張夢(mèng)媛，王千一，蒲雪麗，妥彥峰，牟光慶，姜淑娟

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連 116034）

合成包裝材料造成的環(huán)境污染促使了新型環(huán)保材料的發(fā)展，生物聚合物薄膜和涂層因其可生物降解性而受到越來(lái)越多的重視[1]?？墒承员∧ぷ鳛槭称钒b材料，可以延緩食品劣變，從而提高食品質(zhì)量，延長(zhǎng)保質(zhì)期[2]。

乳清濃縮蛋白（WPC）主要通過(guò)氫鍵、二硫鍵與其他分子的相互作用來(lái)維持其特征結(jié)構(gòu)[3]，具有良好的成膜性能、優(yōu)異的阻氣性能和兩親性等功能特性，已成為一種很有前途的生物基聚合物。卵清蛋白（EWP）營(yíng)養(yǎng)豐富具有很好的成膜性，形成的膜具有較好的透光性[4]。但因蛋白基膜的機(jī)械性能和阻隔性能較差，常用化學(xué)[5]、物理[6]、酶法[7]改性。趙曉彤等[8]以大豆分離蛋白為成膜材料，添加聚乙烯醇和納米纖維素，輔以超聲處理制備的復(fù)合膜阻隔性能和機(jī)械性能提高。Zhang等[9]通過(guò)美拉德反應(yīng)將木糖糖基化，制備了面筋/玉米醇溶蛋白納米纖維膜，結(jié)果表明糖化后的復(fù)合膜由于分子間的纏結(jié)和高分子鏈之間的相互作用增強(qiáng)，水蒸氣透過(guò)率降低，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加致密。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（TG）能誘導(dǎo)谷氨酰胺的酰胺基和賴(lài)氨酸的氨基發(fā)生共價(jià)交聯(lián)。Fernandez-Bats等[10]以豌豆蛋白為原料，經(jīng)TG酶交聯(lián)，添加二氧化硅納米顆粒制備復(fù)合膜，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加TG酶后提高了薄膜對(duì)氣體和水蒸氣的阻隔作用。Rossi等[11]添加TG酶制備乳清蛋白/果膠復(fù)合膜，發(fā)現(xiàn)添加TG酶后可有效防止鮮切蘋(píng)果和馬鈴薯在貯藏10 d內(nèi)腐爛。

課題組前期研究中以WPC和EWP為成膜基質(zhì)、添加TG酶（5 U/g蛋白）處理，成功制備出性能較好的WPC/EWP復(fù)合膜。因此，本研究進(jìn)一步深入研究WPC和EWP質(zhì)量比、膜液pH、甘油添加量對(duì)WPC/EWP復(fù)合膜的機(jī)械性能、阻隔性能和微觀結(jié)構(gòu)的影響，以期為WPC/EWP復(fù)合膜的實(shí)際開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論與技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳清濃縮蛋白 食品級(jí)，德國(guó)米萊乳品公司；蛋清蛋白 食品級(jí)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶 食品級(jí)，江蘇一鳴生物制品有限公司；甘油分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

V-100D可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；TA-XT plus質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó) Stable Micro System公司；JSM-7800F場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡日本電子株式會(huì)社；Spectrum10傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)Perkin Elmer公司；SL200KB接觸角分析儀 美國(guó)Kino公司；Binder KBF115恒溫恒濕箱德國(guó)Binder有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膜制備方法 用WPC和EWP為基準(zhǔn)，按質(zhì)量比（g/g）混合后使用超純水進(jìn)行制備，使WPC和EWP在水中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%，并磁力攪拌至完全溶解，在4 ℃冰箱放置過(guò)夜。溶液放置室溫后將5 U/g蛋白的TG酶添加到混合液中，在50 ℃下孵育2 h。反應(yīng)后，80 ℃水浴10 min并冷卻至室溫[12]。以蛋白質(zhì)質(zhì)量為基準(zhǔn)，在成膜溶液中添加甘油作增塑劑，在25 ℃下磁力攪拌1 h后，量取9 mL溶液立即澆鑄在塑料平皿（90 mm×90 mm）上，于30 ℃、相對(duì)濕度為50%的恒溫恒濕箱中烘干成膜12 h。揭膜后在25 ℃、相對(duì)濕度50%條件下回軟24 h，備用。

1.2.2 不同底物質(zhì)量比復(fù)合膜的制備 改變WPC和 EWP 質(zhì)量比（1:0、3:1、1:1、1:3、0:1），將成膜液pH調(diào)到7，以蛋白質(zhì)量計(jì)添加45%的甘油，其余條件不變，按照1.2.1的方法制備復(fù)合膜。

1.2.3 不同膜液pH復(fù)合膜的制備 以WPC和EWP質(zhì)量比為1:3（g/g）制備膜液，將膜液調(diào)為不同的pH（6、7、8、9、10）以蛋白質(zhì)量計(jì)添加 45% 的甘油，其余條件不變，按照1.2.1的方法制備復(fù)合膜。

1.2.4 不同甘油添加量復(fù)合膜的制備 以WPC和EWP質(zhì)量比為1:3（g/g）制備膜液，將膜液調(diào)為8，添加不同的甘油添加量（25%、35%、45%、55%、65%）（以蛋白質(zhì)量計(jì)），其余條件不變，按照1.2.1的方法制備復(fù)合膜。

1.3 性能測(cè)定方法

1.3.1 膜厚度 使用靈敏度為0.001 mm的數(shù)顯千分尺隨機(jī)確定薄膜厚度[13]。在薄膜表面隨機(jī)取5個(gè)測(cè)量薄膜厚度，最終厚度被視為5次測(cè)量的平均值。

1.3.2 掃描電子顯微鏡 用掃描電子顯微鏡（SEM）在20 kV加速電壓下觀察了薄膜的表面結(jié)構(gòu)[12]。

1.3.3 傅里葉變換紅外光譜 在4000～400 cm-1范圍內(nèi)使用衰減全反射紅外光譜對(duì)膜樣品進(jìn)行掃描[14]，光譜在4 cm-1分辨率下獲得。

1.3.4 機(jī)械性能 薄膜的拉伸強(qiáng)度（TS）和斷裂伸長(zhǎng)率（EAB）通過(guò)一些修改[15]來(lái)適應(yīng)樣品。采用TAXT Plus質(zhì)地分析儀的A/TG探針?lè)治?。膜被切割?0 mm長(zhǎng)和10 mm寬的樣品進(jìn)行測(cè)試。

1.3.5 透光率 根據(jù)Jiang等[12]的研究結(jié)果，采用比色法測(cè)定薄膜的透光率。將膜裁剪成比色皿規(guī)格（1.0×4.0 cm）的條狀，緊貼在比色皿內(nèi)側(cè)，用空比色皿作對(duì)照，在600 nm下測(cè)定膜的透光率。

1.3.6 水蒸氣透過(guò)率 對(duì)Jiang等[16]的方法進(jìn)行修改后，在25 ℃、50% RH的恒溫恒濕箱中測(cè)量薄膜的水蒸氣透過(guò)率（WVP），每2 h記錄稱(chēng)量瓶重量的變化，時(shí)長(zhǎng)10 h，結(jié)果用g·s-1m-1Pa-1表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每項(xiàng)測(cè)定至少重復(fù)三次。數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 25軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA）和用Duncan's顯著性分析，用Origin 8.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 WPC和EWP質(zhì)量比對(duì)復(fù)合膜結(jié)構(gòu)和性能的影響

薄膜的微觀結(jié)構(gòu)以及結(jié)構(gòu)中可能存在的間隙和裂紋采用掃描電子顯微鏡技術(shù)研究。五種膜的表面形態(tài)圖如圖1所示，從圖1中可以看出，WPC單一膜表面有較多孔隙和少量裂縫產(chǎn)生，EWP單一膜有少量聚集體，而當(dāng)WPC和EWP質(zhì)量比為1:1和1:3時(shí)，WPC/EWP復(fù)合膜的表面比 WPC單一膜和EWP單一膜表面光滑且沒(méi)有縫隙，結(jié)構(gòu)致密，表明WPC和EWP具有很好的相容性，能夠有效阻止水蒸氣的透過(guò)。在Dong等[17]的研究中發(fā)現(xiàn)，利用蛋清蛋白對(duì)小麥面筋蛋白改性后，復(fù)合膜的表面比小麥面筋單一膜光滑。

圖1 不同底物質(zhì)量比復(fù)合膜的表面結(jié)構(gòu)圖（1000×）Fig.1 Surface structure of composite films with different substrate mass ratios (1000×)

紅外光譜對(duì)薄膜的理化性質(zhì)有直接影響，反映了薄膜中聚合物之間的相互作用，如圖2所示。出現(xiàn)在3300～3200 cm-1的峰屬于O-H的伸縮振動(dòng)，受分子內(nèi)和分子間氫鍵的影響。在2950～2900 cm-1的峰和C-H的伸縮振動(dòng)有關(guān)。在1700～1600 cm-1范圍內(nèi)的峰是酰胺1帶中C=O的伸縮振動(dòng)，和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)相關(guān)。在1550～1500 cm-1范圍內(nèi)的峰是酰胺Ⅱ帶中N-H的彎曲振動(dòng)[18]。與WPC單一膜相比，隨著EWP的加入，WPC/EWP膜的O-H帶、CH帶及酰胺Ⅰ帶的吸收峰向高波數(shù)移動(dòng)，而酰胺Ⅱ帶的吸收峰向低波數(shù)移動(dòng)。這說(shuō)明振動(dòng)基團(tuán)所需的能量增加，復(fù)合膜基團(tuán)之間更加穩(wěn)定和相容[19]。和復(fù)合膜抗拉強(qiáng)度增加的結(jié)果一致，膜的表面結(jié)構(gòu)也更加致密。從圖2中可以看出紅外光譜沒(méi)有檢測(cè)到復(fù)合膜官能團(tuán)的顯著變化，這支持了之前的觀點(diǎn)，非共價(jià)相互作用（例如氫鍵和范德華力）被認(rèn)為是膜組分連接的主要驅(qū)動(dòng)力[20]。

圖2 不同底物質(zhì)量比復(fù)合膜的紅外結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Infrared structure of composite films with different substrate mass ratios

表1為WPC和EWP質(zhì)量比對(duì)復(fù)合膜厚度、水蒸氣透過(guò)率、透光率、抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率的影響。在可食膜的制備過(guò)程中，成膜材料的質(zhì)量比對(duì)復(fù)合膜的厚度有較大影響[21]。如表1所示，隨著EWP質(zhì)量的增加，各組之間膜的厚度無(wú)明顯的變化規(guī)律，但隨著EWP的增加復(fù)合膜的厚度略微下降。隨著EWP含量的增加，WPC/EWP復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率均呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)。當(dāng)WPC和EWP質(zhì)量比為1:3時(shí)，WPC/EWP復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度為3.46 MPa，斷裂伸長(zhǎng)率為129.87%，達(dá)到最大值（P＜0.05）。這是由于加熱使蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的二硫鍵、氫鍵等暴露出來(lái)[22]，在TG酶的催化作用下，蛋白鏈間發(fā)生更強(qiáng)烈的作用，分子間作用增強(qiáng)，形成了更加致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致了WPC/EWP復(fù)合膜抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率的增加。Huang等[23]研究發(fā)現(xiàn)，隨著蛋清蛋白質(zhì)量的增加，蛋清蛋白/κ-卡拉膠的抗拉強(qiáng)度下降，斷裂伸長(zhǎng)率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，原因是蛋清蛋白的加入改變了復(fù)合膜的空間結(jié)構(gòu)[24]。從表1中可以看出，與 WPC和EWP單一膜相比，復(fù)合膜的透光率達(dá)到最大值為72.2%（P＜0.05），說(shuō)明 WPC和 EWP在比例為 1:3時(shí)相容性較好。

表1 WPC/EWP質(zhì)量比對(duì)復(fù)合膜阻隔性能和機(jī)械性能的影響Table 1 Effects of WPC/EWP mass ratio on barrier and mechanical properties of composite films

膜的水蒸氣透過(guò)率隨著EWP質(zhì)量的增加呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，且在WPC和EWP質(zhì)量比為1:3時(shí)，復(fù)合膜的水蒸氣透過(guò)率達(dá)到最小值（2.72×10-10/g·s-1m-1Pa-1）（P＜0.05）。原因可能是隨著EWP含量的增加，WPC和EWP之間形成了靜電相互作用，促進(jìn)了電荷的抵消[25]。當(dāng)WPC和EWP質(zhì)量比為1:3時(shí)，由上述電鏡圖可知WPC/EWP復(fù)合膜結(jié)構(gòu)致密，表現(xiàn)出更好的疏水特性，進(jìn)而限制了聚合物鏈的遷移降低了水蒸氣透過(guò)率。在Tavares等[25]研究中發(fā)現(xiàn)，在乳清分離蛋白中加入殼聚糖后，復(fù)合膜的水蒸氣透過(guò)率降低。

2.2 膜液pH對(duì)WPC/EWP復(fù)合膜結(jié)構(gòu)和性能的影響

圖3是不同成膜液pH對(duì)WPC/EWP復(fù)合膜表面結(jié)構(gòu)的影響。從圖中可以看出，當(dāng)成膜液pH為6時(shí)，復(fù)合膜表面有較大聚集體產(chǎn)生且復(fù)合膜表面不光滑，原因可能是此pH接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)[26]，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性嚴(yán)重，進(jìn)而在膜干燥過(guò)程中產(chǎn)生了較大的聚集體。隨著成膜液pH的增加，WPC/EWP復(fù)合膜表面的聚集體減少且逐漸光滑，當(dāng)pH為9時(shí)，WPC/EWP復(fù)合膜的表面最光滑且無(wú)孔隙。

圖3 不同成膜液pH復(fù)合膜的表面結(jié)構(gòu)圖（1000×）Fig.3 Surface structure of composite films with different pH of film-forming solutions (1000×)

成膜液的pH可以影響蛋白質(zhì)表面電荷進(jìn)而影響了蛋白質(zhì)分子之間的相互作用以及膜的性能[27]。表2是成膜液pH對(duì)WPC/EWP復(fù)合膜厚度、水蒸氣透過(guò)率、透光率、抗拉強(qiáng)度及斷裂伸長(zhǎng)率的影響。

從表2可以看出，成膜液pH對(duì)WPC/EWP復(fù)合膜的厚度影響較小，但在成膜液pH為8時(shí)，復(fù)合膜的厚度達(dá)到最小值為0.167 mm。WPC/EWP復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率隨著成膜液pH的增加呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，當(dāng)成膜液pH為8時(shí)，WPC/EWP復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度為1.88 MPa，斷裂伸長(zhǎng)率為182.86%。當(dāng)pH增加到8后，蛋白質(zhì)的電荷發(fā)生改變，蛋白質(zhì)暴露出更多的疏水或巰基等活性基團(tuán)[27]，使WPC和EWP的相互作用增大。然而成膜液pH繼續(xù)增大到9和10后，由于蛋白質(zhì)的堿水解作用和TG酶的活性下降，破壞了復(fù)合膜的致密結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)疏散，進(jìn)而造成了抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率的降低以及水蒸氣透過(guò)率的增大。

由表2可知，WPC/EWP復(fù)合膜的透光率隨成膜液pH的增加沒(méi)有明顯變化趨勢(shì)，但當(dāng)pH為8時(shí)，復(fù)合膜的透光率為73.0%為最大值（P＜0.05），表明WPC和EWP具有較好的相容性。在張軒等[26]的研究中發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果。WPC/EWP復(fù)合膜的水蒸氣透過(guò)率隨著pH的增加呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢(shì)，當(dāng)成膜液pH為8時(shí)，WPC/EWP復(fù)合膜的水蒸氣透過(guò)率最小（2.99×10-10g·s-1m-1Pa-1）。說(shuō)明在此 pH，WPC和EWP具有較強(qiáng)的相互作用，形成了致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，有效阻止了水分子的滲透。然而在辛穎等[28]的研究中發(fā)現(xiàn)，成膜液pH對(duì)乳清蛋白膜的水蒸氣透過(guò)率沒(méi)有顯著影響，但透氧率呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢(shì)。

表2 pH對(duì)WPC/EWP復(fù)合膜阻隔性能、機(jī)械性能的影響Table 2 Influence of pH on barrier and mechanical properties of WPC/EWP composite films

2.3 甘油添加量對(duì)復(fù)合膜性能的影響

在增塑劑存在的情況下，蛋白質(zhì)的熱處理會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的展開(kāi)、不可逆變性和相互作用，形成蛋白質(zhì)和增塑劑的復(fù)雜固體網(wǎng)絡(luò)[29]。由于蛋白質(zhì)分子鍵的剛性作用，膜較脆，常添加甘油來(lái)改變膜的特性。從表3可以看出，WPC/EWP復(fù)合膜的厚度隨著甘油添加量的增加呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)，而WPC/EWP復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度隨著甘油添加量的增加由2.65 MPa下降至0.66 MPa，而斷裂伸長(zhǎng)率呈現(xiàn)一個(gè)增加的趨勢(shì)，當(dāng)甘油添加量為55%時(shí)，復(fù)合膜的斷裂伸長(zhǎng)率達(dá)到185.09%。甘油添加到大分子聚合物中，形成氫鍵，減少分子內(nèi)部的氫鍵作用，同時(shí)削弱了蛋白質(zhì)分子間的范德華力，分子鏈之間的空隙增加，軟化了復(fù)合膜的剛性結(jié)構(gòu)，柔韌性增加進(jìn)而使膜的斷裂伸長(zhǎng)率增加[30]。在制備條件對(duì)大豆分離蛋白-淀粉復(fù)合膜機(jī)械性能的影響中發(fā)現(xiàn)了相似的趨勢(shì)[31]。復(fù)合膜的透光率隨著甘油添加量的增加呈下降趨勢(shì)，在Huntrakul等[32]的研究中發(fā)現(xiàn)添加甘油作為增塑劑的膜有較低的透光率。

由表3可知，水蒸氣透過(guò)率隨甘油添加量的增加呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)，這是由于添加甘油后，成膜基質(zhì)內(nèi)的分子變得比較柔軟，分子內(nèi)非結(jié)晶區(qū)增多，自由度變大，導(dǎo)致水蒸氣容易透過(guò)薄膜。當(dāng)甘油添加到成膜液中時(shí)，破壞了大分子之間的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致WPC和EWP之間的相互作用降低，分子間間隙變大造成了水蒸氣透過(guò)率的增加[30]。在不同增塑劑對(duì)大豆分離蛋白膜透氣性的影響中發(fā)現(xiàn)，隨著甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加透氣性增加[33]。

表3 甘油添加量對(duì)WPC/EWP復(fù)合膜阻隔性能、機(jī)械性能的影響Table 3 Effects of glycerin addition on barrier properties and mechanical properties of WPC/EWP composite films

綜合考慮WPC/EWP復(fù)合膜的厚度、水蒸氣透過(guò)率及機(jī)械性能和膜的形態(tài)，選擇甘油添加量為35%較為合適。

3 結(jié)論

本文以WPC和EWP為成膜基質(zhì)、甘油為增塑劑、TG酶作為交聯(lián)劑進(jìn)行WPC/EWP復(fù)合膜的制備與性能研究，探明了WPC和EWP質(zhì)量比、成膜液pH、及甘油添加量對(duì)膜性能的影響。研究表明WPC/EWP復(fù)合膜的適宜成膜條件為WPC/EWP質(zhì)量比1:3，成膜液pH8，甘油添加量35%，在適宜制備條件下WPC/EWP復(fù)合膜結(jié)構(gòu)致密、WPC和EWP之間形成了靜電相互作用，具有良好的機(jī)械性能和阻隔性能，顯示出開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛能。本研究為WPC/EWP復(fù)合膜的實(shí)際開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了理論指導(dǎo)，在后續(xù)研究工作中應(yīng)進(jìn)一步深入研究該復(fù)合膜的在食品包裝方面的適宜途徑和實(shí)際應(yīng)用性能。