劇，茶樹等園藝作物越來越容易遭受低溫凍害和高溫干旱等極端環(huán)境的影響。我國北方茶區(qū)冬季氣溫偏低，茶園易受凍害而出現越冬困難；南方茶區(qū)尤其是江南茶區(qū)，在春季常遭受“倒春寒”影響，給當地名優(yōu)茶的生產帶來較大影響[2]。近年有關茶樹遭受倒春寒危害的報道也在不斷增加。隨著早芽良種的培育、肥培管理水平的提高以及先進科學技術的推廣應用，茶葉發(fā)芽時間日趨提早，倒春寒對名優(yōu)茶生產的影響也日益嚴重[3]。茶樹是我國重要的經濟作物，低溫脅迫會嚴重影響茶葉的產量和品質?？梢?，探究茶樹低溫抗性調控的生理機制以及研發(fā)茶樹低溫抗性栽培技術是科研和生產中亟待解決的重要問題。

油菜素甾醇類化合物（Brassinosteroids，BRs）是從油菜的花粉中分離鑒定的一類新型植物激素[4]，在植物的生長發(fā)育調控中發(fā)揮著重要作用，對植物適應或抵抗逆境脅迫也具有重要作用[5]。目前，具有較高生物活性的油菜素內酯類似物表油菜素內酯（2,4-epibrassinolide，EBR）在農業(yè)生產上已廣泛應用[6]。近年來，已有較多研究對于EBR在改善植物逆境脅迫方面進行了探究。張愛敏等[7]用不同質量濃度EBR處理低溫脅迫下黃瓜種子，發(fā)現適當濃度EBR處理可提高黃瓜種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率及側根數等，減輕種子萌發(fā)和幼苗受到的低溫傷害。石玲等[8]發(fā)現EBR能調控杏果實采后的活性氧代謝，增強杏果實采后抗病性。Shu等[9]在研究低溫和弱光條件下外源EBR對番茄葉片的影響時發(fā)現，EBR可減輕低溫脅迫引起的對光合作用和氮代謝的有害影響，從而改善植物生長。李淑葉等[10]也發(fā)現，外源EBR可通過降低棉花幼苗的相對電導率、提高葉片光能捕獲能力及光合電子傳遞能力等緩解低溫對棉花光合作用的抑制。

綜上，外源噴施油菜素內酯為緩解茶樹的低溫脅迫狀況提供了新思路，我們前期的研究也探明了外源EBR對茶樹光合特性及耐熱性影響的生理機制[11-12]。然而，目前有關BRs誘導茶樹低溫抗性的生理機制尚不明確，有必要開展進一步研究。本研究以茶樹品種‘龍井43’為材料，通過外源EBR處理茶樹葉片，探究低溫脅迫下茶樹葉片過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子（O2-·）、茶多酚、丙二醛（MDA）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）等抗氧化酶活性的變化，并結合茶多酚生物合成中部分關鍵基因（PAL、CHI、C4H、CHS）的表達量分析，以解析外源表油菜素內酯誘導茶樹對低溫脅迫抗性的生理機制，為茶樹逆境栽培技術研發(fā)提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

供試茶樹品種選用‘龍井43’，系中國農業(yè)科學院茶葉研究所培育并推廣種植的茶樹優(yōu)質品種。選擇生長狀態(tài)一致、無病蟲害侵襲的三年生茶樹幼苗為實驗材料。用濃度為0.1 μmol/L的EBR（含0.3‰有機硅）噴施葉面，直至葉片滴水為止，以含相同濃度有機硅的清水進行噴施作為對照。

葉面噴施12 h后，將茶樹幼苗分別置于人工氣候培養(yǎng)箱內進行常溫處理（25℃）和低溫處理（-4℃）。兩個培養(yǎng)箱的其他環(huán)境因子設置相同，平均光強為600 μmol/m2·s，平均相對濕度控制為80%。

最終試驗分為4個處理：（1）對照（Control），即清水噴施處理后置于25℃常溫；（2）常溫下表油菜素內酯預處理（EBR），即在茶樹葉面均勻噴施EBR后置于25℃常溫；（3）單一低溫處理（Cold），即清水預處理后置于-4℃低溫；（4）表油菜素內酯和低溫的復合處理（EBR + Cold），即將葉面噴施EBR后的幼苗置于-4℃低溫。經人工氣候培養(yǎng)箱進行不同溫度處理30 min后，取從頂芽向下第三張葉片進行DAB（3,3'-二氨基聯苯胺）和NBT（氮藍四唑）染色；取一芽及半展葉用于基因表達分析；取一芽二葉稱重后置于液氮中用于其他生理指標的測定。每次測量設置3個生物學重復。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 H2O2和O2-·的定性檢測

H2O2的存在采用DAB染色法檢測，O2-·的存在采用NBT染色法檢測[13]，兩種染色液均現配現用。染色：將葉片用蒸餾水洗凈，取各組葉圓片分別置于染液中抽真空5 ～ 10 min，在25℃室溫下染色約5 h至葉片出現明顯斑點。脫色：將離心管中的染液倒掉，加入無水乙醇后沸水浴10 min。重復三次左右，直至葉圓片完全脫綠，用顯微鏡觀察拍照（Leica DM4000B &DFC425，萊卡公司，德國）。

1.2.2 茶多酚含量測定

采用酒石酸亞鐵比色法（GB/T 8313—2002）[14]。將茶樣磨成粉末后稱取0.1 g于10 mL離心管中，加入5 mL純水后置于100℃沸水浴中浸提5 min，中途振蕩一次使茶樣和水充分混勻。結束后立即置于冰水浴中快速冷卻，在4℃條件下12000 g離心10 min，取上清液用于茶多酚含量測定。吸取1 mL上清液于25 mL的容量瓶中，加入4 mL超純水和5 mL酒石酸亞鐵溶液，混勻后再加入pH 7.5的磷酸緩沖液至刻度，搖勻后測定D540吸光值，并根據標準曲線計算茶多酚含量。

1.2.3 MDA含量分析

參照Cakmak等[15]的方法進行測定。取0.3 g樣品加入提取液（50 mmol/L磷酸緩沖液，0.2 mmol/L EDTA和2% PVP）研磨后，離心20 min，取上清液待測。在1 mL上清液中加入3 mL TBA反應液，95℃水浴條件下保溫30 min，立即置于冰水浴中冷卻。然后在4℃環(huán)境下1500 g離心10 min，測定D532和D600的吸光值。

1.2.4 抗氧化酶活性測定

提取方法與上述MDA提取方法[15]相同。

超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定方法參照 Gi-annopolitis等[16]。酶液 50 μL 中加入3 mL 50 mmol/L 磷酸緩沖液（pH 7.8, 15 mmol/L甲 硫 氨 酸，2.0 μmol/L核 黃 素，65 μmol/L NBT和0.1 mmol/L EDTA），由緩沖液替代酶液作為空白管。在室溫和光強100 μmol/m·s條件下照光10 min，置于暗下終止反應，測定D560吸光值。

愈創(chuàng)木酚過氧化物酶（G-POD）參照Cakmak等[15]的方法測定。酶液100 μL中加入1700 μL 25 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.0, 0.1 mmol/L EDTA）、100 μL 20 mmol/L 過氧化氫和100 μL 1%愈創(chuàng)木酚，在25℃條件下反應，分析D470的動力學變化。

過氧化氫酶（CAT）活性的測定參照Cakmak等[15]的方法并略作改進。酶液100 μL中加入1700 μL 25 mmol/L 磷酸緩沖液（pH7.0, 0.1 mmol/L EDTA）和200 μL 10 mmol/L過氧化氫。在25℃條件下反應，分析D470的動力學變化。

抗壞血酸過氧化物酶（APX）活力的測定參照Nakano等[17]的方法并略作改進。吸取酶液 100 μL，加入 1700 μL 25mmol/L PBS（pH 7.0，含 0.1 mmol/L EDTA）、100 μL 20 mmol/L H2O2及100 μL 5 mmol/L ASA（抗壞血酸），充分混合后測定40 s內D290的動力學變化（消光系數為2.8 mmol/L·cm）。

1.2.5 qRT-PCR（實時熒光定量PCR）分析

茶樹葉片總RNA提取采用Invitrogen TRIzol?試劑盒按說明書方法提取，RNA濃度采用NanoDrop?ND-1000分光光度計進行測定，利用變性瓊脂糖凝膠電泳進行RNA質量的檢測，總RNA經反轉錄為cDNA后，qRT-PCR使用SYBR?Premix EX Taq? II（Tli RNaseH Plus）熒光定量試劑盒，并利用StepOnePlus? Real-Time PCR System進行定量檢測。反應程序設置如下：在94℃預變性2 min；98℃條件下變性10 s，56℃退火30 s后在68℃延伸2 min，總共35個循環(huán)；在72℃條件下延伸10 min。CsPTB作為內參基因，引物設計見表1。PCR循環(huán)完成后的熔解曲線證實PCR產物均為單一性物質，并根據Livak等[18]的方法計算基因表達量。

表1 qRT-PCR引物設計Table 1 Primers used for real time RT-PCR

1.3 數據分析與處理

采用Microsoft Excel 2019及SAS 9.0對試驗數據進行統(tǒng)計分析，用LSD法進行差異顯著性檢驗，用Origin Pro 8.0進行作圖。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫下外源EBR預處理對茶樹葉片中活性氧自由基的影響

低溫脅迫下，植物體內會產生多種活性氧自由基。本試驗采用DAB及NBT染色法，定性檢測了外源EBR處理后茶樹葉片內H2O2和O2-·含量的變化。由圖1可見，與對照相比，外源EBR常溫處理（EBR）后DAB及NBT染色情況無明顯變化，而低溫處理（Cold）后，DAB被氧化生成的暗棕色顆粒顯著增多，NBT被氧化出現較大藍色斑點，表明受到低溫脅迫后葉片中H2O2和O2-·會大量積累。而與單一低溫處理（Cold）相比，經外源EBR預處理后低溫脅迫誘導的茶樹葉片內DAB染色生成的暗棕色面積顯著減小，NBT染色生成的藍色斑點面積也明顯縮小。上述現象說明，低溫脅迫會使茶樹葉片中的H2O2及O2-·含量大量增加，而外源EBR預處理則能顯著降低活性氧自由基的積累，緩解茶樹低溫脅迫下的氧化損傷情況。

圖1 低溫脅迫下外源EBR預處理對茶樹葉片DAB及NBT染色的影響Figure 1 The effect of EBR treatment on DAB and NBT staining in tea leaves under cold stress

2.2 外源EBR對低溫脅迫下茶樹葉片茶多酚含量的影響

茶多酚不僅是茶葉中重要的滋味物質，還具有很強的抗氧化性。張建忠等[19]發(fā)現，茶多酚的抗衰老、抗輻射、抗菌等功能與其清除自由基的抗氧化效果密切相關。由圖2可知，與對照相比，外源EBR處理（EBR）及單一低溫處理（Cold）后，茶樹葉片中的茶多酚含量均無顯著差異。然而，經外源EBR預處理后進行低溫處理（Cold + EBR），茶樹葉片內茶多酚含量顯著提高（P＜0.05），較單一低溫處理相比提高13.37%（圖2）。由此可見，外源EBR處理能顯著增加低溫脅迫下茶樹葉片中的茶多酚含量，提高茶樹的抗氧化能力。

圖2 EBR對低溫脅迫下茶樹葉片茶多酚含量的影響Figure 2 The effect of EBR treatment on the tea polyphenols content in tea leaves under cold stress

2.3 低溫脅迫下外源EBR預處理對茶樹葉片中MDA含量的影響

由于低溫脅迫下植物細胞膜上不飽和脂肪酸發(fā)生了膜脂過氧化過程，從而使細胞膜通透性加大，膜相分離產生大量丙二醛（MDA）。在對植物低溫抗性的生理研究中，細胞內的MDA含量常作為衡量植物低溫抗性強弱的指標之一，MDA含量越高，說明細胞膜受到的損傷越嚴重[20]。由圖3可見，與對照相比，外源EBR常溫處理（EBR）后的茶樹葉片內MDA含量顯著降低了15.65%（P＜0.05），但在單一低溫處理（Cold）后MDA含量又比對照明顯提高了19.49%（P＜0.05）。然而，與單一低溫處理（Cold）相比，經外源EBR和低溫前后復合處理（Cold + EBR）的茶樹葉片內的MDA含量顯著減少（P＜0.05），降幅達21.79%（圖3）。因此，外源EBR預處理能夠減少低溫脅迫導致的MDA含量過度積累，從而有效緩解膜脂過氧化過程對細胞膜的損傷。

圖3 EBR對低溫脅迫下茶樹葉片中MDA含量的影響Figure 3 The effect of EBR treatment on the MDA content in tea leaves under cold stress

2.4 低溫脅迫下外源EBR預處理對茶樹葉片中抗氧化酶活性的影響

本研究對抗氧化酶系統(tǒng)中的4種關鍵酶的活性進行了研究，即超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）及抗壞血酸過氧化物酶（APX）。由圖4B和圖4D可知，外源EBR常溫處理（EBR）可顯著提高細胞內POD和APX活性（P＜0.05），與對照相比分別提高了15.00%和14.08%，而常溫處理（EBR）對SOD和CAT活性的提高則不顯著。經低溫脅迫（Cold）后，與對照相比，茶樹葉片內SOD的活性顯著降低了13.16%（P＜0.05），而POD、CAT、APX活性稍有下降但響應不顯著。但與單一低溫處理相比，經外源EBR和低溫脅迫復合處理（Cold + EBR）后茶樹葉片中SOD活性提高了8.41%，但未達顯著水平；而APX、POD、CAT活性則顯著提高（P＜0.05），分別提高了27.85%、35.32%和124.94%，其中對CAT活性的提高最為顯著?？梢?，在茶樹受到低溫脅迫后外源EBR預處理能夠在不同程度提高茶樹葉片中抗氧化酶活性，從而增強抗氧化酶系統(tǒng)對活性氧自由基的清除能力。

圖4 低溫脅迫下外源EBR預處理對茶樹葉片中抗氧化酶活性的影響Figure 4 The effect of EBR treatment on antioxidant enzymes activity in tea leaves under cold stress

2.5 低溫脅迫下外源EBR預處理對茶樹葉片茶多酚合成基因表達量的影響

茶多酚中的主要成員類黃酮是大多數氧自由基的清除劑，能減少MDA的產生[21]。在類黃酮合成途徑中，苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸羧化酶（C4H）、查爾酮異構酶（CHI）、查爾酮合成酶（CHS）是研究較多的關鍵酶[22]。在本試驗中，茶樹經外源EBR常溫處理（EBR）后，C4H和CHS的基因表達量顯著上調（P＜0.05），與對照相比分別上調了24.32%和166.75%，而PAL和CHI的表達量略有上調但不顯著（圖5）。在受到低溫脅迫（Cold）后，茶樹葉片中C4H、CHS、CHI的表達量無顯著變化，而PAL的表達量顯著上調（P＜0.05），比對照上調了78.24%。與低溫脅迫單獨處理（Cold）相比，經外源EBR和低溫脅迫復合處理（Cold + EBR）后PAL、CHI、CHS的表達量顯著上調（P＜0.05），分別上調了56.10%、98.27%和448.45%，僅有C4H表達量的上調未達顯著水平?？梢?，外源EBR能調控茶多酚合成關鍵基因的表達，不同程度地上調了PAL、CHI、CHS和C4H的表達量，從而提高茶樹葉片中茶多酚含量。

圖5 低溫脅迫下外源EBR預處理對茶樹葉片中茶多酚合成基因表達量的影響Figure 5 The effects of EBR treatment on the gene expression of tea polyphenols synthesis in tea leaves under cold stress

3 討論

茶樹生長的適宜溫度為20℃ ～ 25℃，當溫度低于15℃時其新梢生長減緩；而當溫度低于-6℃時，茶樹將會嚴重受害[23]。低溫脅迫可通過誘導膜脂過氧化等過程影響植物的逆境響應。在非逆境條件下植物體內自由基的產生與清除處于動態(tài)平衡，而在逆境條件下這種平衡會被打破，大量自由基的產生會使植物受到損傷[20]。油菜素內酯（BR）被認為可以提高植物對低溫脅迫的耐受性。在對辣椒[24]、棉花[25]、黃瓜[7]等園藝作物的研究中已發(fā)現，BRs能夠顯著增加植物抗氧化物酶活性及抗氧化物質的含量，從而提高作物的抗逆性。本研究的結果表明，低溫處理后，茶樹葉片細胞內H2O2和O2-·含量明顯提高；而在外源EBR預處理后，低溫脅迫下茶樹葉片細胞內H2O2和O2-·含量顯著減少（圖1）。這說明外源EBR預處理能有效清除低溫脅迫下茶樹細胞內活性氧自由基的累積，減輕活性氧（ROS）帶來的氧化脅迫。同時，低溫下ROS積累對生物膜造成的損傷還會啟動脂質過氧化反應，使膜內脂雙分子層中含有的不飽和脂肪酸鏈降解，從而破壞了細胞膜的完整性，使過氧化產物MDA積累，電解質外滲，嚴重時可造成細胞死亡[26]。王英姿等[27]的研究也發(fā)現H2O2和O2-·的積累可能激發(fā)了MDA的大量產生。在本研究中，外源EBR處理能顯著降低低溫脅迫后茶樹葉片細胞內過度積累的MDA含量（圖3）。這表明，在EBR預處理的條件下低溫脅迫導致的茶樹葉片細胞膜受到的ROS損傷得到緩解，從而抑制茶樹葉片的膜脂過氧化過程。該結果與辣椒[24]和葡萄[27]等方面的相關研究結論一致，即低溫脅迫下EBR預處理能夠保護作物細胞膜結構的完整性。

低溫脅迫下植物體內活性氧自由基的積累受多方面因素調控，主要包括抗氧化酶和非酶類抗氧化物質，其中抗氧化物酶在保護作物免受ROS積累導致的氧化脅迫中發(fā)揮著重要作用[26]。在本研究中，茶樹遭受低溫脅迫后抗氧化物酶活性受到不同程度的抑制（圖4），且SOD活性更易受到低溫抑制，對超氧陰離子的清除能力明顯降低，導致茶樹葉片內ROS大量積累。而低溫下外源EBR預處理后茶樹葉片中抗氧化物酶活性均得到提升，POD、CAT、APX的活性顯著增強，且CAT活性的增幅高達124.94%，說明葉片細胞對H2O2的清除能力大幅度提高。這與高山離子芥[28]和甘薯[29]等作物中的研究結論基本一致。這說明外源EBR能夠通過增強茶樹的抗氧化酶活性來清除低溫脅迫下細胞內過度積累的ROS，有效地緩解低溫脅迫對茶樹造成的氧化脅迫。

在茶樹葉片中，類黃酮等多酚類物質也發(fā)揮著重要的抗氧化作用，其抗氧化能力是人工合成抗氧化劑的4 ～ 10倍，且在茶葉中的含量遠超其他植物。張建忠等研究發(fā)現，茶多酚具有清除自由基的抗氧化效果[19]。本研究結果表明，低溫脅迫下外源EBR預處理能顯著提高茶樹葉片中茶多酚的含量（圖2）?；虮磉_數據顯示，低溫脅迫下外源EBR預處理能誘導PAL、CHI、CHS的表達量顯著上調，且CHS的表達量增幅高達448.45%。在類黃酮合成代謝的早期階段，PAL、C4H、4CL等關鍵酶催化苯丙氨酸反應生成香豆酰-CoA，CHS則將香豆酰-CoA和丙二酰-CoA共同催化轉變?yōu)椴闋柾蟛闋柾籆HI催化生成的柚皮素是所有類黃酮物質合成的直接前體[22]。因此，低溫脅迫下外源EBR預處理能顯著上調類黃酮合成代謝關鍵基因的表達量，促進了類黃酮含量的提高，從而進一步提升了茶樹在低溫下的抗氧化能力。

此外，研究還發(fā)現，在正常溫度下噴施EBR對茶樹的抗氧化物酶活性、茶多酚含量的增幅均明顯低于在低溫脅迫下噴施EBR的效果。這說明EBR可能在維持ROS的形成與消除的動態(tài)平衡中擔任著重要角色，這與楊萍等[24]的研究結果一致。然而，在低溫脅迫下外源EBR調控茶樹抗氧化酶活性和類黃酮合成相關基因表達的分子機制及其信號途徑，還有待進一步研究。

綜上，本研究表明外源EBR能夠有效緩解低溫脅迫對茶樹造成的氧化脅迫。這主要是由于外源EBR預處理能夠顯著增強茶樹葉片中抗氧化酶系統(tǒng)（SOD、POD、CAT、APX）的活性，從而提高茶樹對活性氧自由基的清除能力，降低MDA的含量，保護細胞膜的完整性，在一定程度上緩解了低溫脅迫下活性氧對茶樹細胞膜的損傷。此外，本研究還發(fā)現，外源EBR預處理還能通過誘導類黃酮合成途徑中關鍵基因（PAL、CHI、CHS、C4H）表達量的上調，促進葉片中茶多酚等抗氧化物質的積累，從而增強了低溫下茶樹的抗氧化能力。因此，外源EBR預處理能夠通過平衡茶樹葉片中活性氧自由基的產生與清除，最終有效緩解低溫脅迫對茶樹的傷害，增強茶樹對低溫脅迫的耐受性。